Name: Modelagem do Desenvolvimento Cerebelar Humano In Vitro em Estrutura 2D (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Aprenda a modelar o desenvolvimento cerebelar humano in vitro em estrutura 2D usando células-tronco pluripotentes induzidas. Este método simplificado permite estudar alterações relacionadas a transtornos neuropsiquiátricos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Jenny Gringer Richards por seu trabalho minucioso na validação de nossos sujeitos de controle, a partir do qual geramos as iPSCs de controle. Este trabalho foi apoiado pelo NIH T32 MH019113 (para D.A.M. e K.A.K.), o Nellie Ball Trust (para T.H.W. e A.J.W.), NIH R01 MH111578 (para V.A.M. e J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (para A.J.W.), e o Roy J. Carver Charitable Trust (para V.A.M., J.A.W. e A.J.W.). As figuras foram criadas com BioRender.com.

A pesquisa em seres humanos foi aprovada sob o número de aprovação do Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Iowa 201805995 e o número de aprovação do Comitê de Células-Tronco Pluripotentes Humanas da Universidade de Iowa 2017-02. As biópsias de pele foram obtidas dos sujeitos após a obtenção do termo de consentimento livre e esclarecido. Os fibroblastos foram cultivados em DMEM com soro fetal bovino a 15% (FBS) e solução de aminoácidos não essenciais a 1% de MEM a 37 °C e 5% de CO2. Os fibroblastos foram reprogramados usando um kit de reprogramação episómica seguindo o protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais) usando um nucleofector para eletroporação. Todos os procedimentos foram realizados em um gabinete de segurança biológica Classe II Tipo A2 ("capuz" para abreviar). Todos os meios de cultura celular eram livres de antibióticos; portanto, cada componente que entrava no capô era limpo com etanol a 70%. Todos os meios e componentes da cultura celular foram filtrados ou abertos estéreis no exaustor para manter sua esterilidade.
1. Preparação experimental
<ol><li>Preparar placas revestidas com matriz de membrana basal (BMM). NOTA: BMM solidifica mais rapidamente em temperaturas mais quentes. As placas devem ser preparadas rápida e imediatamente colocadas a 4 °C para armazenagem.<ol><li>Descongelar o BMM (ver Tabela de Materiais) no gelo, a 4 °C durante, pelo menos, 2 h, ou durante a noite.</li>
		<li>Misture DMEM/F12 e BMM até uma concentração final de 80 μg/mL. Distribuir a solução de BMM em placas de cultura de tecidos (1 ml para 35 mm e 2 ml para placas de 60 mm) e incubar a 37 °C durante, pelo menos, 1 h ou durante a noite antes de chapear as células. NOTA: Os pratos não utilizados podem ser armazenados a 4 °C durante 2 semanas.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar placas revestidas com poli-L-ornitina/laminina (PLO/laminina).<ol><li>Prepare 20 μg/mL de PLO (ver Tabela de Materiais) em DPBS+/+ estéril e adicione 1 mL a cada poço de uma placa de 6 poços. Incubar durante a noite a 37 °C na incubadora.</li>
		<li>No dia seguinte, aspirar a OLP com um aspirador a vácuo e lavar duas vezes com DPBS+/+. Seque ao ar livre no capô. NOTA: As placas secas ao ar podem ser armazenadas a 4 °C por até 2 semanas, envoltas em papel alumínio, para uso futuro.</li>
		<li>Prepare 10 μg/mL de laminina (ver Tabela de Materiais) em DPBS+/+ e adicione 1 mL a cada poço de uma placa de 6 poços. Incubar pelo menos durante 3 h ou durante a noite a 37 °C na incubadora.</li>
		<li>Aspirar a laminina com um aspirador a vácuo e adicionar 1 ml de DPBS+/+ estéril ou estéril. NOTA: O revestimento de laminina não deve secar. PBS ou um meio de cultura apropriado deve ser adicionado imediatamente para evitar isso. As placas revestidas podem ser armazenadas a 4 °C por até 2 semanas.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare a solução de passagem de PSC. NOTA: Um osmômetro (consulte Tabela de Materiais) é necessário para fazer a solução de passagem de PSC10.<ol><li>Dissolver 11,49 g de cloreto de potássio (KCl) e 0,147 g de citrato de sódio di-hidratado (HOC(COONa)(CH 2 COONa)2*2H2O)em 400 ml de água de cultura celular estéril (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Meça o volume da solução e registre-o como o volume inicial (Vi).</li>
		<li>Meça a osmolaridade e ajuste-a a 570 mOsm adicionando água de grau de cultura de células estéreis usando a fórmula Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.</li>
		<li>Filtrar-esterilizar a solução com um filtro de 0,20 μm e fazer alíquotas de 10 mL. Armazenar as alíquotas à temperatura ambiente (RT) por até 6 meses.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar meio pluripotente de células-tronco (PSC). NOTA: As iPSCs são mantidas em um meio contendo FGF2 estável ao calor (consulte Tabela de Materiais), fornecendo um cronograma de alimentação sem fim de semana. Outras mídias PSC comercialmente disponíveis não foram testadas para este protocolo.<ol><li>Descongele o suplemento médio de PSC durante a noite a 4 °C.</li>
		<li>Adicione 10 mL de suplemento de meio PSC a 500 mL de meio PSC basal. Fazer alíquotas de 25 ml e conservar a -20 °C. NOTA: As alíquotas congeladas podem ser armazenadas a -20 °C durante 6 meses. As alíquotas descongeladas devem ser armazenadas a 4 °C e utilizadas no prazo de 2 semanas. As células podem ser congeladas para armazenamento a longo prazo em um meio PSC com 10% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO).</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare o meio de descongelamento PSC.<ol><li>Suplemento de meio PSC com 50 nM de cromo, 1,5 μM de emricasan, 1x suplemento de poliamina e 0,7 μM de trans-ISRIB (coquetel CEPT11) (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Filtrar-esterilizar com um filtro de 0,20 μm e conservar a 4 °C durante um período máximo de 4 semanas.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare pipetas de vidro puxadas.<ol><li>Puxe pipetas Pasteur de vidro de 22,9 cm (9 pol) em duas peças acima de um queimador Bunsen, ~2 cm abaixo do pescoço, criando duas pipetas, com o lado mais fino sendo ~4 cm mais curto que o outro.</li>
