Name: Um inserto inovador impresso em 3D projetado para permitir culturas de células 2D e 3D diretas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprenda a usar um inserto impresso em 3D para culturas celulares 2D e 3D diretas. Este método facilita a comunicação intercelular entre queratinócitos e células endoteliais, aumentando a proliferação e migração celular.

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Este estudo foi realizado em colaboração com a BASF Beauty Care Solutions. A Sra. Charlie Colin-Pierre é bolsista de doutorado financiada pela BASF/CNRS.
Agradecemos ao Sr. Mehdi Sellami pela concepção dos encartes impressos em 3D.

NOTA: Os insertos 3D (Figura 1A) são adquiridos comercialmente e impressos usando uma resina fotopolimérica que é biocompatível com cultura de células e autoclavagem (consulte a Tabela de Materiais). Nesta seção, um protocolo detalhado para estabelecer o modelo de co-cultura por inserções é descrito (ver Figura 1B). Alguns exemplos de aplicações também são fornecidos.
1. Colocação da pastilha esterilizada nas placas de 6 poços
<ol><li>Misturar os dois componentes fornecidos no kit (ver Tabela de Materiais), silício alimentar (reagente A) e catalisador (reagente B), numa proporção de 10:1 (v/v) de acordo com as instruções do fabricante. (Figura 1B). Use uma espátula esterilizada a etanol 70% para misturar os dois componentes. NOTA: O volume da mistura de silicone a ser preparada depende do número de pastilhas a serem fixadas. Um excesso de catalisador pode fazer com que a mistura de silício se solidifique muito rápido.</li>
	<li>Aplicar as pastilhas sobre a mistura de silicone com uma pinça de modo que a mistura seja homogeneamente distribuída na borda inferior das pastilhas (Figura 1Bb). Coloque as pastilhas nos orifícios de uma placa de 6 poços e aplique uma pressão suave sobre as pastilhas para garantir que as pastilhas estejam em contato próximo com a placa para evitar qualquer vazamento do meio de cultura celular (Figura 1Bc).</li>
	<li>Colocar a placa a 37 °C para apoiar o processo de solidificação do silício durante 1 h. NOTA: O tempo de solidificação depende da quantidade de catalisador que foi adicionada.</li>
	<li>Após a solidificação, esterilizar as placas com as pastilhas imergindo-as em banho de etanol 70% por 30 min a 1 h.</li>
	<li>Descarte o álcool por pipetagem e deixe a placa secar (tampa aberta) durante a noite em uma capa de cultura celular. NOTA: O álcool deve ser totalmente evaporado antes de realizar o próximo passo para evitar a fixação celular e toxicidade. A placa pronta para uso contendo as pastilhas pode ser armazenada por vários dias antes do uso em condições secas e estéreis à temperatura ambiente.</li>
</ol>2. Revestimentos como poli-L-lisina, ou poli-HEMA (etapa opcional)
OBS: O revestimento não é realizado neste experimento, e são fornecidas as etapas para informar quanto à possibilidade de revestimento dos insertos.
