Name: In vitro Método para Estudo de Diferenças Sexuais em Células Caliciformes Conjuntivais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Aprenda a cultura primária de células caliciformes conjuntivais humanas para estudar diferenças sexuais na saúde ocular. Este método elimina hormônios exógenos, permitindo controle preciso dos níveis hormonais sem afetar a funcionalidade celular.

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O trabalho é financiado pelo National Eye Institute Grant EY019470 (D.A.D).

Todo tecido humano foi doado ao banco de olhos com consentimento prévio informado e autorização do doador para uso em pesquisas científicas. O uso do tecido conjuntival humano foi revisado pelo Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee e determinado como isento e não atendendo à definição de pesquisa com seres humanos.
1. Cultura primária de células caliciformes humanas
<ol><li>Do banco de olhos, obtém-se tecido conjuntival humano16.</li>
	<li>Preparar o meio de cultura, meio de cultura RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 2 mM de glutamina, 2 mM de aminoácidos não essenciais (NEAA), 2 mM de piruvato de sódio, 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina e 2 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES).</li>
	<li>Realizar cultura de células primárias conforme descrito abaixo.<ol><li>Pique o tecido em pedaços de 1 mm 3 com bisturi estéril e semente em placas de cultura em uma capelade cultura. Semeando quatro pedaços em cada poço de uma placa de 6 poços, em 1 mL de meio RPMI completo. Embora a orientação da peça de tecido não afete o crescimento celular, certifique-se de que as peças aderem à placa de cultura para garantir o crescimento usando a lâmina de bisturi.</li>
		<li>Colocar os pedaços de tecido na incubadora contendo 95% de ar e 5% de CO2 a 37 °C. Atualizar o mesmo meio de cultura a cada dois dias até que as células caliciformes atinjam 70%-80% de confluência em aproximadamente 14 dias. Remova o tampão de tecido aproximadamente 72 h após a semeadura. NOTA: O epitélio conjuntival humano contém principalmente células escamosas estratificadas e células caliciformes. RPMI é um meio seletivo para células caliciformes. Raramente em cultura de CGC humano, os fibroblastos podem crescer por volta do 7º dia. O método de purificação da cultura foi descrito em publicação anterior 22.</li>
		<li>Verificar a pureza da cultura de GC usando microscopia de imunofluorescência (IFM) visando citoqueratina (CK)7 e lectina-1 de Helix pomatia (HPA-1)22 seguindo o método padrão de IFM descrito em19; veja resultados representativos.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Passagem das células caliciformes da conjuntiva humana e preparação experimental
<ol><li>Enxaguar as células com PBS (pH = 7,4) e desprender as células com tripsinização usando tripsina 0,05% em EDTA 1x. Observe as células a cada minuto sob um microscópio. Uma vez que as células se desprendem do fundo, desative a tripsina usando mídia RPMI completa.</li>
	<li>Centrifugar as células a 150 × g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Ressuspenda o pellet de células no meio de cultura RPMI completo e resemeie em placas de cultura com fundo de vidro para medição de [Ca2+]i . O volume total do meio é de 300 μL por prato. Mantenha a mídia no centro da parte de vidro do prato.</li>
	<li>Eliminação de hormônios em meios de cultura: O meio de cultura pode conter hormônios sexuais, especialmente o SFB. Como o vermelho de fenol contido no RPMI-1640 tem atividade estrogênica 23,24, substitua o meio RPMI pelo meio RPMI livre de vermelho fenol e ajuste o pH para 7,45 usando tiras de pH após o preparo do meio completo. O HEPES contido no meio completo mantém o pH em uma faixa relativamente pequena.</li>
</ol>3. Ensaio de fura-2/acetoximetil (AM) para medição de [Ca2+]i
<ol><li>Execute o carregamento do Fura-2/AM conforme descrito abaixo.<ol><li>Incubar as células em placas com fundo de vidro por 1 h a 37 °C, atmosfera ambiente, e protegidas da luz com tampão de bicarbonato Krebs-Ringer (KRB; contendo 119 mM de NaCl, 4,8 mM de KCl, 1,0 mM de CaCl 2, 1,2 mM de MgSO4 e 25 mM de NaHCO3) com 0,5% de HEPES (Tabela 1), mais 0,5% de BSA, 0,5 μM de fura-2/AM, ácido plurônico F127 de 8 μM e sulfinpirazona de 250 μM.</li>
		<li>Ajuste o pH para 7,45 usando um medidor de pH antes de usar. Após o carregamento com fura-2/AM, lavar as células com KRB contendo 250 μM de sulfinpirazona imediatamente antes da medição de [Ca2+]i .</li>
	</ol></li>
	<li>Execute a medição de [Ca2+]i conforme descrito abaixo.<ol><li>Coloque as placas contendo as células carregadas com fura-2 sob o microscópio, localize um campo representativo contendo entre 20 células e 50 células em aumento de 200x e use a função Freehand para desenhar um contorno ao redor de cada célula para indicar ao software o que é e o que não é fluorescência de fundo.</li>
		<li>Aguarde até que o software subtraia automaticamente a fluorescência de fundo da medição e clique no botão Iniciar experimento .</li>
		<li>Em seguida, aguardar entre 8 s e 15 s para estabelecer os níveis basais de cálcio nas células antes de pipetar cuidadosamente no agonista de interesse. Continue a medir por pelo menos 120 s após a adição do agonista ou até que os níveis de cálcio tenham retornado à linha de base.</li>
	</ol></li>
	<li>Execute a análise de dados conforme descrito abaixo.<ol><li>Use a mudança no pico [Ca2+]i para representar as ações dos estímulos. Calcular o nível médio de cálcio basal em cada célula a partir dos primeiros 8-15 s de medidas. Se esse número for igual ou superior a 500 nM, remova essa célula do conjunto de dados, pois ela está passando por apoptose ou necrose.</li>
		<li>Uma vez calculado o nível basal de cada célula, subtraia essa quantidade do máximo medido [Ca2+]i para a mesma célula. Média da variação no pico [Ca2+]I para todas as células de um determinado prato.</li>
