Name: Cultura Tridimensional de Tecido Adiposo Termogênico Vascularizado a partir de Fragmentos Microvasculares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprenda a criar tecido adiposo termogênico vascularizado em 3D a partir de fragmentos microvasculares. Este método simplificado utiliza MVFs como fonte única de células para engenharia de tecido adiposo bege funcional.

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Dr. Acosta é apoiado pelos subsídios do National Institutes of Health CA148724 e TL1TR002647. O Dr. Gonzalez é apoiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais dos Institutos Nacionais de Saúde, sob o número de prêmio F32-0DK122754. Este trabalho foi apoiado, em parte, pelo National Institutes of Health (5SC1DK122578) e pelo Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade do Texas em San Antonio. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do National Institutes of Health. As figuras foram parcialmente criadas com Biorender.com.

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</ol>

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

O campo da engenharia do tecido adiposo marrom/bege é em grande parte imaturo 22,23,24,25,26,27,28, com a maior parte dos modelos adiposos sendo desenvolvidos para o tecido adiposo branco 8,22,31. M...

O objetivo deste protocolo é descrever uma abordagem para o desenvolvimento de tecido adiposo bege vascularizado a partir de uma única fonte potencialmente autóloga, o fragmento microvascular (MVF). Demonstrou-se que os tecidos adiposos marrom e bege exibem propriedades benéficas relacionadas à regulação metabólica; entretanto, o pequeno volume desses depósitos de tecido adiposo em adultos limita o potencial impacto sobre o metabolismo sistêmico, particularmente em condições de doenças como obesidade ou diabetes tipo 21,2,3,4,5,6,7. Há significativo interesse na gordura marrom/bege como alvo terapêutico para a prevenção dos efeitos metabólicos deletérios associados à obesidade e suas comorbidades 8,9,10,11,12.
As FVM são estruturas vasculares que podem ser isoladas diretamente do tecido adiposo, cultivadas e mantidas em uma configuração tridimensional por longos períodos de tempo13,14,15. Trabalhos anteriores de nosso grupo, entre outros, começaram a explorar a capacidade multicelular e multipotente das MVFs, especificamente no que se refere à formação de tecido adiposo16,17,18. Como um acúmulo deste trabalho, demonstramos recentemente que MVFs derivados de modelos de roedores com diabetes tipo 2 esaudáveis19 e de indivíduos humanos (adultos com mais de 50 anos de idade)20 continham células capazes de serem induzidas a formar tecido adiposo termogênico, ou bege.
Trata-se de uma abordagem inovadora a partir da qual se utiliza uma única fonte de FMV, capaz não só de criar tecido adiposo bege, mas também de seu componente vascular associado e crítico21. O uso dessa técnica pode ser de grande valia para estudos que buscam uma abordagem simples de engenharia tecidual para a formação de tecido adiposo termogênico. Ao contrário de outros métodos que aspiram a manipular tecido adiposo bege 22,23,24,25,26,27,28, o processo descrito neste estudo não requer o uso de múltiplos tipos celulares ou regimes complexos de indução. Modelos vascularizados de gordura bege e branca podem ser criados com MVFs provenientes de fontes de roedores e humanos, demonstrando grande potencial de tradução. O produto final deste protocolo é um tecido adiposo termogênico bege projetado com uma estrutura e função metabólica comparáveis ao tecido adiposo marrom. De modo geral, este protocolo apresenta a ideia de que uma FMVM de fonte facilmente acessível e possivelmente autóloga pode ser uma intervenção terapêutica e uma ferramenta valiosa para o estudo de distúrbios metabólicos.

