Name: Avaliação das Toxicidades Associadas às Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Usando um Modelo de Xenoenxerto de Camundongo Derivado de Pacientes com Leucemia Linfoblástica Aguda (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Aprenda a avaliar toxicidades associadas às células T CAR em um modelo de xenoenxerto derivado de pacientes com leucemia linfoblástica aguda. Este método permite monitorar fraqueza motora, perda de peso e carga tumoral em camundongos.

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Este trabalho foi parcialmente apoiado através do National Institutes of Health (R37CA266344, 1K99CA273304), Department of Defense (CA201127), Mayo Clinic K2R pipeline (S.S.K.), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (S.S.K.) e Predolin Foundation (R.L.S.). Além disso, gostaríamos de agradecer à equipe do Mayo Clinic NMR Core Facility. A Figura 1 foi criada em BioRender.com

Este protocolo segue as diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Mayo Clinic, Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC A00001767) e Comitê Institucional de Biossegurança (IBC, Bios00000006.04).
NOTA: Todos os materiais utilizados para trabalhar com ratos devem ser estéreis.
1. Injeção de bussulfano em camundongos NSG
<ol><li>Obter camundongos machos, 8-12 semanas de idade, imunocomprometidos, NOD-SCID IL2rγnull (NSG), e pesá-los antes da injeção. NOTA: Para significância estatística, recomenda-se usar pelo menos cinco camundongos por grupo e repetir este experimento pelo menos mais uma vez com camundongos fêmeas.</li>
	<li>Preparar bussulfano para injeção intraperitoneal (i.p.). Usando uma seringa de insulina de 1 mL, encha lenta e cuidadosamente a seringa com exatamente 30 mg/kg de bussulfano, seguido de injeção i.p nos camundongos, e coloque-os de volta na gaiola.</li>
</ol>2. Injeção de TODOS os blastos derivados do paciente (CD19+) nos camundongos NSG
NOTA: Este protocolo segue as diretrizes do Comitê Institucional de Biossegurança da Mayo Clinic (IBC, Bios00000006.04).
<ol><li>Coletar blastos leucêmicos primários do sangue periférico de pacientes com LLA recidivante e refratária.</li>
	<li>Preparar células-alvo para injeção intravenosa (IV).<ol><li>Conte as células-alvo CD19+ usando um hemocitômetro e registre o volume final e a concentração das células. NOTA: Para determinar a viabilidade celular, é altamente recomendável utilizar o azul de tripano durante a contagem das células.</li>
		<li>Pellet as células por centrifugação a 300 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Ressuspender o pellet celular em solução salina tamponada com fosfato (PBS) até uma concentração final de 50 × 106 células/mL em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e colocar no gelo.</li>
		<li>Vórtice do dedo o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo as células-alvo até que as células estejam completamente homogeneizadas.</li>
		<li>Usando uma seringa de insulina de 1 mL, encha lenta e cuidadosamente a seringa com exatamente 100 μL das células-alvo preparadas e mexa na seringa para remover bolhas. NOTA: O volume de 100 μL administrará 5 × 106 células a cada rato.</li>
		<li>Coloque os ratos sob luz morna por 5-10 min. Uma vez que a veia da cauda se torne ingurgitada e mais visível a olho nu, coloque os ratos em uma câmara de confinamento/contenção apropriada.</li>
		<li>Limpe a cauda do rato com um cotonete com álcool. Injete as células-alvo diretamente na veia da cauda (i.v.) e coloque o camundongo de volta na gaiola. Após a inoculação das células-alvo, monitorar os camundongos diariamente ou conforme recomendado pelo comitê de ética animal local.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Avaliação do enxerto tumoral
<ol><li>A partir de 6 semanas após a injeção da célula-alvo, avaliar o enxerto tumoral usando citometria de fluxo para medir a expressão de células CD19+ no sangue periférico.</li>
	<li>Dosagem de sangue periférico para avaliação da expansão CD19+<ol><li>Retirar o sangue dos ratinhos 6-8 semanas após a injeção de células CART19. NOTA: Vários métodos podem ser usados para retirar sangue. Para esse protocolo, a coleta de sangue submandibular é o método de escolha.</li>
		<li>Anestesiar o camundongo com isoflurano em câmara de indução com isoflurano a 5%. Uma vez obtida a anestesia, manter a 1-3% o isoflurano inalado através de um cone nasal. NOTA: É altamente recomendável aplicar pomada oftálmica para evitar o ressecamento dos olhos.</li>
		<li>Retire o mouse da câmara e segure o mouse com a mão não dominante, segurando a pele solta sobre o pescoço. Puncione a veia com uma lanceta ligeiramente atrás da mandíbula. NOTA: Apenas a ponta da agulha (1-2 mm) é necessária para entrar na veia.</li>
		<li>À medida que o sangue estiver pingando, colete pelo menos 50 μL em um tubo revestido com heparina e misture bem invertendo o tubo para cima e para baixo várias vezes. Transfira 30 μL de sangue para um tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL. NOTA: Para o sangue restante, gire o tubo a 17.000 × g durante 10 minutos a 4 °C. Transfira o soro (camada sobrenadante) para um tubo de microcentrífuga limpo e marcado de 1,5 mL e armazene-o a −80 °C (para uso no ensaio de citocinas).</li>