<ol><li>Prepare a solução de revestimento de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Considere um volume de 200-400 μL para os compartimentos maiores e um volume de 50-100 μL para os compartimentos menores para o revestimento da pastilha. Adicione a solução de revestimento aos compartimentos individuais.</li>
	<li>Deixe o revestimento secar conforme indicado pelo fabricante em condições estéreis.</li>
</ol>3. Semeadura das células
<ol><li>Cultivar os queratinócitos da bainha radicular externa (KORS) e as células endoteliais microvasculares dérmicas humanas (HDMECs), conforme recomendação do fabricante. Prepare a suspensão celular assim que as células atingirem a confluência.<ol><li>Eliminar o meio dos frascos e adicionar 5 ml de tripsina para separar as células (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Colocar o balão contendo o KORS a 37 °C com 5% de CO2 durante 5 min. Incubar o balão contendo os HDMECs durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Misturar a solução de tripsina contendo o KORS com 5 mL de meio de células-tronco mesenquimais (CTMM) suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB) e fatores de crescimento (meio basal com kit suplementar, ver Tabela de Materiais). Misturar a solução de tripsina contendo os HDMECs com 5 mL de meio de célula endotelial (ECM) suplementado com 5% de SFB e fatores de crescimento (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Transfira as células para um tubo cônico estéril de 15 mL. Centrifugar as suspensões KORS e HDMEC a 200 x g por 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Eliminar o sobrenadante e ressuspender as células em 2 mL do respectivo meio.</li>
		<li>Misturar 10 μL da suspensão celular com 10 μL de corante azul de tripano (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Adicionar 10 μL da mistura à câmara da lâmina de contagem.</li>
		<li>Insira a lâmina de contagem no sistema de contagem de células (consulte Tabela de Materiais) e detecte o número de células e a viabilidade.</li>
		<li>Preparar a suspensão celular na concentração de 0,5 x 105 células/mL no respectivo meio. NOTA: Se os diferentes tipos celulares requerem diferentes tempos de aderência e/ou para atingir a confluência ideal, a semeadura celular pode ser feita em diferentes pontos de tempo de acordo com os tipos celulares.</li>
	</ol></li>
	<li>Distribuir 800 μL a 1 mL da suspensão celular nos grandes compartimentos individuais e 100-150 μL nos pequenos compartimentos individuais com uma pipeta.<ol><li>Semeando o KORS a 1 x 10 5 células/mL em CTMM suplementada com5% de SFB e fatores de crescimento em um dos grandes compartimentos.</li>
		<li>HDMEC em ECM suplementada com 5% de SFB e fatores de crescimento a 2,5 x 103 células/mL nos compartimentos pequenos e a 1,25 x 105 células/mL no outro compartimento grande. NOTA: O ensaio de proliferação pode ser realizado nos pequenos compartimentos, e os ensaios de migração e viabilidade podem ser realizados nos grandes compartimentos. A concentração das células semeadas foi otimizada de acordo com as recomendações do fabricante. Esta concentração permite uma boa viabilidade das células após 24-48 h de incubação.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocar a placa de cultura celular a 37 °C com 5% de CO2 ou nas condições habituais para permitir a adesão e/ou maturação celular. NOTA: Incubar as células por 24-48 h sem alterar o meio. Se necessário, o meio dos compartimentos pode ser trocado independentemente.</li>
</ol>4. Implementação da co-cultura ( Figura 1Bd)
NOTA: A implementação da co-cultura corresponde ao momento em que o meio comum é adicionado. A adição de um meio único para todos os tipos celulares nos diferentes compartimentos proporciona a possibilidade de comunicação parácrina entre as células devido à presença de janelas de comunicação (orifícios ovoides nas paredes das pastilhas impressas em 3D). Para implementar a cocultura, siga as etapas 4.1-4.3.