		<li>Com a ajuda da chama, dobre as pontas do lado puxado para criar um "r" suave.</li>
		<li>Coloque as pipetas puxadas nas mangas da autoclave e na autoclave para esterilização.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar meio de diferenciação cerebelar (MDL).<ol><li>Misture IMDM e mistura de nutrientes F12 de Ham em uma proporção de 1: 1. Complemente a mistura com 1x suplemento de L-alanina-L-glutamina, concentrado lipídico quimicamente definido a 1% (v/v), 0,45 mM 1-tio-glicerol, 15 μL/mL de apo-transferrina, 5 mg/mL de albumina sérica bovina (BSA) e 7 μg/mL de insulina (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Filtrar-esterilizar com um filtro de 0,20 μm, conservar a 4 °C e utilizar no prazo de 1 mês.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar o meio de maturação cerebelar (CMM).<ol><li>Suplemento de meio neurobasal com 1x suplemento de L-alanina-L-glutamina e 1x suplemento de N-2 (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Filtrar-esterilizar com um filtro de 0,20 μm, conservar a 4 °C e utilizar no prazo de 2 semanas.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cultura iPSC sem alimentador
<ol><li>Descongele as células seguindo as etapas abaixo.<ol><li>Colocar uma placa BMM (passo 1.1) na incubadora a 37 °C para gelificar durante, pelo menos, 1 h ou durante a noite antes de descongelar as células.</li>
		<li>Pré-aqueça 10 mL de meio de descongelamento PSC (etapa 1.5) a 37 °C.</li>
		<li>Transferir o criovial com células do azoto líquido para banho-maria a 37 °C. NOTA: Para evitar a geração de uma fonte de contaminação no espaço de cultura celular, não é recomendado o uso de banho-maria padrão. Em vez disso, a água doce pode ser aquecida em um copo pequeno a 37 ° C para gerar um banho de água de uso único.</li>
		<li>Quando houver um pequeno pedaço de gelo deixado no tubo, retire-o do banho-maria, seque o tubo e pulverize com etanol a 70%. Transfira o tubo para o exaustor e use uma pipeta sorológica de 2 mL ou 5 mL (ver Tabela de Materiais) para transferir suavemente as células para um tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Adicione 8 mL de meio de descongelamento PSC às células gota a gota enquanto gira o tubo cônico. Centrífuga a 200 x g durante 5 min a RT.</li>
		<li>Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo sem perturbar o pellet celular. Ressuspender as células em 2 mL de meio de descongelamento de PSC.</li>
		<li>Aspirar o BMM da placa e adicionar as células ressuspensas gota a gota sobre a placa para uma distribuição uniforme.</li>
		<li>Colocar a placa na incubadora a 37 °C, 5% de CO2. Atualize o meio no dia seguinte com o PSC médio. Depois disso, mude o meio diariamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Mantenha as células seguindo as etapas abaixo.<ol><li>Pré-aqueça o volume necessário do meio PSC a 37 °C (por exemplo, 1 mL de meio por placa de 35 mm).</li>
		<li>Investigar as placas para células ou colônias diferenciadas e remover as células diferenciadas com uma pipeta de vidro puxada (etapa 1.6). NOTA: As colônias de iPSC têm bordas lisas com células morfologicamente idênticas.</li>
		<li>Mude o meio gasto diariamente e a passagem a cada 3-4 dias ou quando 70% de confluência for atingida.</li>
	</ol></li>
	<li>Passe as células.<ol><li>Coloque a quantidade necessária de placas BMM na incubadora por pelo menos 1 h ou durante a noite antes de passar. Pré-aqueça a quantidade necessária de meio PSC (passo 1.3) a 37 °C.</li>
		<li>Usando uma pipeta de vidro puxada, limpe todas as células ou colônias diferenciadas.</li>
		<li>Aspirar o meio gasto com aspirador a vácuo e adicionar meio de dissociação PSC, 1 mL por prato de 35 mm. Incubar a 37 °C durante 1-3 min. NOTA: Se as colônias estiverem decolando na solução de passagem de PSC antes de adicionar o meio de PSC, o tempo de incubação pode ser reduzido.</li>
		<li>Aspirar a solução de PSC passaging e adicionar o meio PSC pré-aquecido.</li>
		<li>Usando uma ponta de pipeta estéril de 200 μL, risque linhas paralelas umas às outras em uma direção, gire a placa em 90° e faça um segundo conjunto de linhas de risco perpendiculares às anteriores (fazendo um padrão de eclosão cruzada em toda a placa).</li>
		<li>Aspirar a solução BMM das placas ajustadas. Coletar as colônias usando uma pipeta sorológica e distribuí-las para novas placas BMM.</li>
		<li>Incubar a 37 °C, 5% de CO2. Mude o meio diariamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Congele as células.<ol><li>Prepare os criovianos rotulando o conteúdo e esterilize sob luz ultravioleta (UV) no exaustor (consulte a Tabela de Materiais) por 30 min.</li>
		<li>Prepare o meio de congelamento PSC suplementando o meio PSC com DMSO a 10% (v/v). Siga as etapas 2.3.2-2.3.5.</li>
		<li>Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL com pipeta sorológica de 5 mL e centrífuga a 200 x g por 5 min no RT.</li>
		<li>Aspirar cuidadosamente o meio e ressuspender o pellet celular em meio de congelamento PSC.</li>
		<li>Distribuir em crioviais. Coloque os frascos para injetáveis num recipiente de congelação e coloque o recipiente num congelador a -80 °C.</li>
		<li>No dia seguinte, transfira os criovitais para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Diferenciação cerebelar