		<li>Adicionar 2 ml de tampão de lise (tampão de lise à base de cloreto de amónio 10x diluído a 1x utilizando água isenta de nucleases) no tubo de fundo redondo de 5 ml que contém o sangue. Misture muito bem agitando o tubo. Incubar o tubo à temperatura ambiente durante 20 minutos para garantir a lise adequada dos glóbulos vermelhos.</li>
		<li>Adicionar 2 mL de tampão de fluxo (PBS, 0,2 g/L de cloreto de potássio, 0,2 g/L de fosfato de potássio monobásico, 8 g/L de cloreto de sódio e 1,15 g/L de fosfato dibásico de sódio contendo 2% de soro fetal bovino e 1% de azida sódica).</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 300 × g durante 5 min a 4 °C. Decantar o sobrenadante e adicionar 2 mL de tampão de fluxo. Repita este passo de lavagem 2x.</li>
		<li>Decantar cuidadosamente o conteúdo do tubo. Observe a pequena quantidade de líquido com um pellet remanescente no tubo. Adicione 100 μL de tampão de fluxo e ressuspenda muito bem.</li>
		<li>Transfira todo o líquido restante no tubo de fluxo de 5 mL para uma placa de 96 poços. Certifique-se de que cada amostra está devidamente rotulada. Adicionar 100 μL de tampão de fluxo aos poços correspondentes e centrifugar a placa de 96 poços a 650 × g durante 3 min a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Avaliar a expansão das células-alvo CD19+ por citometria de fluxo (Figura 2).<ol><li>Preparar uma mistura principal contendo 0,3 μL de coloração viva/morta, 0,13 μg (2,5 μL) de anticorpo anti-humano CD19, 0,06 μg (2,5 μL) de anticorpo anti-humano CD45, 5 μg (2,5 μL) de anti-camundongo CD45 e 42,2 μL de tampão de fluxo para um total de 50 μL por amostra. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 15 minutos.</li>
		<li>Lavar com 150 μL de tampão de fluxo seguido de centrifugação a 650 × g durante 3 min a 4 °C. Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 195 μL de tampão de fluxo e 5 μL de esferas de contagem.</li>
		<li>Adquira em um citômetro de fluxo para determinar o nível de expressão de células CD19+ . Para fins de gating e análise, primeiro gate a população de interesse (CD19+) com base nas características de dispersão frontal versus lateral, seguido por uma única população de gating e, em seguida, células vivas. Uma vez que as células vivas são gated, avaliar a população CD45 humana versus CD45 de camundongo, e da população humana, porta a população-alvo CD19+ .</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificar para determinar a quantidade presente em 70 μL, e então expressar em células/μL usando a equação (1): Contagem absoluta de células CD19+ = ([células CD19+/contas de contagem] × número de contas de contagem dentro de 5 μL)/70 NOTA: Repetir o ensaio de sangue periférico a cada 5 dias para avaliar a expansão celular CD19+ . Coletar no máximo 200 μL de sangue cumulativamente a cada 2 semanas, de acordo com as diretrizes do comitê local de ética animal. Uma vez que os camundongos tenham atingido uma carga de doença de ≥10 células/μL, randomize para células CART19 ou grupos de controle (seção 4).</li>
</ol>4. Administração de células CART19 in vivo
<ol><li>Preparação das células CART19 (~Dia 80): NOTA: A geração de células CART19 já foi previamente publicada 27,30,31. Este procedimento deve ser realizado dentro de um Gabinete de Biossegurança Nível 2+ utilizando técnica asséptica e equipamentos de proteção individual.<ol><li>Descongelar as células CART19 num recipiente de banho-maria (37 °C). Em seguida, lave as células em meio de células T morno (MTC) para remover o dimetil sulfóxido. NOTA: A MTC é composta por 10% de soro AB humano (v/v), penicilina-estreptomicina-glutamina a 1% (v/v) e meio celular hematopoiético livre de soro27,30.</li>
		<li>Centrifugar as células CART19 a 300 × g por 8 min a 4 °C e ressuspender em MTC quente até uma concentração final de 2 × 106 células/mL. Deixe as células CART descansarem em uma incubadora (37 °C, 5% CO2) durante a noite, mas por não mais de 16 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Administração de células CART19 por injeção i.v. (Dia ~80)<ol><li>Conte as células CART19 e gire para baixo a 300 × g durante 8 minutos a 4 °C.</li>
		<li>Ressuspender as células CART19 com 10 mL de PBS e girar para baixo a 300 × g por 8 min a 4 °C.</li>
		<li>Ressuspender as células CART19 para uma concentração final de 40 × 106 células/mL com PBS, transferir as células para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL e colocá-las no gelo.</li>
		<li>Realizar injeções na veia da cauda celular CART19 (conforme detalhado acima) injetando 100 μL de células ressuspensas i.v. NOTA: Um volume de 100 μL administrará 4 × 106 células a cada rato. Incluir um grupo de camundongos não tratados como controle negativo.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Avaliação das toxicidades associadas às células CART19