<ol><li>Esvazie os meios de cultura dos diferentes compartimentos das pastilhas usando uma pipeta. No caso de uma cultura de células esferoides 3D, descarte o meio com muita delicadeza.</li>
	<li>Enxaguar as células com 1 mL de PBS aquecido a 37 °C nos compartimentos grandes e 200 μL de PBS aquecido a 37 °C nos compartimentos pequenos. Certifique-se de lavar suavemente para não desprender as células.</li>
	<li>Adicionar 3 mL de um meio comum selecionado para ser compatível com todos os tipos celulares. NOTA: Neste estudo, o ECM basal (sem SFB e fatores de crescimento) é usado. Certifique-se de que o meio cubra todos os compartimentos (nível acima das janelas de comunicação [orifícios ovoides nas paredes], como mostra a Figura 1A).</li>
	<li>Colocar a placa contendo as co-culturas a 37 °C com 5% de CO2 durante 24-48 horas.</li>
</ol>5. Observação, contagem e raspagem de células
<ol><li>Observar a morfologia e contar o número de células dos diferentes compartimentos durante o experimento em microscópio óptico após 24-48 h de incubação. NOTA: O número esperado de células depende dos tipos de células utilizadas (tamanho, morfologia, etc.) e do tamanho do compartimento. Neste experimento, entre 0,5 x 10 6-1 x 10 6 KORS/mL e entre 0,25 x 10 6-0,75 x 10 6 HDMECs/mL são contados nos grandes compartimentos.</li>
	<li>Destacar as células usando tripsina para contagem de suspensão celular. NOTA: Para a solução de descolamento celular, considere um volume de 100-500 μL para os compartimentos maiores e um volume de 10-50 μL para os compartimentos menores.</li>
	<li>Verificar a viabilidade utilizando a coloração azul de tripano (ver passos 3.1.6-3.1.8).</li>
</ol>6. Limpeza de pastilhas para reciclagem
<ol><li>Remova as pastilhas da placa de 6 poços no final do experimento por uma leve torção (Figura 1Be).</li>
	<li>Remova o silicone das pastilhas puxando-o. Se necessário, use uma espátula para remover o silicone restante preso às paredes dos insertos (Figura 1Bf).</li>
	<li>Lave as pastilhas com detergentes convencionais para cultura de células e materiais de limpeza (exemplo fornecido na Tabela de Materiais).</li>
	<li>Esterilizar as pastilhas para uso futuro em autoclave (ciclo sólido, 121 °C por 20 min) ou imergindo-as em banho de etanol 70% por 1 h. NOTA: A partir desta etapa, dois exemplos de ensaios possíveis (ensaios de proliferação e migração) são descritos usando os insertos impressos em 3D (Figura 1Bd).</li>
</ol>7. Ensaio de proliferação celular - ensaio WST-1
<ol><li>Siga as etapas 1-3.1 para cultivar as células. NOTA: Siga o passo nesta seção para implementar o sistema de co-cultura, a fim de investigar o efeito do secretoma KORS na proliferação de HDMEC. As células KORS são utilizadas para comparar os dados publicados anteriormente8.<ol><li>Semeando o KORS a 1 x 10 5 células/mL em meio de células-tronco mesenquimais (CTMM) suplementado com5% de SFB e fatores de crescimento nos grandes compartimentos.</li>
		<li>Colocar a placa de cultura celular a 37 °C com 5% de CO2 durante 24 horas.</li>
		<li>Semeando as HDMECs em meio de células endoteliais (ECM) suplementado com 5% de SFB e fatores de crescimento a 2,5 x 103 células/mL nos pequenos compartimentos.</li>
		<li>Colocar a placa de cultura celular a 37 °C com 5% de CO2 durante 24-48 horas.</li>
		<li>Eliminar o meio de todos os compartimentos e implementar o sistema de co-cultura pela adição de 3 mL de ECM basal não suplementado (meio de cultura celular comum para todos os compartimentos das pastilhas impressas em 3D).</li>
	</ol></li>
	<li>Diluir o WST-1 no meio de cultura de células comuns ECM (diluição final 1:10) para preparar a solução de WST-1. NOTA: Para o volume de solução WST-1, prepare pelo menos 500 μL de solução extra para o branco.</li>
	<li>Descarte o meio de cultura celular da inserção por pipetagem.</li>
	<li>Adicionar a solução WST-1 aos compartimentos seleccionados (150 μL para os compartimentos pequenos e 600 μL para os compartimentos grandes). Colocar a placa a 37 °C com 5% de CO2.</li>
	<li>Após o tempo ideal de incubação celular de 30 min, transfira 100 μL do meio de incubação de cada condição em uma placa de 96 poços.</li>
	<li>Avaliar a reação colorimétrica utilizando um leitor de microplacas entre 420 nm e 480 nm.<ol><li>Coloque a placa no leitor de microplacas e clique no botão editar um novo protocolo.</li>
		<li>Selecione o tipo específico de placa de 96 poços (consulte Tabela de Materiais) usada e o comprimento de onda de 450 nm.</li>
		<li>Clique no botão iniciar medição.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Ensaio de migração celular - dispositivo de duas câmaras de migração
<ol><li>Siga as etapas 1-3.1 para cultivar as células. NOTA: Siga as etapas nesta seção para implementar o sistema de co-cultura a fim de investigar o efeito do secretoma KORS na proliferação de HDMEC.<ol><li>Semeando o KORS a 1 x 10 5 células/mL em CTMM suplementada com5% de SFB e fatores de crescimento em um dos grandes compartimentos.</li>
		<li>Colocar a placa de cultura celular a 37 °C com 5% de CO2 durante 24 horas.</li>
		<li>Coloque o dispositivo de duas câmaras de migração no outro grande compartimento de inserções.</li>
		<li>Semeando os HDMECs em ECM suplementado com 5% de SFB e fatores de crescimento a 7 x 105 células/poço do dispositivo das duas câmaras de migração.</li>
		<li>Colocar a placa de cultura celular a 37 °C com 5% de CO2 durante 24 horas.</li>