<table><tbody><tr><td>Ácido aminocapróico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2504-100G</td><td>Adicionado em DMEM na concentração de 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Tesoura de ponta romba</td><td>Fisher scientific</td><td>12-000-172</td><td>Esterilizar em autoclave</td></tr><tr><td>Bovin Serum Albumina (BSA)</td><td>Millipore</td><td>126575-10GM</td><td>Diluído em PBS a 4 mg/mL e 1 mg/mL</td></tr><tr><td>de colagenase tipo 1</td><td>Fisher scientific</td><td>NC9633623</td><td>Diluído a 6 mg/mL em BSA 4 mg/mL, Digestão de gordura picada</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC230302500</td><td>Diluído em etanol a uma concentração de estoque de 2 mg/ml</td></tr><tr><td>Absorventes descartáveis</td><td>Fisher scientific</td><td>23-666-062</td><td>Para absorção de fluidos durante</td></tr><tr><td>a cirurgia Tesoura de dissecação</td><td>Fisher scientific</td><td>08-951-5</td><td>Esterilizar em autoclave</td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Águia Modificada&prime; s Medium (DMEM)</td> <td>Fisher scientific</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Águia Modificada&prime; s Mistura Média/Nutriente F-12 Ham (DMEM/F12)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8062</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino&nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>16140089</td><td>Adicionado em DMEM a 20% v/v.</td></tr><tr><td>Fibrinogênio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630-25G</td><td>Solubilizado em DMEM na concentração de 20 mg/mL, Proteína encontrada no plasma sanguíneo e principal componente do hidrogel</td></tr><tr><td>Frasco, 250 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>FB500250</td><td>Permite a digestão da gordura usando uma grande área de superfície</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fisher scientific</td><td>50-264-21</td><td>Esterilizar em autoclave, Para manuseio de tecidos e filtros</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>Diluído em etanol a uma concentração de estoque de 10 mM</td></tr><tr><td>MVF humano</td><td>Advanced Solutions Life Scienes, LLC</td><td>https://www.advancedsolutions.com/microvessels</td><td>MVFs humanos (hMVFs) isolados de três pacientes diferentes (mulheres de 52, 54 e 56 anos) foram usados no estudo atual.</td></tr><tr><td>Indometacina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I7378</td><td>Diluído em etanol a uma concentração estoque de 12,5 mM</td></tr><tr><td>Insulina do pâncreas suíno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5523</td><td>Diluído em HCl 0,01 N a uma concentração estoque de 5 mg/ml</td></tr><tr><td>MycoZap</td><td>Fisher scientific</td><td>NC9023832</td><td>Adicionado em DMEM a 0,2% p/v, Mycoplasma Prophylactic;</td></tr><tr><td>Pennycilin/Streptomycin (10.000 U/mL)</td><td>15140122 científica de Fisher</td><td></td><td>Adicionado em DMEM a 1% v/v.</td></tr><tr><td>Placas de Petri, poliestireno (100 mm x 15 mm).</td><td>Fisher scientific</td><td>351029</td><td>3 para remoção de vasos sanguíneos e picagem, 8 (tampa) para pré-imersão de telas e 8 (prato) para uso ao filtrar com 500 ou 37 &micro; M peneiras</td></tr><tr><td>de placas de Petri, poliestireno (35 mm x 10 mm).</td><td>Fisher scientific</td><td>50-202-036</td><td>Para contagem de fragmentos</td></tr><tr><td>Tampão fosfato salino (PBS)</td><td>Fisher scientific</td><td>14-190-250</td><td>Diluído a 1x com água deionizada estéril.</td></tr><tr><td>Aparadores de Rato (Aparador de Animais de Estimação Mini Arco Andwin)</td> <td>Fisher scientific</td><td>NC0854141</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Fisher scientific</td><td>R0106200MG</td><td>Diluído em DMSO a uma concentração de estoque de 10 mM</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14059-11</td><td>1 para incisão inicial, 1 para incisão epididimal, 1 para recorte de ponta</td></tr><tr><td>Tela&nbsp; 37 &micro; M&nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>652222R</td><td>Cortado em quadrados arredondados de 3" e esterilizado em óxido de etileno, aprisionamento de fragmentos e remoção de fragmentos muito pequenos/células únicas e detritos</td></tr><tr><td>Tela 500 &micro; M&nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>652222F</td><td>Cortado em quadrados arredondados de 3" e esterilizado em óxido de etileno, Remove fragmentos/detritos</td></tr><tr><td>maiores Hemostat serrilhado</td><td>Fisher scientific</td><td>12-000-171</td><td>Esterilizar em autoclave, Para fixação da pele antes da incisão</td></tr><tr><td>Filtro Steriflip 0.22 &mu; m&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Fisher scientific</td><td>6051601KU</td><td>Diluído em água deionzada a 10 U/mL, Usado como agente de coagulação transformando fibrinogênio em fibrina</td></tr><tr><td>Hormônio tireoidiano (T3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2877</td><td>Diluído em 1N NaOH a uma concentração estoque de 0,02 mM</td></tr><tr><td>Ratos diabéticos gordurosos (ZDF) - obesos (FA/FA) ou magros (FA/+) masculinos&nbsp;</td><td>Charles River</td><td>https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611</td><td>Obtido de Charles River (Wilmington, MA). Os ratos foram adquiridos com 4 semanas de idade e alimentados com Purina 5008 até a eutanásia (15-19 semanas de idade). Os níveis de glicose (sangue da veia safena lateral) foram superiores a 300 mg/dL em todos os ratos FA/FA utilizados no estudo. Todos os animais foram alojados em ambiente com temperatura controlada com ciclo claro-escuro de 12 h e alimentados ad libitum.</td></tr></tbody></table>