<ol><li>Após a administração de células CART19, monitore os camundongos 2x por dia para avaliar quaisquer alterações em seu bem-estar, como fraqueza motora, corpo curvado e perda de peso corporal. NOTA: Todas essas alterações físicas correlacionam-se com os sintomas da RSC neste modelo28.</li>
	<li>Uma vez que os camundongos começam a desenvolver fraqueza motora e redução de peso (redução de 10-20% em relação à linha de base), colete sangue periférico para analisar a carga tumoral e realizar isolamento sérico para citocinas, de acordo com a metodologia descrita na seção 3 (Figura 3).</li>
	<li>Armazenar os tubos de microcentrífuga de soro a −80 °C e usar os soros para analisar as quimiocinas e citocinas usando um ensaio Multiplex (Figura 4). NOTA: Se os ratos apresentarem sinais de paralisia dos membros posteriores, parecerem moribundos ou letárgicos, e a perda de peso for > de 20% do seu peso corporal até ao ponto de limitar a sua capacidade de alcançar comida e/ou água, então serão sujeitos à eutanásia.</li>
</ol>6. Ressonância magnética
OBS: Um aparelho de RM pré-clínico (para pequenos animais) com ímã de furo vertical foi utilizado para ressonância magnética in vivo e aquisição de imagens32,33.
<ol><li>Misture 120 μL de Gadolínio + 880 μL de solução salina e carregue em uma seringa de insulina de 1 mL. Injectar 100 μL em cada rato (i.p.). NOTA: O gadolínio deve ser injetado 15-20 minutos antes do início do experimento.</li>
	<li>Anestesiar camundongos com isoflurano (2-3%) em câmara de indução por 10-15 min. NOTA: É altamente recomendável aplicar pomada oftálmica para evitar o ressecamento dos olhos.</li>
	<li>Coloque a coluna do mouse na sonda de berço compatível com roedores. Em seguida, prossiga para posicionar o mouse prendendo os dentes na barra de mordida.</li>
	<li>Puxe a cabeça do mouse na bobina de volume de 25 mm e ajuste o cone nasal preso ao sistema de anestesia com isoflurano. Aperte o botão da barra de mordida para manter a posição durante a varredura. NOTA: Se estiver a realizar uma ressonância magnética com contraste, certifique-se de que o gadolínio (neste caso) ou o agente de contraste é injetado pelo menos 10 minutos antes de colocar o aparelho no íman de furo. Durante todo o tempo de exame, os camundongos serão anestesiados pela inalação de isoflurano a 2-3% em ar através do cone nasal, e sua frequência respiratória será monitorada simultaneamente.</li>
	<li>Para avaliação da respiração, use um dispositivo de monitoramento respiratório/respiratório. OBS: É importante avaliar também a temperatura corporal para prevenir possíveis hipotermias devido à exposição prolongada à anestesia. Recomenda-se o uso de almofadas térmicas para controlar a temperatura corporal.<ol><li>Conecte a sonda do monitor respiratório perto do diafragma e fixe-a com fita cirúrgica. Mantenha a taxa de respiração entre 20-60 respirações por minuto para que a condição do rato seja estável. NOTA: Esta taxa fornece imagens de ressonância magnética mais estáveis e evita artefatos de movimento na imagem adquirida. Se a frequência respiratória for maior do que a faixa de 20-60 respirações por minuto, aumente a concentração de isoflurano. Se a frequência respiratória for inferior a 20 respirações por minuto, a anestesia é muito profunda; portanto, a concentração precisa ser diminuída.</li>
	</ol></li>
	<li>Insira a sonda animal no pequeno furo dentro do sistema de ressonância magnética de pequenos animais de furo vertical. Ajuste a cabeça do animal no centro da bobina. Fixe o aparelho com a trava para que ele fique em pé e conecte o instrumento ao computador.</li>
	<li>Abra e use o software (por exemplo, Paravision) para configurar as posições de varredura e os tipos de varreduras. Determinar as posições axiais e sagitais ideais, mantendo-as consistentes para todos os grupos experimentais. NOTA: Recomenda-se usar a aquisição de um exame de varredura como referência antes dos exames de ressonância magnética de corpo inteiro.</li>
	<li>Proceder com a coleta dos dados da RM (conforme descrito anteriormente32,34,35,36). Obtenha imagens de RM ponderadas em T1 e T2 usando a configuração sugerida mencionada abaixo.<ol><li>Para as imagens ponderadas em T1 na RM, utilizar a sequência multislice multieco ponderada em T1 (MSME) com tempo de repetição (TR) de 300 ms, tempo de eco (TE) de 9,5 ms, campo de visão (FOV) de 4 cm x 2 cm x 2 cm e matriz de 192 x 96 x 96 cm.</li>
		<li>Para as imagens ponderadas em T2 foram utilizadas uma sequência Multislice Multiecho (MSME) com TR de 300 ms, TE de 9,5 ms, FOV de 4 cm x 2 cm x 2 cm e matriz de 192 x 96 x 96.</li>
	</ol></li>
	<li>Quando as varreduras estiverem concluídas, remova a sonda do furo. Extraia suavemente o rato, removendo os dentes da barra de mordida. Monitorar o animal em uma gaiola separada até que ele esteja totalmente consciente e tenha recuperado a função motora adequada.</li>
	<li>Após a extração dos dados do software, utilizar software de análise para quantificação e renderização do volume 3D (Figura 4) das regiões de hiperintensidade. NOTA: Se possível, é altamente recomendável ter dois observadores cegos separados para a análise dos dados.</li>
</ol>