		<li>Para garantir a consistência, registre as respostas de cada estímulo em duplicata e calcule o valor médio das mudanças no pico [Ca2+]i obtidas das duplicatas como um ponto de dados da amostra humana individual. Comparar os dados de diferentes grupos usando um método apropriado de análise de dados baseado no desenho do estudo.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female-specific+downregulation+of+tissue+polymorphonuclear+neutrophils+drives+impaired+regulatory+T+cell+and+amplified+effector+T+cell+responses+in+autoimmune+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease.</a> Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).</li>
<li>Wang, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+negatively+regulates+epithelial+wound+healing+and+protective+lipid+mediator+circuits+in+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea.</a> FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).</li>
<li>Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+androgens+and+pituitary+hormones+on+the+structural+profile+and+secretory+activity+of+the+lacrimal+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland.</a> Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).</li>
<li>Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+dry+eye+disease+among+US+men%3A+estimates+from+the+Physicians%27+Health+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians' Health Studies.</a> Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).</li>
<li>Tellefsen Nøland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+and+age+differences+in+symptoms+and+signs+of+dry+eye+disease+in+a+Norwegian+cohort+of+patients%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients.</a> The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).</li>
<li>Sullivan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFOS+DEWS+II+Sex%2C+gender%2C+and+hormones+report%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report.</a> The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).</li>
<li>Meester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeXY+chromosomes+and+the+immune+system%3A+reflections+after+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Sex+Differences%22%5BJournal%5D)">SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study.</a> Biology of Sex Differences. 11, 3(2020).</li>
<li>Yang, J. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+replacement+therapy+reverses+the+decrease+in+natural+killer+cytotoxicity+but+does+not+reverse+the+decreases+in+the+T-cell+subpopulation+or+interferon-gamma+production+in+postmenopausal+women%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women.</a> Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).</li>
<li>Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+age%2C+refractive+error+and+gender+related+changes+of+the+cornea+and+the+anterior+segment+of+the+eye+with+Scheimpflug+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Contact+Lens+%26+Anterior+Eye%22%5BJournal%5D)">Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging.</a> Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).</li>
<li>Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+age+and+gender+on+corneal+biomechanical+properties+in+a+healthy+Italian+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population.</a> Cornea. 33, 968-972 (2014).</li>
<li>Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+sex+steroids+exert+sex-specific+and%2For+opposite+effects+on+gene+expression+in+lacrimal+and+meibomian+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands.</a> Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).</li>
<li>Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age%2C+gender%2C+and+interracial+variability+of+normal+lacrimal+gland+volume+using+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI.</a> Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).</li>
<li>Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+aging+on+the+polar+and+neutral+lipid+profiles+in+human+meibomian+gland+secretions%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions.</a> Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).</li>
<li>Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+sex+hormone+levels+on+tear+production+in+postmenopausal+Nigerian+women%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Medicine+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women.</a> African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).</li>
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<li>Shatos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cultured+human+conjunctival+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).</li>
<li>Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+rat+conjunctival+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvin+D1+and+aspirin-triggered+resolvin+D1+regulate+histamine-stimulated+conjunctival+goblet+cell+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion.</a> Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).</li>
<li>Dartt, D. A., Masli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctival+epithelial+and+goblet+cell+function+in+chronic+inflammation+and+ocular+allergic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).</li>
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<li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen%3A+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).</li>
<li>García-Posadas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+IFN-%CE%B3+with+cholinergic+agonists+to+modulate+rat+and+human+goblet+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function.</a> Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).</li>
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<li>Contrò, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+steroid+hormone+receptors%2C+their+ligands%2C+and+nuclear+and+non-nuclear+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways.</a> AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).</li>
<li>Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variation+in+estrogen+receptor-alpha+protein+turnover+in+the+presence+of+estrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).</li>
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<li>Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-based+differences+in+conjunctival+goblet+cell+responses+to+pro-inflammatory+and+pro-resolving+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators.</a> Scientific Reports. 12, 16305(2022).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

