Cultura tridimensional de criptas colônicas murinas para estudar a função das células-tronco intestinais ex vivo

Este protocolo fornece um método para estudar a função das células-tronco do cólon em um ambiente manipulável com menor custo no tempo do que os modelos animais. A cultura organoide permite o estudo da função das células-tronco em um ambiente livre de sistema imunológico. Isso permite identificar os efeitos de uma causa específica, como o nocaute da claudina-7.

Compreender os mecanismos da função das células-tronco pode lançar luz sobre novos alvos terapêuticos para doenças debilitantes, como a doença inflamatória intestinal e o câncer colorretal. Para começar o isolamento de criptas colônicas do rato eutanasiado, faça uma incisão de aproximadamente dois centímetros abaixo da linha média do mouse. Em seguida, prenda a pele para trás para expor o abdômen.

Corte o cólon logo abaixo do ceco do lado proximal e acima do reto do lado distal para isolar o cólon. Em seguida, remova o tecido adiposo ligado ao cólon usando fórceps. Depois de empurrar as fezes do cólon isolado com a extremidade plana da pinça, corte o tecido aberto longitudinalmente.

Lave o tecido 10 a 15 vezes com PBS frio, girando o tecido em torno de PBS entre lavagens com fórceps. Em seguida, usando um par de tesouras limpas e afiadas, corte o tecido em pequenos pedaços que variam de aproximadamente três a cinco milímetros. Depois de isolar o cólon de outro rato eutanasiado, combine todos os pedaços de tecido em um tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo meios de dissociação epitelial fria e incube os pedaços de tecido do cólon em meios de dissociação epitelial por 90 minutos a quatro graus Celsius com balanço suave.

Após a incubação, permita que os fragmentos de tecido afundem no fundo do tubo. Uma vez assentado, descarte o meio de dissociação epitelial sem interromper os fragmentos de tecido. Repita o processo ao lavar o tecido 10 a 15 vezes com PBS frio.

Descarte o máximo de PBS possível durante a lavagem final. Em seguida, adicione meios de dissociação de cripta fria aos pedaços de tecido do cólon lavados em um tubo de 50 mililitros e agite por cinco a 10 minutos à mão. Sob o exaustor de cultura de células, filtre o meio que contém o tecido com um filtro de células de nylon de 70 mícrons em um tubo de centrífuga de 50 mililitros fresco.

Após filtração, centrifugar o tubo a 200 G durante 10 minutos à temperatura ambiente, seguido de eliminar o sobrenadante sem perturbar as criptas peletizadas. Ressuscite o pellet em três a quatro mililitros de PBS frio. Pipeta 10 microlitros da suspensão da cripta em uma linha em uma lâmina de microscópio.

Usando o microscópio, conte o número de criptas longas e cheias para estimar a concentração de criptas e calcule o volume apropriado de criptas necessárias para chapear 10 criptas por microlitro em uma placa de 96 poços. Centrifugar um volume apropriado de criptas isoladas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro a 200 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, remova o sobrenadante usando uma pipeta de 1.000 microlitros sem interromper as criptas peletizadas.

Em seguida, adicione 100 microlitros de matriz de gel às criptas peletizadas sem introduzir bolhas de ar. Aguarde um a dois minutos até que a matriz de gel esteja parcialmente solidificada. Em seguida, placa de 10 microlitros da matriz de gel misturada com as criptas em cada poço de uma placa de cultura pré-aquecida de 96 poços para formar uma forma de cúpula.

Aguarde de 10 a 20 minutos para que a matriz de gel seja totalmente ajustada, colocando a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius sob dióxido de carbono a 5%. Finalmente, adicione 100 microlitros da solução de trabalho recém-preparada de meio L-WRN suplementado com antibióticos a cada poço e incube a placa a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Para colher os organoides, remova os meios antigos dos poços aplicando sucção a vácuo e fixe os organoides com paraformaldeído a 4% por uma hora à temperatura ambiente.

Em seguida, remova 4% de paraformaldeído dos poços por sucção a vácuo e trate os organoides com 100 microlitros de 30% de sacarose por poço a quatro graus Celsius. Após 24 horas, retire 30% de sacarose dos poços por sucção a vácuo antes de adicionar 10 microlitros de PBS a cada poço. Use uma ponta de pipeta para arranhar suavemente o fundo do poço para dissociar os organoides contendo cúpula.

Em seguida, remova o PBS contendo os organoides dissociados do poço com uma pipeta e transfira-o para um molde de plástico rotulado preenchido 90% com temperatura de corte ideal, ou OCT, composto. Continue o processo até que todos os organoides tenham sido removidos de todos os poços. Adicionar 2-metilbutano a um balão Dewar de aço inoxidável contendo pellets de gelo seco, o suficiente para cobrir os pellets.

Congele rapidamente o organoide contendo o bloco OCT, mantendo-o constantemente acima do 2-metilbutano. Finalmente, armazene o bloco OCT contendo organoides a menos 80 graus Celsius até que esteja pronto para a seção. A imagem representativa destaca o crescimento bem-sucedido de colonóides a partir de criptas normais contendo claudin-7.

As criptas contendo claudin-7 começaram a formar esferoides no segundo dia, começaram a brotar no quinto dia e continuaram crescendo e brotando até serem colhidas no nono dia. Em contraste, criptas sem claudin-7 não conseguiram formar colonóides adequados. Após o tratamento com 4-hidroxitamoxifeno por dois a três dias, as criptas nocauteadoras de claudina-7 apareceram como aglomerados circulares de células.

Ao contrário do controle, as criptas não se transformaram em esferoides saudáveis. A coloração por imunofluorescência para claudina-7 no controle colhido e os organoides knockout condicionais confirmaram o knockout bem-sucedido da claudina-7 em cultura. Os colonóides de controle exibiram muito pouco sinal apoptótico no nono dia.

No entanto, os colonóides knockout de claudin-7 exibiram alta apoptose ao mesmo tempo. Garantir a solidificação parcial antes do revestimento. O revestimento antes da solidificação parcial fará com que a matriz de gel se espalhe e a cúpula não seja formada, afetando a sobrevivência e o crescimento das criptas.

Este protocolo pode ser utilizado para a descoberta de medicamentos, estudando a comunicação celular, o metabolismo de medicamentos, a viabilidade, a proliferação e o desenvolvimento de tratamento personalizado específico do paciente. O estabelecimento da cultura organoide revolucionou o estudo de doenças e a medicina personalizada.