S.S.K. é um inventor de patentes no campo da imunoterapia CAR que são licenciadas para a Novartis (através de um acordo entre a Mayo Clinic, Universidade da Pensilvânia e Novartis) e para a Mettaforge (através da Mayo Clinic). R.L.S. e S.S.K. são inventores de patentes no campo da imunoterapia CAR que são licenciadas para a Humanigen. S.S.K. recebe financiamento de pesquisa da Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs e Lentigen.

Neste relatório, uma metodologia para avaliar a toxicidade associada a células CART usando um modelo ALL PDX foi descrita. Mais especificamente, este modelo procura mimetizar duas toxicidades potencialmente fatais, RSC e NI, que os pacientes frequentemente experimentam após a infusão de células CART. Ela recapitula muitas características das toxicidades da CART observadas na clínica: perda de peso, disfunção motora, neuroinflamação, produção de citocinas inflamatórias e quimiocinas e infiltração de diferentes células efe...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64535">Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model</a>. The Authors section was updated from:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5 
R. Leo Sakemura1,2 
Fang Jin6 
Roman H. Khadka6 
Mohamad M. Adada1,2 
Elizabeth L. Siegler1,2 
Aaron J. Johnson6 
Saad S. Kenderian1,2,6 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester
to:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5 
R. Leo Sakemura1,2 
Brooke L. Kimball1,2 
Fang Jin6 
Roman H. Khadka6 
Mohamad M. Adada1,2 
Elizabeth L. Siegler1,2 
Aaron J. Johnson6 
Saad S. Kenderian1,2,6 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64535">Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model