A investigação das diferenças sexuais nos tecidos oculares ajuda a compreender os processos das doenças, especialmente o olho seco e a conjuntivite alérgica, que afetam desproporcionalmente um sexo 4,5,6. Embora modelos animais possam ser utilizados para esses estudos, dados obtidos diretamente do tecido humano são essenciais devido à maior similaridade com as células humanas in vivo. Os tecidos conjuntivais utilizados ...

Diferenças baseadas no sexo afetam múltiplos processos da superfície ocular 1,2,3. A manifestação clínica dessas diferenças baseadas no sexo é a diferença na prevalência de muitas doenças da superfície ocular entre homens e mulheres, como olho seco e conjuntivite4,5,6. Evidências sugerem que as diferenças baseadas no sexo surgem de múltiplos níveis biológicos, incluindo os diferentes perfis de genes nos cromossomos X e Y7 e os efeitos dos hormônios8. Estudar a base molecular das diferenças baseadas no sexo pode fornecer uma melhor compreensão da doença e, eventualmente, melhorar a medicina personalizada.
A superfície ocular compreende o filme lacrimal sobrejacente, córnea e conjuntiva. Diferenças baseadas no sexo são observadas em múltiplos componentes da superfície ocular, incluindo o filme lacrimal 9,10, a córnea 11, a glândula lacrimal 12,13 e as glândulas meibomianas que também secretam lágrimas 12. Numerosos estudos mecanísticos têm investigado o efeito dos hormônios sexuais sobre a córnea e seus componentes associados14,15; no entanto, pouco se sabe sobre as diferenças baseadas no sexo na conjuntiva e suas células caliciformes. A conjuntiva é uma membrana mucosa que cobre a esclera e a superfície interna da pálpebra. O epitélio da conjuntiva é composto por células escamosas estratificadas, não queratinizantes, multicamadas16.
Dentre as células escamosas estratificadas da conjuntiva, encontram-se as células caliciformes (CGCs) intercaladas na superfície apical do epitélio. Essas células caliciformes caracterizam-se pelo grande número de grânulos secretores localizados no polo apical17. Os CGCs sintetizam e secretam a mucina formadora de gel MUC5AC para hidratar a superfície ocular e lubrificá-la durante o piscar17. A secreção de mucina é fortemente regulada pela [Ca 2+] intracelular ([Ca2+]i) e pela ativação da quinase regulada por sinal extracelular dependente de Ras (ERK1/2)18. A incapacidade de secretar mucina resulta em ressecamento da superfície ocular e sequelas de anormalidades patológicas. Em uma superfície ocular inflamada, entretanto, a extensa secreção de mucina estimulada por mediadores inflamatórios leva à percepção de aderência e coceira ocular19. Essas condições com secreção perturbada de mucina acabarão levando à deterioração da superfície ocular.
O papel das células caliciformes como a principal fonte de mucina ocular tem sido reconhecidohá muito tempo20, no entanto, as diferenças baseadas no sexo na regulação da mucina em ambos os estados fisiológicos e patológicos permanecem desconhecidas. Um sistema in vitro seria útil para monitorar a função das células caliciformes sem o efeito hormonal ou com um nível precisamente controlado de hormônios sexuais. Embora uma linhagem celular epitelial conjuntival tenha se desenvolvido21, não há linhagem de células caliciformes com secreção funcional de mucina disponível. Portanto, modificamos nossa cultura primária de CGC humana desenvolvida para estabelecer um método para analisar a diferença baseada em sexo in vitro16, e apresentá-la como abaixo.