cultura tridimensional de tecido adiposo termogênico vascularizado a partir de fragmentos microvasculares

Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

A engenharia do tecido adiposo termogênico (por exemplo, tecido adiposo bege ou marrom) tem sido investigada como uma terapia potencial para doenças metabólicas ou para o design de microtecidos personalizados para triagem de saúde e testes de drogas. As estratégias atuais são frequentemente bastante complexas e falham em retratar com precisão as propriedades multicelulares e funcionais do tecido adiposo termogênico. Fragmentos microvasculares, pequenos microvasos intactos constituídos por arteríolas, vênulas e capilares isolados do tecido adiposo, servem como uma única fonte autóloga de células que permitem a vascularização e a formação de tecido adiposo. Este artigo descreve métodos para otimizar as condições de cultura para permitir a geração de tecido adiposo termogênico tridimensional, vascularizado e funcional a partir de fragmentos microvasculares, incluindo protocolos para isolamento de fragmentos microvasculares do tecido adiposo e condições de cultura. Adicionalmente, as melhores práticas são discutidas, assim como as técnicas de caracterização dos tecidos modificados, e resultados de amostras de fragmentos microvasculares de roedores e humanos são fornecidos. Essa abordagem tem potencial para ser utilizada para o entendimento e desenvolvimento de tratamentos para obesidade e doenças metabólicas.

Existem algumas características morfológicas fenotípicas importantes do tecido adiposo bege/marrom: é multilocular/contém pequenas gotículas lipídicas, possui um grande número de mitocôndrias (a razão de sua aparência caracteristicamente "acastanhada" in vivo), correspondentemente tem uma alta taxa de consumo de oxigênio/bioenergética mitocondrial, é altamente vascularizado, tem aumento da lipólise/captação de glicose estimulada por insulina e, mais notoriamente, expressa altos níveis de proteína desacopladora ...

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado delineando o uso de fragmentos microvasculares isolados de tecido adiposo humano ou de roedores como uma abordagem direta para a engenharia de tecido adiposo bege vascularizado funcional.

Cultura Tridimensional de Tecido Adiposo Termogênico Vascularizado a partir de Fragmentos Microvasculares