A terapia celular com receptor de antígeno quimérico T (CART) revolucionou o campo da imunoterapia contra o câncer. Provou ser bem-sucedida no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA) recidivante/refratária, linfoma de grandes células B, linfoma de células do manto, linfoma folicular e mieloma múltiplo1,2,3,4,5,6,7, levando a recentes aprovações do FDA. Apesar do sucesso inicial nos ensaios clínicos, o tratamento com terapia celular CART resulta em toxicidades muitas vezes graves e ocasionalmente letais. As toxicidades mais comuns após a terapia celular com CART incluem o desenvolvimento de RN e RN, também conhecida como síndrome de neurotoxicidade associada a células efetoras imunes (ICANS)8,9. A RSC é causada devido à superativação e expansão maciça das células CART in vivo, levando à secreção subsequente de múltiplas citocinas inflamatórias, incluindo interferon-γ, fator de necrose tumoral-α, fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e interleucina-6 (IL-6). Isso resulta em hipotensão, febre alta, síndrome de extravasamento capilar, insuficiência respiratória, falência de múltiplos órgãos e, em alguns casos, morte10,11. A RSC desenvolve-se em 50-100% dos casos após terapia celular com CART1911,12,13. A ICANS é outro evento adverso único associado à terapia celular com CART e é caracterizada por edema cerebral generalizado, confusão, obnubilação, afasia, fraqueza motora e, ocasionalmente, convulsões 9,14. Qualquer grau de ICANS ocorre em até 70% dos pacientes, e os graus 3-4 são relatados em 20-30% dos pacientes 5,10,15,16. Em geral, a SRC e a ICANS são comuns e podem ser fatais.
O manejo da ICANS após a terapia celular com CART é desafiador. A maioria dos pacientes com ICANS também apresenta RSC17, que muitas vezes pode ser tratada com o antagonista do receptor de IL-6 tocilizumabe ou esteroides18. Um relato anterior revelou que a intervenção precoce com tocilizumabe diminuiu a taxa de RSC grave, mas não afetou a incidência ou a gravidade da ICANS19. Atualmente, não há tratamento efetivo ou agente profilático para o ICANS, sendo crucial investigar estratégiaspreventivas 20.
Acredita-se que as células mieloides e as citocinas/quimiocinas associadas sejam os principais impulsionadores do desenvolvimento da RSC e ICANS21. Enquanto a RSC está diretamente relacionada à elevação extrema de citocinas e expansão de células T, a fisiopatologia da ICANS é amplamente desconhecida22,23. Portanto, é imperativo estabelecer um modelo de camundongo que recapitule essas toxicidades após a terapia celular com CART para estudar os mecanismos e desenvolver estratégias preventivas.
Existem vários modelos animais pré-clínicos atualmente usados para estudar, otimizar e validar a eficácia de células CART, bem como para monitorar suas toxicidades associadas. Estes incluem camundongos singênicos, xenoenxertos, transgênicos imunocompetentes, transgênicos humanizados e xenoenxertos derivados de pacientes, além de modelos de primatas. No entanto, cada um desses modelos apresenta desvantagens, e alguns não refletem as verdadeiras preocupações de eficácia ou segurança das células CART24,25. Portanto, é imperativo a escolha criteriosa do melhor modelo para os objetivos pretendidos do estudo.
Este artigo procura descrever a metodologia utilizada para avaliar a toxicidade associada às células CART, RNC e NI, utilizando um modelo in vivo de xenoenxerto derivado de ALL (PDX) (Figura 1). Especificamente, nos métodos aqui descritos, as células CART19 geradas em nosso laboratório são utilizadas seguindo protocolos previamente descritos. Resumidamente, as células T humanas são isoladas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de doadores saudáveis por meio de uma técnica de gradiente de densidade, estimuladas com esferas CD3/CD28 no dia 0 e transduzidas lentiviricamente no dia 1 com CARs compostas por um fragmento variável de cadeia única direcionado para CD19 fundido aos domínios de sinalização 4-1BB e CD3ζ. Essas células CART são então expandidas, desfrisadas no 6º dia e criopreservadas no 8º dia 26,27,28,29,30. Como descrito anteriormente, camundongos são submetidos a tratamento linfodepletante, seguido pela administração de blastos leucêmicos derivados do paciente (LLA)28. Primeiro, verifica-se a enxertia tumoral por meio da coleta de sangue submandibular. Após o estabelecimento de uma carga tumoral apropriada, as células CART19 são administradas aos camundongos. Em seguida, os ratos são pesados diariamente para avaliar o bem-estar. A ressonância magnética (RM) de pequenos animais é realizada para avaliar a infecção hospitalar, juntamente com o sangramento da cauda para avaliar a expansão de células T e a produção de citocinas/quimiocinas. As técnicas descritas abaixo são altamente recomendadas para serem usadas como modelo para estudar toxicidades associadas a células CART em um modelo PDX.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; APC Anti-Human CD19</td><td>Biolegend</td><td>302211</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de Preparação de Álcool</td><td>Wecol</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Analyze 14.0 software</td><td>AnalyzeDirect Inc.</td><td>N/A</td><td>https://analyzedirect.com/analyze14/</td></tr> <tr><td>Lágrimas artificiais (Óleo mineral e petrolato)</td><td>Akorn</td><td>17478-062-35</td><td>Gel oftálmico tópico para prevenir o ressecamento dos olhos</td></tr><tr><td>Solução de Lisinga BD FACS&nbsp;</td><td>BD</td><td>349202</td><td>Tampão de lise de glóbulos vermelhos</td></tr><tr><td>BD Micro-Fin IV seringas de insulina</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Brillian Violet 421 Anti-Human CD45</td><td>Biolegend</td><td>304032</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance II 7 Tesla&nbsp;</td>Máquina de <td>ressonância magnética</td> <td>Bruker Biospin</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Busulfan (NSC-750)</td><td>Selleckchem</td><td>S1692</td><td></td></tr><tr><td>CountBright contas de contagem absoluta</td><td>Invitrogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX System B4-R2-V2</td><td>Beckman Coulter</td><td>C10343</td><td>citômetro de fluxo</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Módulo de Controle/Gating ERT</td><td>SA Instruments</td><td>Modelo 1030</td><td>Sistema Respiratório e de Bloqueio</td></tr> de Monitoramento de Pequenos Animais <tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Millipore Sigma</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Bright-Line</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Soro AB Humano; Doadores do sexo masculino; tipo AB; US</td><td>Corning</td><td>35-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (Líquido)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de Coloração de Células Mortas Aqua Fixáveis, para excitação de 405 nm</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Microvette 500 Heparina de lítio</td><td>Sarstedt</td><td>20.1345.100</td><td>Tubo de coleta de sangue</td></tr><tr><td>MILLIPLEX Huma/Citocina/Quimiocina Painel de Contas Magnéticas</td><td>Millipore Sigma</td><td>HCYTMAG-60K-PX38</td><td>Ensaio Multiplex de Imunologia para identificar citocinas e quimiocinas</td></tr><tr><td>Omniscan</td><td>Ge Healthcare Inc.</td><td>0407-0690-10</td><td>Agente de contraste à base de gadolínio</td></tr><tr><td>Pd Anti-Mouse CD45</td><td>Biolegend</td><td>103106</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (100x), Líquido</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ensaio de poliestereno de fundo redondo</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>azida de sódio, 5% (p/v)</td><td>Ricca Chemical</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>Aço Inoxidável Cirúrgico Lâmina</td><td>Bard-Parker</td><td>371215</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Célula Hematopoiética Sem Soro Médio</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação das toxicidades associadas às células t do receptor de antígeno quimérico usando um modelo de xenoenxerto de camundongo derivado de pacientes com leucemia linfoblástica aguda