		<li>Descarte a mídia e o dispositivo das duas câmaras de migração após 24 h ou em um momento ideal de acordo com o tipo de célula que está migrando. Implementar o sistema de co-cultura pela adição de 3 mL de ECM basal não suplementada. NOTA: Prossiga com cuidado para não desanexar as células. Se as células forem realmente sensíveis ao descolamento induzido pela adição de meio comum, retire o dispositivo de duas câmaras de migração após a adição do meio comum.</li>
	</ol></li>
	<li>Observe e tire uma foto da superfície coberta pelas células em diferentes momentos em um microscópio de contraste de fase com aumento de 10x. NOTA: As fotos são tiradas com um microscópio de contraste de fase (ver Tabela de Materiais). As imagens são salvas em uma chave USB e, em seguida, analisadas pelo plugin da ferramenta de cicatrização de feridas do software (consulte Tabela de Materiais).</li>
	<li>Meça a superfície descoberta usando um software clássico de análise quantitativa.<ol><li>Abra a imagem no software e ative a ferramenta de cicatrização de feridas disponível na lista de macros.</li>
		<li>Clique no botão m para medir a superfície descoberta da imagem de migração.</li>
		<li>A superfície descoberta é calculada de acordo com a seguinte fórmula: Porcentagem de cobertura = ([área média sem células em T0 − área sem células no tempo T]/área média sem células em T0) × 100. NOTA: As inserções impressas em 3D são totalmente adaptadas à maioria das técnicas de biologia celular (como o ensaio de formação de pseudotubos, culturas 3D) e para experimentos de bioquímica (como a extração de DNA, RNA, proteína).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+towards+understanding+heterotypic+interactions+in+multi-culture+models+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer.</a> Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).</li>
<li>Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+isolation+from+pulp+tissue+and+co-culture+with+cancer+cells+to+study+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58825(2019).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+UBE2CP3+enhances+HCC+cell+secretion+of+VEGFA+and+promotes+angiogenesis+by+activating+ERK1%2F2%2FHIF-1%CE%B1%2FVEGFA+signalling+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113(2018).</li>
<li>Soares, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide+modulation+of+microglia-neuron+communication%3A+Anti-neuroinflammatory+and+neurotrophic+role%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role.</a> Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).</li>
<li>Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropoelastin+promotes+the+formation+of+dense%2C+interconnected+endothelial+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks.</a> Biomolecules. 11 (9), 1318(2021).</li>
<li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+human+preclinical+model+of+osteoclastogenesis+from+peripheral+blood+monocytes+co-cultured+with+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), e56311(2017).</li>
<li>Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+effect+of+air+particles+exposure+induce+Nrf2-dependent+cardiomyocyte+cellular+response+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro.</a> Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).</li>
<li>Colin-Pierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glypican-1%2FHGF%2FC-met+and+glypican-1%2FVEGF%2FVEGFR2+ternary+complexes+regulate+hair+follicle+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172(2021).</li>
<li>Toubal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NC1+domain+of+type+XIX+collagen+inhibits+melanoma+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration.</a> European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).</li>
<li>Wu, A. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+growth+factors+and+internal+limiting+membrane+constituents+in+m%C3%BCller+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108352(2021).</li>
<li>Oudart, J. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+releases+the+anti-tumor+peptide+from+the+NC1+domain+of+collagen+XIX%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX.</a> Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).</li>
<li>Martinotti, S., Ranzato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratch+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2109, 225-229 (2020).</li>
<li>Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+in+vivo+validation+of+a+three-dimensional+multi-cellular+culture+model+to+study+heterotypic+interactions+in+colorectal+cancer+cell+growth%2C+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97(2018).</li>
<li>Ma, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+culture+of+adipose+stromal+vascular+cells+for+studying+adipogenesis+in+beef+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle.</a> Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

A comunicação celular indireta é comumente investigada usando meios condicionados ou dispositivos de sistemas de co-cultura. A preparação de meios condicionados é demorada a montante nos experimentos, e esse método é restrito a análises de efeitos unilaterais. O estudo anterior de Colin-Pierre et al.8 utilizando meios condicionados foi realizada a comunicação celular indireta entre dois tipos celulares (HDMECs e KORS). Os dados deste estudo anterior demonstraram o efeito do meio condicion...