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

Este protocolo descreve a geração de gordura termogênica tridimensional vascularizada e funcional a partir de fragmentos microvasculares, ou MVFs. As estratégias atuais de engenharia de tecido adiposo termogênico são complexas e não retratam completamente suas propriedades multicelulares e funcionais. As MVFs são uma fonte única de células que permitem a vascularização e a formação de tecido adiposo.Sendo um método simples de fonte única para criar imitações biológicas de gordura bege, os MVFs têm um potencial significativo para promover a compreensão ou o desenvolvimento de tratamentos para obesidade e doenças metabólicas. Colocar o animal adequadamente tricotelado e eutanasiado tratado com etanol 70% em decúbito dorsal e iniciar o isolamento da gordura inguinal. Levante a pele abaixo do pênis com uma tesoura e realize a incisão, começando pelo centro e cortando lateralmente, formando um formato de V, antes de fazer um loop até a parte de trás do animal para acessar todo o depósito de gordura.Durante o corte, garanta a separação da pele da gordura cortando o tecido da fáscia interconectado. Uma vez que a fáscia é adequadamente cortada, certifique-se de que a gordura inguinal de ambos os lados, estendendo-se da virilha para trás, é visível. Em seguida, retire a gordura dos dois lados em tubos cônicos separados contendo 10 mililitros de BSA em PBS, com uma concentração de um miligrama por mililitro.Para colher a gordura epididimal, corte através da pele abdominal, seguido de cortar cuidadosamente a fina camada que envolve os testículos. Puxe suavemente o tecido adiposo usando pinças e corte-o usando tesoura, evitando a dissecção de quaisquer vasos sanguíneos visíveis importantes. Agora, coloque a gordura removida em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de um miligrama por mililitro BSA em PBS.Para isolar a gordura subcutânea posterior, vire o rato de bruços e use uma tesoura grande para cortar a pele grossa das costas até o couro cabeludo, tomando cuidado para não cortar muito fundo abaixo da pele. Corte a fáscia que liga a pele ao tecido. Diferenciar a gordura subcutânea, localizada na região intraescapular, da gordura marrom localizada mais próxima à coluna vertebral antes de isolar e colocar a gordura subcutânea em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de um miligrama por mililitro de SC em PBS.Enquanto estiver trabalhando dentro de um biohood, use fórceps para colocar a gordura excisada em uma placa de Petri padrão de 100 mililitros contendo 0,5 mililitros de um miligrama por mililitro de BSA em PBS. Remova quaisquer vasos sanguíneos visíveis, músculos ou tecido estranho da gordura. Usando uma tesoura, pique a gordura por 10 minutos e verifique se há caroços adicionando um pouco mais de BSA.Continue picando, se necessário, antes de transferir a suspensão de gordura picada para um balão estéril de 250 mililitros com uma pipeta de 10 mililitros. Aumentar o volume no frasco até 20 mililitros adicionando BSA suficiente em PBS. Agora adicione BSA em PBS à colagenase e homogeneize a solução agitando-a suavemente antes de filtrá-la estéril através de um filtro líquido de nylon de 0,22 mícron.Adicione imediatamente a quantidade necessária de solução de colagenase à suspensão de gordura picada e digerir a gordura agitando o balão em movimento circular em banho-maria a 37 graus Celsius durante o período de tempo adequado. Transfira a gordura digerida para um tubo cônico de 50 mililitros rotulado como gordura digerida ou gordura picada. Centrifugar o tubo a 400 G por quatro minutos para girar os fragmentos microvasculares, ou MVFs, em uma pastilha vermelha.Decantar suavemente o sobrenadante em um tubo cônico de 50 mililitros rotulado como resíduo sem perturbar o pellet. Em seguida, adicione 10 mililitros de um miligrama por miligrama de BSA em PBS ao tubo que contém o pellet e misture a suspensão do pellet pipetando-o suavemente para cima e para baixo duas vezes sem interromper os fragmentos. Agora, pegue a tela de 500 mícrons pré-embebida em uma placa de Petri estéril contendo cinco mililitros de um miligrama por mililitro BSA em PBS e coloque-a sobre o suporte de tela de plástico mantido em uma nova placa de Petri.Pipetar 10 mililitros de suspensão do tubo de pellet digerido para a tela em círculos concêntricos. Lave o filtro com mais cinco mililitros de um miligrama por mililitro de BSA em PBS e elimine-o, mantendo o filtrado dentro da placa de Petri. Em seguida, coloque a tela pré-embebida de 37 mícrons acima do suporte de tela de plástico em uma nova placa de Petri.Usando uma pipeta fresca, transfira o filtrado da primeira filtração para a tela em círculos concêntricos. Como