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

A terapia celular com receptor de antígeno quimérico T (CART) emergiu como uma ferramenta poderosa para o tratamento de vários tipos de malignidades CD19+ , o que levou à recente aprovação pelo FDA de várias terapias celulares CART direcionadas para CD19 (CART19). No entanto, a terapia celular CART está associada a um conjunto único de toxicidades que carregam sua própria morbidade e mortalidade. Isso inclui a síndrome de liberação de citocinas (SRC) e a neuroinflamação (NI). O uso de modelos pré-clínicos em camundongos tem sido crucial na pesquisa e desenvolvimento da tecnologia CART para avaliar tanto a eficácia quanto a toxicidade da CART. Os modelos pré-clínicos disponíveis para testar essa imunoterapia celular adotiva incluem modelos de camundongos singênicos, xenoenxertos, transgênicos e humanizados. Não há um modelo único que espelhe perfeitamente o sistema imunológico humano, e cada modelo tem pontos fortes e fracos. Este artigo tem como objetivo descrever um modelo de xenoenxerto derivado de pacientes usando blastos leucêmicos de pacientes com leucemia linfoblástica aguda como estratégia para avaliar toxicidades associadas à CART19, RSC e NI. Demonstrou-se que esse modelo recapitula as toxicidades associadas à CART19, bem como a eficácia terapêutica observada na clínica.

O objetivo deste protocolo é avaliar a toxicidade associada às células CART usando um modelo PDX de células tumorais de pacientes com LLA (Figura 1). Primeiro, camundongos NSG receberam injeções i.p. de bussulfano (30 mg/kg) com o objetivo de imunossuprimi-los e facilitar o enxerto de células CART28. No dia seguinte, receberam ~5 × 106 PBMCs (i.v.) derivados de TODOS os pacientes. Os camundongos foram monitorados para enxerto por ~13 semanas através</em...

Aqui, descrevemos um protocolo no qual um modelo de xenoenxerto derivado de pacientes com leucemia linfoblástica aguda é usado como estratégia para avaliar e monitorar as toxicidades associadas ao receptor de antígeno quimérico CD19-alvo.

Avaliação das Toxicidades Associadas às Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Usando um Modelo de Xenoenxerto de Camundongo Derivado de Pacientes com Leucemia Linfoblástica Aguda

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...