NOTA: Antes de iniciar a diferenciação, as iPSCs são passadas para seis placas de 35 mm e estão prontas para a diferenciação quando estão em 70% de confluência. Cada placa de 35 mm será transferida para um poço da placa de 6 poços.
<ol><li>No dia 0, levante as colônias saudáveis de iPSC para a formação de EB.<ol><li>Adicionar 1 mL de MDL (etapa 1.7) suplementado com 10 μM Y-27632 e 10 μM SB431542 (ver Tabela de Materiais) a cada poço de uma placa de fixação ultrabaixa (ULA) de 6 poços e colocar na incubadora até que as colônias levantadas estejam prontas para serem adicionadas aos poços.</li>
		<li>Limpe as células diferenciadas usando uma pipeta de vidro puxada. Aspirar o meio e adicionar 1 mL de solução de PSC para cada prato de 35 mm. Incubar por 3 min a 37 °C, aspirar, e adicionar 2 mL de MDL suplementado com 10 μM Y-27632 e 10 μM SB431542. NOTA: Se as colônias estiverem decolando na solução de passagem de PSC antes de adicionar MDL, o tempo de incubação pode ser reduzido.</li>
		<li>Sob um microscópio invertido de luz transmitida, levante suavemente as colônias usando a borda dobrada da pipeta de vidro puxada usando ampliação de 4x. Uma vez que cada colônia é levantada, transfira suavemente tudo para um poço da placa ULA de 6 poços usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Repita este processo para cada placa iPSC. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2. NOTA: Se as colônias forem muito grandes ou forem fundidas, elas podem ser cortadas com a ponta da pipeta de vidro puxada para criar EBs menores.</li>
	</ol></li>
	<li>No dia 2, adicione FGF2 a cada poço a uma concentração final de 50 ng/mL. NOTA: O FGF2 utilizado para diferenciação cerebelar não é estável ao calor. Este protocolo não foi testado com FGF2 estável ao calor.</li>
	<li>No dia 7, faça uma mudança média de 1/3. Para 3 mL de meio total em um poço, com um pipettor de 1.000 μL, aspirar suavemente 1 mL de meio gasto e substituí-lo por 1 mL de MDL fresco. Incubar os EBs por 7 dias.</li>
	<li>No dia 14, aspirar suavemente quase todo o meio gasto usando um pipettor de 1.000 μL. Para garantir danos mínimos aos EBs, gire a placa para reunir todos os EBs no centro da placa e, em seguida, incline a placa e aspirar lentamente da borda.<ol><li>À medida que a quantidade média diminui, coloque lentamente a placa plana e continue a aspirar. Deixe o meio suficiente para evitar secar os EBs. Posteriormente, adicione 3 mL de MDL fresco suplementado com 10 μM Y-27632. Transfira os EBs usando uma pipeta sorológica de 10 mL para um prato revestido de PLO/laminina (etapa 1.2). NOTA: Dependendo da aplicação a jusante, os EBs podem ser transferidos para uma placa PLO/laminina de 6 poços ou os EBs únicos podem ser transferidos para um único poço de uma placa de 24 poços revestida de PLO/laminina ou deslizamento de cobertura.</li>
	</ol></li>
	<li>No dia 15, aspirar o meio e substituí-lo por MDL fresco. NOTA: É importante adicionar meio suficiente aos poços para garantir um meio suficiente entre as mamadas, pois, com o tempo, haverá evaporação (por exemplo, para um poço em uma placa de 6 poços, adicione 3 mL de meio). Se o meio começou a acidificar (ficar claro e amarelo), atualize o meio mesmo que não esteja no cronograma de alimentação até o final do protocolo.</li>
	<li>No dia 21, aspirar o meio gasto e substituí-lo por CMM. No dia 28, troque o meio com CMM fresco. No dia 35, colha as células para outras aplicações.</li>
</ol>4. Preparação da amostra para isolamento de ARN
<ol><li>Aspirar o meio e adicionar 500 μL de reagente de dissociação celular (ver Tabela de Materiais) a cada poço da placa de 6 poços. Deixe-o ligado por alguns segundos e piratee.</li>
	<li>Incubar a placa, com a tampa ligada, à temperatura ambiente durante 2 min. Toque nas laterais da placa para separar as células.</li>
	<li>Adicione 1 mL de CMM (etapa 1.8) e colete as células em um tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Pellet as células por centrifugação usando uma minicentrífuga de bancada (ver Tabela de Materiais) por 30 s a RT (velocidade máxima 2000 x g), descarte o meio e adicione 1 mL de 1x PBS pH 7,4 para lavar o pellet celular.</li>
	<li>Pellet as células novamente usando uma minicentrífuga de bancada por 30 s no RT e lave com PBS mais uma vez.</li>
	<li>Pellet as células e descartar o PBS. Lise as células do fenol e do isotiocianato de guanidina contendo reagente (ver Tabela de Materiais). NOTA: As células lisadas em fenol e isotiocianato de guanidina contendo reagente podem ser armazenadas a -80 °C por até 1 ano. As células podem ser lisadas diretamente no prato, dependendo do método de isolamento de RNA e dos reagentes que estão sendo usados. Devido ao baixo número de células em um prato, isolar o RNA usando colunas de spin de sílica (ver Tabela de Materiais) resultará em maiores rendimentos de RNA.</li>
</ol>5. Preparação de células para coloração imunofluorescente
NOTA: Para uma placa de 24 poços, um EB por poço é suficiente.
<ol><li>No dia 35, aspirar o meio gasto e lavar as células adicionando 1 mL de DPBS+/+ por poço (para um poço de uma placa de 24 poços).</li>
	<li>Aspirar o DPBS+/+ e adicionar 500 μL de paraformaldeído frio a 4% (PFA, ver Tabela de Materiais) preparado em DPBS+/+ por poço. Incubar por 20 min no RT.</li>
	<li>Remova 4% de PFA e lave as células duas vezes com DPBS+/+, como na etapa 5.1. Adicionar 1 ml de DPBS+/+ e conservar as células a 4 °C até à coloração. NOTA: Recomenda-se fazer a coloração imunofluorescente dentro de 1 semana após a fixação para evitar o descolamento celular e a perda de antígenos. No entanto, dependendo do anticorpo e da localização celular do alvo, a coloração pode ser feita em momentos posteriores até 4 semanas após a fixação.</li>
</ol>