descrito anteriormente, lave a tela com BSA em PBS e, desta vez, descarte o filtrado mantendo a tela de 37 mícrons. Deslize a tela de 37 mícrons em uma nova placa de Petri contendo cinco mililitros de um miligrama por mililitro BSA em PBS.Desalojar os fragmentos batendo suavemente o prato contra um suporte cônico, sem derramar nenhum líquido. Enxaguar o filtro com mais cinco mililitros de BSA em PBS. Em seguida, transfira o líquido da placa de Petri para um tubo cônico estéril de 50 mililitros.Enxágue a tela de 37 mícrons várias vezes, adicionando a lavagem ao tubo cônico até que o volume total coletado seja de 15 a 20 mililitros. Descarte a tela após o enxágue final. Corte a extremidade de uma ponta de pipeta de 20 microlitros usando uma tesoura.Agite suavemente o tubo que contém o líquido antes de retirar duas alíquotas de 20 microlitros usando a ponta da pipeta cortada e pipetar cada uma das alíquotas em uma placa de Petri limpa de 35 milímetros. Contar o número de fragmentos da amostra em cada placa de Petri utilizando um microscópio de luz padrão e, utilizando a fórmula mencionada no manuscrito, obter o número total de fragmentos microvasculares isolados. Gire o líquido restante no tubo cônico de 50 mililitros a 400 G por quatro minutos para coletar a FMV.Após a fiação, decantar a maior parte do sobrenadante do tubo cônico e usar uma pipeta para remover o pequeno volume de líquido remanescente na borda do tubo. Em seguida, adicione trombina nos orifícios designados para fundição de géis. Corte a extremidade de uma ponteira de pipeta de 200 microlitros e, usando-a, ressuspenda suavemente as MVFs em fibrinogênio para obter a densidade final desejada.Pipetar a suspensão para a solução de trombina no poço e homogeneizar rapidamente a mistura pipetando para cima e para baixo. Depois que todos os géis estiverem fundidos, coloque a placa do poço em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por cerca de 15 minutos para permitir a reticulação do gel. Os lipídios e os adipócitos diferenciados foram observados por microscopia confocal dos hidrogéis usando BODIPY como coloração lipídica.A cultura de tecido adiposo não vascularizado usando meios adipogênicos brancos ou beges resultou na formação de tecido adiposo branco ou bege não vascularizado, respectivamente, tanto de MVFs magros quanto de roedores diabéticos. Da mesma forma, a cultura de tecido adiposo vascularizado usando meios adipogênicos brancos ou beges resultou na formação de tecido adiposo branco ou bege vascularizado, respectivamente, a partir das MVFs derivadas de roedores.A capacidade das MVFs de se diferenciarem em tecido adiposo bege foi geneticamente confirmada usando RT-qPCR. MVFs de roedores magros e diabéticos expostos a meios adipogênicos brancos diretos ou beges foram avaliados quanto à adipogênese, termogênese e angiogênese. A expressão da proteína desacopladora 1, como esperado, foi significativamente maior no tecido adipogênico bege.Uma tendência semelhante foi observada em MVFs de roedores expostos a meios adipogênicos brancos ou beges indiretos, bem como em MVFs humanos expostos a meios adipogênicos brancos diretos ou beges. Por fim, a partir da bioenergética mitocondrial, ficou evidente que, funcionalmente, o tecido adiposo bege apresentou taxa de consumo de oxigênio caracteristicamente mais elevada, ou OCR, em todos os casos. A digestão enzimática do tecido adiposo deve ser otimizada para reproduzir consistentemente MVFs de tamanho e qualidade semelhantes.Após a digestão, os MVFs devem ser manuseados suavemente, com cuidado especial para evitar a quebra dos fragmentos. Essa técnica auxiliou no equilíbrio do crescimento vascular e na diferenciação dos adipócitos, comprovadamente dependentes dos fatores introduzidos.

three-dimensional-culture-vascularized-thermogenic-adipose-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Isolamento, Cultura e Indução Adipogênica de Pré-adipócitos Derivados da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Periaórtico de Camundongos

Aqui, descrevemos um protocolo para isolar, cultivar e fenotipar células endoteliais microvasculares do tecido adiposo subcutâneo humano (hSATMVECs). Além disso, descrevemos um modelo experimental de diafonia hSATMVEC-adipócitos.

Estudando a conversa cruzada de células endoteliais adiposas/adipócitos no tecido adiposo subcutâneo humano

Aprenda a criar tecido adiposo termogênico vascularizado em 3D a partir de fragmentos microvasculares. Este método simplificado utiliza MVFs como fonte única de células para engenharia de tecido adiposo bege funcional.

Cultura Tridimensional de Tecido Adiposo Termogênico Vascularizado a partir de Fragmentos Microvasculares

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