Este protocolo utiliza CAR-T humano e células tumorais e demonstra com precisão as toxicidades associadas à administração de CART19. Portanto, recapitulando o que foi observado na clínica. A principal vantagem do uso dessa plataforma é que ela fornece um modelo traduzível e clinicamente relevante onde células T humanas e células tumorais são utilizadas.Este modelo não só permite uma avaliação eficiente das toxicidades associadas à CART19, mas também nos permite entender melhor como podemos superar essas toxicidades por meio de estratégias de tratamento aprimoradas. Para começar, monitore os camundongos administrados pelo CART19 duas vezes ao dia para avaliar quaisquer alterações em seu bem-estar, como fraqueza motora, corpo curvado e perda de peso corporal. Uma vez que os ratos desenvolvem fraqueza motora e redução de peso, colete seu sangue periférico para analisar a carga tumoral.E realizar isolamento sérico para citocinas, conforme descrito no manuscrito. Após o isolamento, armazenar os tubos de microcentrífuga de soro a 80 graus Celsius e usar a cera para analisar as quimiocinas e citocinas usando o ensaio multiplex. Para imagens de ressonância magnética, misture 120 microlitros de gadolínio com 880 microlitros de solução salina e carregue em uma seringa de insulina de um mililitro.Injetar 100 microlitros da solução preparada por via intraperitoneal em cada rato. Anestesiar o mouse e colocá-lo na sonda de berço compatível com roedor. Em seguida, prenda os dentes na barra de mordida.Puxe a cabeça do rato para dentro da bobina de volume de 25 milímetros e ajuste o cone nasal preso ao sistema de anestesia com isoflurano. Aperte o botão da barra de mordida para manter a posição durante a varredura. Para avaliação da respiração, conecte a sonda de um dispositivo de monitoramento respiratório próximo ao diafragma e fixe-a com fita cirúrgica.Mantenha a taxa de respiração entre 20 a 60 respirações por minuto para que a condição dos ratos permaneça estável. Insira a sonda do animal no pequeno furo dentro do sistema de ressonância magnética de pequenos animais de furo vertical e ajuste a cabeça do animal no centro da bobina. Usando a trava, prenda o aparelho na posição vertical e conecte o instrumento ao computador.Em seguida, abra o software ParaVision para configurar as posições de varredura e os tipos de varreduras. Determinar as posições sagitais e axiais ideais, mantendo-as consistentes para todos os grupos experimentais. Para a coleta dos dados ponderados em T1 na RM, utilizou-se a sequência multi-slice, multieco ponderada em T1, com tempo de repetição de 300 milissegundos, tempo de eco de 9,5 milissegundos, campo de visão de 4,00 X 2,00 X 2,00 centímetros e matriz de 192 X 96 X 96.Para imagens de RM ponderadas em T2, use uma sequência multi-slice, multi-eco com parâmetros semelhantes. Quando as varreduras estiverem concluídas, remova a sonda do furo e extraia suavemente o mouse removendo os dentes da barra de mordida. Após a extração dos dados do software, utilizou-se um software de análise para a quantificação e renderização do volume 3D das regiões de hiperintensidade, as populações de células tumorais CD19+ foram comparadas entre camundongos tratados com CART19 e camundongos não tratados por citometria de fluxo.Redução significativa de peso foi observada em camundongos tratados com células CART19. A perda de peso é considerada como um sintoma do aparecimento da RSC, que está relacionada às toxicidades associadas às células CART. Um ensaio multiplex revelou a expressão de citocinas e quimiocinas no soro de camundongos NSG antes e após a administração de CART19.Imagens ponderadas em T2 revelaram evidências de edema e possível infiltrado inflamatório durante neuroinflamação em camundongos tratados com CART19. Já a RM ponderada em T1 mostrou realce pelo meio de contraste no parênquima cerebral, indicando aumento da permeabilidade vascular. Reconstruções tridimensionais do cérebro de roedores foram montadas com base em regiões de hiperintensidade T1 correspondentes à permeabilidade vascular, o que torna o volume de extravasamento de gadolínio no cérebro.É importante lembrar que o monitoramento físico diário dos camundongos após a administração de CART19, juntamente com o sangramento periférico, será o melhor indicador para prosseguir com a ressonância magnética para avaliar completamente quaisquer alterações no cérebro indicativas de SRC ou neurotoxicidade. Esta tecnologia é amplamente aplicável a terapias adicionais de células CAR-T e permitirá que os cientistas testem eficientemente potenciais toxicidades decorrentes de novas células CAR-T. Este modelo proposto é um trampolim na compreensão de como as toxicidades associadas às células CAR-T podem ser monitoradas, tratadas e usadas para validar novos modelos de células CAR-T.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

As tirosina quinases receptoras são ectopicamente expressa em muitos cancros e foram identificadas como alvos terapêuticos em leucemia aguda. Este manuscrito descreve uma estratégia eficaz para a avaliação pré-clínica de inibidores da tirosina cinase para o tratamento de leucemia aguda.