<ol><li>Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+cerebellar+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1H.5 (2012).</li>
<li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).</li>
<li>Muguruma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+for+self-formation+of+the+cerebellum+from+human+pluripotent+stem+cells+through+induction+of+the+isthmic+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer.</a> Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).</li>
<li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li>
<li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlined+3D+cerebellar+differentiation+protocol+with+optional+2D+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888(2017).</li>
<li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+3D+protocol+capable+of+generating+early+cortical+neuroepithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium.</a> Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).</li>
<li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+neurons+in+the+absence+of+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70(2020).</li>
<li>Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+transcriptional+landscape+of+xeno-free+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids.</a> Scientific Reports. 11, 12959(2021).</li>
<li>Salero, E., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+ES+cells+into+cerebellar+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differentiation of ES cells into cerebellar neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).</li>
<li>Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+passaging+of+adherent+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 9 (1), 88012(2014).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+polypharmacology+platform+promotes+cytoprotection+and+viability+of+human+pluripotent+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells.</a> Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).</li>
<li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).</li>
<li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).</li>
<li>Hoshino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a%2C+a+bHLH+transcriptional+gene%2C+defines+GABAergic+neuronal+fates+in+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum.</a> Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).</li>
<li>Mizuhara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cells+originate+from+cerebellar+ventricular+zone+progenitors+positive+for+Neph3+and+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin.</a> Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).</li>
<li>Ferreira, A., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Class+III+%CE%B2-tubulin+isotype+in+developing+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).</li>
<li>Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+conserved+isotype-defining+variable+region+sequences+for+four+vertebrate+beta+tubulin+polypeptide+classes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).</li>
<li>Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed%2C+Wnt+and+Pax+genes+regulate+midbrain-hindbrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development.</a> Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).</li>
<li>Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otx2%2C+Gbx2+and+Fgf8+interact+to+position+and+maintain+a+mid-hindbrain+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer.</a> Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).</li>
<li>Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+transcriptional+corepressor%2C+Corl2%2C+as+a+cerebellar+Purkinje+cell-selective+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Patterns%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker.</a> Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).</li>
<li>Aldinger, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+cell+type+transcriptional+landscape+of+human+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development.</a> Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).</li>
<li>Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+usage+of+Otx2+promoters+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development.</a> Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).</li>
<li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PsychENCODE+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li>
<li>Aijaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+SIX3+and+SIX6+in+human+tissues+reveals+differences+in+expression+and+a+novel+correlation+between+the+expression+of+SIX3+and+the+genes+encoding+isocitrate+dehyhrogenase+and+cadherin+18%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18.</a> Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).</li>
<li>Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+Six3+and+Six6+distribution+in+the+developing+and+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain.</a> Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).</li>
<li>Andreasen, N. C., Pierson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+cerebellum+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The role of the cerebellum in schizophrenia.</a> Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).</li>
<li>Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+MRI+study+of+cerebellar+vermis+morphology+in+patients+with+schizophrenia%3A+Evidence+in+support+of+the+cognitive+dysmetria+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept.</a> Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).</li>
<li>Jacobsen, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+morphology+of+the+cerebellum+and+fourth+ventricle+in+childhood-onset+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia.</a> American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).</li>
<li>Saywell, V., Cioni, J. -M., Ango, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+gene+expression+profile+of+axon+guidance+cues+in+Purkinje+cells+during+cerebellar+circuit+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation.</a> The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).</li>
<li>Kim, D., Ackerman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UNC5C+netrin+receptor+regulates+dorsal+guidance+of+mouse+hindbrain+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons.</a> Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).</li>
<li>Maier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+4C+and+4G+are+ligands+of+Plexin-B2+required+in+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).</li>
<li>Telley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+function+of+NRP1+in+axon+guidance+and+subcellular+target+recognition+in+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum.</a> Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+mature+functional+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons.</a> Scientific Reports. 5, 9232(2015).</li>
<li>Shabanipour, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+neurons+isolated+from+embryonic+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60168(2019).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