<table><tbody><tr><td>0,05% de tripsina com 1x EDTA</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td> <td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>4- (2-hidroxietil) -1- ácido piperazineetanossulfônico</td><td>Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA)</td> <td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Mídia RPMI avançada</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td> <td>12633020</td><td></td></tr><tr><td>carbacol</td><td>Cayman Chemical (Ann Arbor, MI)</td> <td>144,86</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovin</td><td>R& D (Minneapolis, MN)</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2- éster acetoximetílico</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Tecido conjuntival humano</td><td>Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>sal inorgânico para buffer KRB</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td></td><td>Qualquer marca funcionará</td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>Lonza Group (Basel, Suíça)</td><td>17-605F</td><td></td></tr><tr><td>aminoácidos não essenciais</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>fenol sem vermelho Mídia RPMI&nbsp;</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>11835055</td><td></td></tr><tr><td>Ácido plurônico F127</td><td>MilliporeSigma (Burlington, MA, EUA)</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 meio de cultura</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>bisturi</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)</td><td>12460451</td><td>Qualquer bisturi cirúrgico estéril pode trabalhar</td></tr><tr><td>piruvato de sódio</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>sulfinpirazona</td><td>MilliporeSigma (Burlington, MA, EUA)</td> <td>S9509-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro método para estudo de diferenças sexuais em células caliciformes conjuntivais

In Vitro Method to Study Sex-Based Differences in Conjunctival Goblet Cells

O olho seco é uma doença multifatorial que afeta a saúde da superfície ocular, com prevalência profundamente maior em mulheres. A ruptura da mucina formadora de gel que é secretada pelas células caliciformes conjuntivais (CGCs) na superfície ocular contribui para múltiplas doenças da superfície ocular. A eliminação de hormônios sexuais exógenos é essencial para a obtenção de resultados consistentes durante o estudo in vitro de diferenças sexuais em CGCs. Este trabalho descreve um método para minimizar a presença de hormônios exógenos no estudo de diferenças baseadas no sexo em CGCs, mantendo sua função fisiológica. CGCs de doadores humanos post-mortem de ambos os sexos foram cultivados a partir de pedaços da conjuntiva em meio RPMI com 10% de soro fetal bovino (SFB) (referido como meio completo) até a confluência. Cerca de 48 h antes do início dos experimentos, as CGCs foram transferidas para o meio RPMI sem vermelho de fenol ou SFB, mas com BSA a 1% (referido como meio livre de vermelho fenol). A função celular normal foi estudada medindo-se o aumento da [Ca 2+] ([Ca 2+]i) intracelular após estimulação com carbacol (Cch, 1 x 10-4 M) usando microscopia de fura 2/acetoximetil (AM). O resultado mostra que os CGCs mantiveram função normal no meio livre de fenol após 48 h. Nenhuma diferença significativa na resposta [Ca2+]i foi observada entre o meio RPMI livre de fenol vermelho e o meio completo após estimulação com Cch. Portanto, recomendamos o uso do meio RPMI livre de vermelho fenol com BSA a 1% para eliminar hormônios exógenos sem alterar a função normal das CGCs no estudo de diferenças baseadas no sexo.

Os CGCs humanos em cultura primária crescem até 80% de confluência em aproximadamente 14 dias. O tipo celular foi confirmado pela coloração por imunofluorescência com anticorpos contra os marcadores caliciformes CK7 e HPA-125 (Figura 1). Embora a remoção de FBS do meio possa eliminar os hormônios sexuais, a falta de FBS poderia potencialmente afetar a resposta celular. Para verificar o método de eliminação hormonal, um agonista colinérgico (carbachol, Cch 1 × 10-...

O meio livre de vermelho fenol/soro fetal bovino é uma opção melhor do que o RPMI avançado para eliminar hormônios exógenos sem alterar a função normal das células caliciformes da conjuntiva no estudo de diferenças baseadas no sexo.

In vitro Método para Estudo de Diferenças Sexuais em Células Caliciformes Conjuntivais

Dry eye is a multi-factorial disease affecting ocular surface health, with a profoundly higher prevalence in women. Disruption of the gel-forming mucin ...