A avaliação pré-clínica da tirosina quinase inibidores para o tratamento de leucemia aguda

Linfoma de células do manto (MCL) é um difícil de tratar a doença associada a células B e é igualmente difícil estabelecer um modelo de rato de enxerto heterólogo do MCL primário para estudar e desenvolver a terapêutica. Aqui, descrevemos a criação bem sucedida de xenografts MCL em camundongos para ajudar a compreender a sua biologia subjacente.

Enxertia de tumor em um modelo do rato de enxerto heterólogo de linfoma de células do manto humano

Aqui, apresentamos um protocolo para a produção e testes pré-clínicos de murino células CD19 carro T por transdução retroviral e utilização como uma terapia contra linfoma de célula B A20 syngeneic estabelecida em camundongos BALB/c com ou sem lymphodepleting pré-condicionamento.

Um modelo de linfoma de célula B Syngeneic Mouse para avaliação pré-clínica de pilhas de T de carro CD19

Descrevemos um sistema quantitativo de ensaio de citolíse in vitro em tempo real para avaliar a potência das células T do receptor de antígeno quimérico que visam células tumorais líquidas e sólidas. Este protocolo pode ser estendido para avaliar outras células efetores imunes, bem como tratamentos combinados.

Um ensaio de potência em tempo real para células T do receptor de antígeno quimérico visando células cancerosas sólidas e hematológicas

Aqui, nós apresentamos um protocolo para induzir e marcar a doença em um modelo xenogénica da doença do transplantar-contra-anfitrião (xenogvhd). o xenoGVHD fornece um modelo in vivo para estudar a imunossupressão de células T humanas. Adicionalmente, nós descrevemos como detectar pilhas de T humanas nos tecidos com PCR digital como uma ferramenta para quantificar o immunosuppression.

Indução e pontuação da doença do enxerto versus hospedeiro em modelo murino Xenogeneico e quantificação de células T humanas em tecidos de camundongo utilizando PCR digital

Aqui, descrevemos um método in vitro co-cultura para recursivamente desafio tumor-alvo as células T, que permite a análise fenotípica e funcional da atividade antitumoral de célula T.

Em Vitro Tumor Cell reexposição para avaliação preditiva de Receptor de antígeno quimérico célula T função antitumoral

Este protocolo descreve a geração de camundongos do sistema imunológico humano (HIS) para estudos de imuno-oncologia. Instruções e considerações sobre o uso deste modelo para testes de imunoterápicos humanos em tumores humanos implantados neste modelo são apresentadas com ênfase na caracterização da resposta do sistema imune humano ao tumor.

Testando imunoterápicos contra o câncer em um modelo humanizado de camundongo com tumores humanos

Aqui, descrevemos um método para criar gotículas de emulsão dupla encapsulando uma célula T e uma célula-alvo cancerígena para examinar a morte celular no nível de uma única célula. Este método permite a quantificação dupla de moléculas citotóxicas e apoptose de células-alvo em uma grande população de células T.

Ensaio de citotoxicidade baseado em gotículas para avaliar células T receptoras de antígeno quimérico no nível de célula única

Este protocolo descreve o xenoenxerto in ovo de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) B e T derivadas do paciente, que ocorre 4 dias após a injeção.

In Ovo Xenoenxerto de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) derivadas de pacientes (PDX-LLA)

O protocolo tem como objetivo descrever um modelo de camundongo para gerar recidivas de leucemia linfoblástica aguda, com base na dinâmica da resposta à quimioterapia de indução.

Modelo Murino de Leucemia Recaída para Quimioterapia de Indução para Leucemia Linfoblástica Aguda

Aprenda a avaliar toxicidades associadas às células T CAR em um modelo de xenoenxerto derivado de pacientes com leucemia linfoblástica aguda. Este método permite monitorar fraqueza motora, perda de peso e carga tumoral em camundongos.

Avaliação das Toxicidades Associadas às Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Usando um Modelo de Xenoenxerto de Camundongo Derivado de Pacientes com Leucemia Linfoblástica Aguda (Vídeo) | JoVE Journal

Avaliação das Toxicidades Associadas às Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Usando um Modelo de Xenoenxerto de Camundongo Derivado de Pacientes com Leucemia Linfoblástica Aguda

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