A capacidade de modelar o desenvolvimento cerebelar humano in vitro é importante para a modelagem de doenças, bem como para promover a compreensão do desenvolvimento normal do cérebro. Protocolos menos complicados e econômicos criam mais oportunidades para a geração de dados replicáveis e ampla implementação em vários laboratórios científicos. Um protocolo de diferenciação cerebelar é descrito aqui usando um método modificado de geração de EBs que não requer enzimas ou agentes de dissociação, usando fatores de c...

Compreender o desenvolvimento cerebelar humano e as janelas de tempo críticas desse processo é importante não apenas para decodificar as possíveis causas dos distúrbios do neurodesenvolvimento, mas também para identificar novos alvos para a intervenção terapêutica. Modelar o desenvolvimento cerebelar humano in vitro tem sido um desafio, mas ao longo do tempo, muitos protocolos diferenciando células-tronco embrionárias humanas (hESCs) ou iPSCs com destinos de linhagem cerebelar surgiram 1,2,3,4,5,6,7,8 . Além disso, é importante desenvolver protocolos que gerem resultados reprodutíveis, sejam relativamente simples (para reduzir o erro) e não sejam pesados em custos monetários.
Os primeiros protocolos de diferenciação cerebelar foram gerados a partir de culturas 2D de corpos embrionários banhados (EBs), induzindo o destino cerebelar com vários fatores de crescimento semelhantes ao desenvolvimento in vivo, incluindo WNT, BMPs e FGFs 1,9. Protocolos publicados mais recentemente induziram diferenciação principalmente em cultura organoide 3D com FGF2 e insulina, seguidos por FGF19 e SDF1 para estruturas rômbicas semelhantes a lábios3,4, ou usaram uma combinação de FGF2, FGF4 e FGF85. Ambos os métodos de indução de organoides cerebelares resultaram em organoides cerebelares 3D semelhantes, pois ambos os protocolos relataram expressão de marcadores cerebelares semelhantes em pontos de tempo idênticos. Holmes e Heine estenderam seu protocolo 3D5 para mostrar que as células cerebelares 2D podem ser geradas a partir de hESCs e iPSCs, que começam como agregados 3D. Além disso, Silva et al.7 demonstraram que células que representam neurônios cerebelares maduros em 2D podem ser geradas com uma abordagem semelhante a Holmes e Heine, usando um ponto de tempo diferente para mudar de 3D para 2D e estendendo o tempo de crescimento e maturação.
O protocolo atual induz o destino cerebelar em iPSCs livres de alimentadores, gerando corpos embrionários (EBs) flutuantes livres usando insulina e FGF2 e, em seguida, chapeando os EBs em pratos revestidos de OLP / laminina no dia 14 para crescimento e diferenciação 2D. No dia 35, as células com identidade cerebelar são obtidas. A capacidade de recapitular os estágios iniciais do desenvolvimento cerebelar, especialmente em um ambiente 2D, permite que os pesquisadores respondam a perguntas específicas que exijam experimentos com uma estrutura monocamada. Este protocolo também é passível de modificações adicionais, como superfícies micropadronizadas, ensaios de crescimento axonal e classificação celular para enriquecer as populações celulares desejadas.