Ao estudar a função das células caliciformes em cultura primária, obtemos informações valiosas sobre os mecanismos por trás das diferenças baseadas no sexo na saúde da superfície ocular. Modificamos o já estabelecido método de cultura primária de células caliciformes caliciformes, eliminando hormônios e substâncias estrogênicas do sistema, permitindo um controle mais preciso dos níveis de hormônios sexuais. Essa modificação aumenta a acurácia e a confiabilidade de nossos achados.A medida intracelular de cálcio é um método para estudar a função das células caliciformes sob diversos estímulos e as vias de sinalização intracelular desencadeadas por cada estímulo. A técnica pode ser estendida ao desenvolvimento de medicamentos para doenças da superfície ocular, como alergia ocular, doença do olho seco ou conjuntivite. Esta técnica facilita a triagem do efeito de várias moléculas nas células caliciformes sob níveis hormonais específicos.Pessoas novas nesta técnica muitas vezes lutam com a separação do tecido conjuntival do tecido conjuntivo. Nosso conselho é prestar muita atenção à textura e às propriedades do material do tecido. A conjuntiva deve ser elástica e semitransparente, enquanto o tecido conjuntivo é geralmente de cor mais clara e semelhante à fibra de algodão.Para começar, usando um bisturi estéril, pique o tecido conjuntival humano em pedaços cúbicos de um milímetro. Em uma placa de seis poços, semeie quatro pedaços em cada poço contendo um milímetro de meio RPMI completo. Certifique-se de ancorar as peças ao prato.Incube os pedaços de tecido a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de ar. Atualize o meio de cultura a cada dois dias. Após 72 horas da semeadura, remova o tampão de tecido e continue a incubação até que as células caliciformes atinjam 70 a 80% de confluência.Em seguida, lave as células com PBS e adicione 0,05% de tripsina EDTA para separar as células do fundo da placa. Observe o descolamento celular ao microscópio. E uma vez que as células se desprendam, adicione um meio RPMI completo para desativar a tripsina.Centrifugar a suspensão celular a 150 G por cinco minutos e ressuspender o pellet em meio RPMI livre de vermelho fenol. Em seguida, resemeie a suspensão celular em uma placa de cultura com fundo de vidro para medição da concentração de cálcio intracelular. Para o carregamento de Fura-2 AM, adicione o tampão de bicarbonato Krebs-Ringer contendo 0,5%HEPES, 0,5%BSA e 0,5 Fura-2 AM micromolares, oito ácido plurônico micromolar F127 e 250 sulfinpirazona micromolar na placa de fundo de vidro contendo células caliciformes.Incubar as células durante uma hora a 37 graus Celsius, protegendo-as da luz. Após a incubação, lavar as células com tampão de bicarbonato Krebs-Ringer contendo 250 micromolares sulfinpirazona. Para a medição da concentração intracelular de cálcio, coloque a placa contendo células carregadas com Fura-2 sob o microscópio.Em seguida, adicione 200 vezes a ampliação. Localize um campo representativo contendo 20 a 50 células. Usando a função à mão livre, desenhe um contorno ao redor de cada célula para distingui-la da fluorescência de fundo e aguarde que o software subtraia automaticamente a fluorescência de fundo da medição.Clique no botão Iniciar experimento e aguarde de oito a 15 segundos para determinar os níveis basais de cálcio nas células. Em seguida, adicione cuidadosamente o agonista colinérgico carbacol e continue a medir por pelo menos 120 segundos ou até que os níveis de cálcio tenham retornado aos valores basais. Usando a mudança na concentração de pico de cálcio intracelular, calcular o nível médio de cálcio basal em cada célula dos primeiros oito a 15 segundos de medição.Remover do conjunto de dados células com nível médio de cálcio basal igual ou superior a 500 nanomolares. Em seguida, calcule a concentração máxima de cálcio intracelular para cada célula. Em seguida, subtraia o valor do nível basal de cálcio da concentração intracelular máxima medida para a mesma célula.Finalmente, faça uma média da mudança no pico de concentração de cálcio intracelular para todas as células de um prato. A pureza das células caliciformes da conjuntiva humana foi confirmada pela coloração por imunofluorescência, utilizando-se anticorpos específicos para os marcadores de células caliciformes, citoqueratina e lectina Helix pomatia 1. Os resultados do ensaio Fura-2 AM não mostraram diferenças significativas entre as células incubadas em RPMI livre de fenol vermelho com BSA 1% e meio RPMI completo.No entanto, um aumento significativo da resposta intracelular de cálcio ao carbacol foi observado quando comparado o grupo do meio RPMI avançado com o grupo do meio RPMI completo. O mais importante é obter cultura primária de células caliciformes humanas de densidade celular suficiente. Durante o crescimento, certifique-se de que os pedaços de tecido grudem na placa de cultura para um crescimento eficaz.Os pesquisadores poderiam explorar o envolvimento de vias específicas aplicando vários inibidores, visando receptores ou moléculas sinalizadoras para as células antes da estimulação. Os outros parâmetros indicativos da função das células caliciformes, como secreção de mucina e desativação de proteínas quinases ativadas por mitógenos, também podem ser avaliados. As medidas complementares fornecem uma compreensão abrangente da resposta das células caliciformes a diferentes estímulos.

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