<table><tbody><tr><td>Pipeta sorológica de 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-26D</td><td></td></tr><tr><td>1-tio-glicerol</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-26B</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Filtro de 250 mL, 0.2 &micro; m aPES, 50 mm de diâmetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB12566502</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>4D Nucleofector core unit</td><td>Lonza</td><td>276885</td><td>Nucleofector</td></tr><tr><td>5 mL Pipeta sorológica</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-25D</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish</td><td>Falcon</td><td>353004 6</td><td></td></tr><tr><td>poços placas de fixação ultra-baixa</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>9" Pipetas Pasteur Descartáveis</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrina</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Água de grau de cultura celular</td><td>Cytiva</td><td>SH30529.02</td><td></td></tr><tr><td>Concentrado lipídico quimicamente definido</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>Chroman 1</td><td>Cayman</td><td>34681</td><td></td></tr><tr><td>Classe II, Tipo A2, Gabinete de Segurança Biológica</td><td>NuAire, Inc.</td><td>NU-540-600</td><td>Capuz, luz UV</td></tr><tr><td>Placa Costar de 24 poços, TC tratada</td><td>com Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços Costar, TC tratada</td><td>com solução Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimetly sulfóxido)</td><td>Kit</td> de reprogramação iPSC epissómal Sigma <td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+/+</td><td>Gibco</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Emricasan</td><td>Cayman</td><td>22204</td><td></td></tr><tr><td>Epi5</td> Life <td>Technologies</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8-Flex</td><td>Gibco</td><td>A2858501</td><td>PSC com sistema de</td></tr><tr><td>imagem de núcleo FGF2 EVOS XL</td> estável <td>ao calor Life</td><td>Technologies AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino - Premium Select</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Suplemento de L-alanina-L-glutamina</td></tr><tr><td>Mistura de Nutrientes F12 da Ham's</td><td>Gibco</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 HERAcell VIOS 160i</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EN2 humano, biotecnologia</td><td>SC-293311</td><td></td>de <td>Santa Cruz</td></tr><tr><td>do rato Anti-Ki67/MKI67 humano, coelho</td><td>R& D Systems</td><td>MAB7617</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PTF1a humano, coelho</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-98726</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TUBB3 humano, camundongo</td><td>Biolegend</td><td>801213</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Gibco</td><td>12585</td><td></td></tr><tr><td>Laminina Proteína de camundongo</td><td>Gibco</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>Matriz</td> <td>MatrigelMatriz</td> de <td>membrana de porão</td><td>Corning 354234</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Mini Centrífuga</td> Kit de Limpeza de RNA <td>Monarca</td>da <td>Labnet International</td><td>C1310</td></tr> (<tr><td>50 &micro; g)</td> <td>New England BioLabs</td><td>T2040</td><td>Colunas de rotação de sílica</td></tr><tr><td>Monarca Total RNA Miniprep Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>T2010</td><td>Colunas de rotação de sílica</td></tr><tr><td>N-2 suplemento</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>PFA 16%</td> <td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de poliamina</td><td>Sigma</td><td>P8483</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitina (PLO)</td><td>Sigma</td><td>3655</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>54317</td><td></td></tr><tr><td>Bolsas auto-seláveis transparentes</td><td>Steriking</td><td>SS-T2 (90x250)</td><td>Bolsas de autoclave</td></tr><tr><td>Sódio citrato di-hidratado&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de seringa, estéreis, PES 0.22 &micro; m, 30 mm Dia</td><td>Research Products International</td><td>256131</td><td></td></tr><tr><td>Trans-ISRIB</td><td>Cayman</td><td>16258</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Fenol e isotiocianato de guanidina</td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express (1x)</td><td>Gibco</td><td>12604039</td><td>Reagente de dissociação celular&nbsp;</td></tr><tr><td>Osmômetro de pressão de vapor</td><td>Wescor, Inc.</td><td>Modelo 5520</td><td>Osmômetro</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Biogems</td><td>1293823</td><td></td></tr></tbody></table>

modelagem do desenvolvimento cerebelar humano in vitro em estrutura 2d

Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure

O desenvolvimento preciso e oportuno do cerebelo é crucial não só para a coordenação motora precisa e equilíbrio, mas também para a cognição. Além disso, a interrupção no desenvolvimento cerebelar tem sido implicada em muitos distúrbios do neurodesenvolvimento, incluindo autismo, transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) e esquizofrenia. Investigações do desenvolvimento cerebelar em humanos anteriormente só foram possíveis através de estudos post-mortem ou neuroimagem, mas esses métodos não são suficientes para entender as mudanças moleculares e celulares que ocorrem in vivo durante o desenvolvimento inicial, que é quando muitos distúrbios do neurodesenvolvimento se originam. O surgimento de técnicas para gerar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) a partir de células somáticas e a capacidade de rediferenciar ainda mais as iPSCs em neurônios abriram o caminho para a modelagem in vitro do desenvolvimento cerebral inicial. O presente estudo fornece passos simplificados para a geração de células cerebelares para aplicações que requerem uma estrutura monocamada 2-dimensional (2D). As células cerebelares que representam os estágios iniciais de desenvolvimento são derivadas de iPSCs humanas através das seguintes etapas: primeiro, os corpos embrionários são feitos em cultura tridimensional (3D), depois são tratados com FGF2 e insulina para promover a especificação do destino cerebelar e, finalmente, são terminalmente diferenciados como uma monocamada em substratos revestidos de poli-l-ornitina (PLO) / laminina. Aos 35 dias de diferenciação, as culturas de células cerebelares derivadas de iPSC expressam marcadores cerebelares, incluindo ATOH1, PTF1α, PAX6 e KIRREL2, sugerindo que esse protocolo gera precursores neuronais cerebelares glutamatérgicos e GABAérgicos, bem como progenitores de células de Purkinje. Além disso, as células diferenciadas apresentam morfologia neuronal distinta e são positivas para marcadores de imunofluorescência de identidade neuronal, como o TUBB3. Essas células expressam moléculas de orientação axonal, incluindo semaforina-4C, plexina-B2 e neuropilina-1, e poderiam servir de modelo para investigar os mecanismos moleculares de crescimento de neuritos e conectividade sináptica. Este método gera neurônios cerebelares humanos úteis para aplicações a jusante, incluindo expressão gênica, estudos fisiológicos e morfológicos que exigem formatos de monocamada 2D.

Visão geral da diferenciação cerebelar 3D para 2D As células cerebelares são geradas a partir de iPSCs. A Figura 1A mostra o fluxo de trabalho geral e a adição dos principais componentes para diferenciação. No dia 0, os EBs são feitos levantando suavemente as colônias de iPSC (Figura 1B) usando uma pipeta de vidro puxada em MDL contendo SB431542 e Y-27632 e colocados em placas de fixação ultrabaixa. FGF2 é adicionado no dia 2. No dia 7, um te...

O presente protocolo explica a geração de uma monocamada 2D de células cerebelares a partir de células-tronco pluripotentes induzidas para investigar os estágios iniciais do desenvolvimento cerebelar.

Modelagem do Desenvolvimento Cerebelar Humano In Vitro em Estrutura 2D

The precise and timely development of the cerebellum is crucial not only for accurate motor coordination and balance but also for cognition. In addition, ...

Este método pode ajudar no estudo do desenvolvimento cerebelar humano precoce e como ele pode ser alterado em distúrbios neuropsiquiátricos. A principal vantagem deste método é gerar células cerebelares humanas precoces em desenvolvimento em uma estrutura de camada 2D sem executar etapas complicadas. Também é rentável.Fazer pipetas de tração pode ser complicado no início, mas com a prática e o tempo, fica mais fácil puxar as pipetas de uma maneira que será mais fácil de trabalhar. Comece a preparação experimental puxando uma pipeta Pasteur de 22,9 centímetros aproximadamente dois centímetros abaixo do pescoço, acima do queimador de bunsen para criar duas pipetas de vidro. O lado mais fino será aproximadamente quatro centímetros mais curto que o outro.Dobre as pontas do lado puxado na chama para criar um R liso, em seguida, coloque as pipetas puxadas em mangas de autoclave e esterilize-as em uma autoclave. No dia zero, adicione um mililitro de meio de diferenciação cerebelar suplementado com 10 micromolares Y-27632 e SB-431542 a cada poço de uma placa de fixação ultrabaixa de seis poços, ou ULA, e coloque-a na incubadora até que as colônias levantadas estejam prontas para serem adicionadas aos poços. Limpe as células diferenciadas usando uma pipeta de vidro puxada.Aspirar o meio e adicionar um milímetro de solução de passagem de iPSC para cada prato de 35 milímetros. Após três minutos de incubação a 37 graus Celsius, aspirar o meio e adicionar dois milímetros de meio de diferenciação cerebelar suplementado com 10 micromolares Y-27632 e SB-431542 Sob ampliação de 4x de um microscópio invertido de luz transmitida, levante as colônias usando a borda dobrada da pipeta de vidro puxada. Uma vez que cada colônia é levantada, transfira suavemente todas as colônias para um poço da placa ULA de seis poços usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros.Repita este processo para cada placa iPSC e incube as células a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%. No segundo dia, adicione FGF2 a cada poço para ajustar uma concentração final de 50 nanogramas por mililitro. No sétimo dia, mude um terço do meio aspirando um mililitro de meio gasto e substituindo-o por um mililitro de meio de diferenciação cerebelar fresco.Incubar os corpos embrionários por sete dias. No dia 14, gire a placa para reunir todos os corpos embrionários no centro da placa. Em seguida, incline a placa e aspirar todo o meio gasto usando um pipetter de 1000 microlitros da borda.À medida que a quantidade média diminui, coloque lentamente a placa plana e continue a aspirar, deixando meio suficiente para evitar retirar os corpos embrionários. Em seguida, adicione três mililitros de meio de diferenciação cerebelar fresco suplementado com 10 micromolares Y-27632. Em seguida, transfira os corpos embrionários usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros para um prato revestido de laminina poli-L-ornitina.No dia 15, aspirar o meio e substituí-lo por meio de diferenciação cerebelar fresco. No dia zero, as colônias de iPSC foram limpas e levantadas em meio de diferenciação cerebelar contendo SB-431542 e Y-27632 e colocadas em placas de fixação ultra-baixas para geração de corpos embrionários. A adição de FGF2 no segundo dia e uma mudança de 1/3 de meio no sétimo dia resultaram em corpos embrionários mostrando aumento no 14º dia.As células começaram a migrar para fora dos corpos embrionários ao longo da superfície revestida no 15º dia. A mudança completa do meio para o meio de maturação cerebelar a partir do 21º dia resultou em uma monocamada de células com morfologia e complexidade neuronais até o 35º dia. A análise da expressão gênica no dia 35 revelou que as células expressam marcadores progenitores cerebelares precoces, como progenitores glutamatérgicos, ATOH1, progenitores GABAérgicos, PTF1 alfa e os marcadores de células progenitoras de Purkinje KIRREL2 e SKOR2.Além disso, a expressão do marcador labial rômbico OTX2 e principalmente do neurônio anterior específico SIX3 também foram observados. A marcação imunofluorescente das células colhidas no 35º dia mostrou coloração positiva para os marcadores cerebelo EN2 e PTF1 alfa, o marcador neuronal beta tubulina III e o marcador de proliferação KI67. A coloração nuclear com 4'6-diamidino-2-fenilindol, ou DAPI, mostrou núcleos celulares.Para uma diferenciação bem-sucedida, é crucial começar com colônias de iPSC saudáveis e indiferenciadas e usar reagentes que sejam o mais recém-reconstituídos possível.

modeling-human-cerebellar-development-in-vitro-in-2d-structure

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra um protocolo para diferenciar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em progenitores cerebelares. Envolve a transferência de colônias de células-tronco para uma placa de fixação ultrabaixa para formar corpos embrióides, promovendo a diferenciação com fatores de crescimento e, em seguida, transferindo os corpos embrióides para uma placa revestida com matriz para adesão. As etapas subsequentes envolvem a indução da migração celular e a adição de um meio de...

Uma técnica para gerar uma monocamada 2D de células cerebelares a partir de células-tronco pluripotentes induzidas

Este vídeo demonstra a geração de um modelo de lesão neuronal em neurônios granulares cerebelares primários de camundongos. Ele descreve as etapas envolvidas na indução de lesão neuronal usando NMDA, um agonista excitatório do receptor de neurotransmissor, e glicina, um co-agonista. O NMDA e a glicina se ligam a receptores neuronais específicos, causando sua superestimulação e resultando em um influxo maciço de cálcio intracelular, o que leva a danos e morte das células neuronais.

Modelagem de lesão neuronal em neurônios granulares cerebelares primários de camundongos

A camada externa de grânulo cerebelar é o local da maior amplificação de trânsito no cérebro em desenvolvimento. Aqui, apresentamos um protocolo para direcionar modificação genética a esta camada no pico de proliferação utilizando ex eletroporação vivo e cultura de fatias de cerebelo a partir do dia 14 embriões de galinha embrionárias.

Ex Cultura Vivo de Pintainho Cerebelar Slices e voltadas para o espaço Eletroporação do grânulo precursores de células

Este protocolo descreve um método simples para isolar e neurônios de grânulo cerebral principal do rato (CGNs) de filhotes de 6-7 dias de idade, transdução eficiente de CGNs para perda e ganho de estudos de função, de cultivo e modelagem excitotoxicidade neuronal induzida por NMDA, morte celular baixo potássio-induzida, danos ao DNA e estresse oxidativo usando o mesmo modelo de cultura.

Modelagem de morte Neuronal e a degeneração no Mouse grânulo cerebelar primária de neurônios

Descrevemos um meio de protocolo para hPSCs, usando definido de diferenciação 3D simplificado e reduzido os fatores de crescimento, capazes de gerar agregados de células com início neuroepithelial estruturas e positivos para marcadores cerebelar associada, bem como um opcional Modificação de 2D para diferenciar as células como um monolayer para gerar neurônios funcionais.

Protocolo de diferenciação cerebelar 3D simplificada com modificação 2D opcional

Aqui nós apresentamos um método para preparar organotypic fatia de culturas de cerebelo de rato e bainha de mielina coloração por IHQ apropriado para investigar mecanismos de mielinização e como no sistema nervoso central.

Preparação e imunocoloração de culturas de fatia cerebelar microambiental Organotypic

Este protocolo descreve um sistema de cultura dinâmica para produzir agregados de tamanho controlado de células-tronco pluripotentes humanas e estimular ainda mais a diferenciação em organoides cerebelares sob condições quimicamente definidas e livres de alimentadores usando um bioreator de uso único.

Geração escalável de organoides cerebelares maduros de células-tronco pluripotentes humanas e caracterização por imunostaining

Aqui descrevemos um método para visualizar a sinaptogênese de neurônios de grânulos no cerebelo do rato ao longo do curso de tempo do desenvolvimento cerebral pós-natal, quando essas células refinam suas estruturas sinápticas e formam sinapses para se integrarem ao circuito cerebral geral.

Utilizando a eletroporação pós-natal in vivo para estudar a morfologia do neurônio do grânulo cerebelar e o desenvolvimento da sinapse

Apresentamos protocolos detalhados para a geração e caracterização de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos 2D e 3D (hIPSC) de desenvolvimento neocortical, bem como metodologias complementares que permitem análise qualitativa e quantitativa da biogênese e função do cilium primário (PC).

Modelos pluripotentes 2D e 3D induzidos por humanos para dissecar o envolvimento do círio primário durante o desenvolvimento neocortical

Este vídeo demonstra um método para dissecar e cultura de neurônios comissurais E13 rato medula espinhal dorsal. Dissociada neurônios comissurais são úteis para estudar os mecanismos celulares e moleculares do crescimento do axônio e orientação.

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Aprenda a modelar o desenvolvimento cerebelar humano in vitro em estrutura 2D usando células-tronco pluripotentes induzidas. Este método simplificado permite estudar alterações relacionadas a transtornos neuropsiquiátricos.

Modelagem do Desenvolvimento Cerebelar Humano In Vitro em Estrutura 2D

Explorar mais vídeos