In vivo, as células se comunicam entre si diretamente (contato celular) ou indiretamente (por secreção de moléculas). Para estudar a comunicação celular, diferentes modelos de co-cultura podem ser desenvolvidos, como o co-cultivo direto (os diferentes tipos celulares estão em interação direta no mesmo poço) e o co-cultivo compartimentado (os diferentes tipos celulares estão em interação indireta em diferentes compartimentos de um sistema de cultura)1. Além disso, meios condicionados podem ser usados para sistemas de co-cultura, onde a interação indireta é possibilitada por moléculas secretadas contidas no meio condicionado de um tipo de célula efetora sendo transferida para uma célula respondedora tipo1.
No caso de estudos de comunicação celular parácrina, sistemas de co-cultura indireta fornecem modelos que refletem fortemente as interações celulares in vivo. Sistemas de cocultura indireta têm sido desenvolvidos e comercializados, permitindo o estabelecimento de modelos de cocultura indireta 2,3. Infelizmente, a maioria dos sistemas de co-cultura indireta fornece apenas dois compartimentos. Outros sistemas de co-cultura indireta fornecem múltiplos compartimentos, mas são menos escaláveis em comparação com o sistema relatado no presente manuscrito. Alguns deles não permitem uma visualização clássica ao microscópio e, muitas vezes, apresentam métodos específicos de aplicação. Em vários estudos, a comunicação parácrina entre diferentes tipos celulares é investigada pelo modelo de meioscondicionados 4,5,6,7. Esta é uma maneira mais fácil de investigação em comparação com sistemas de co-cultura indireta, pois não requer métodos ou materiais específicos para serem estabelecidos1. Por outro lado, a preparação de meios condicionados é demorada e fornece informações apenas sobre a sinalização celular unidirecional (efetor para respondedor)1.
Neste artigo, uma nova e simples forma de investigar a comunicação celular é proposta. Permitindo a combinação de vários tipos celulares em interação direta ou indireta e em formatos 2D ou 3D, os insertos impressos apresentam inúmeras vantagens para a fácil montagem de modelos de co-cultura. Adaptado para ser colocado nos poços de placas de 6 poços, o inserto impresso em 3D é circular e permite a separação do poço em quatro compartimentos (dois grandes compartimentos e dois pequenos compartimentos; Figura 1A). As pastilhas impressas em 3D são caracterizadas pela ausência de um fundo. Assim, as células ficam em contato direto com a placa na qual a pastilha é colocada. Além disso, cada compartimento pode ser revestido independentemente dos outros. Além disso, o comportamento celular pode ser facilmente acompanhado em microscópios ópticos. A presença de janelas de comunicação em cada parede da pastilha permite a adição, no momento ideal, de um meio comum para realizar diferentes experimentos de co-cultura. Inúmeras combinações de co-cultura podem ser realizadas para estudar a comunicação direta e/ou indireta entre vários tipos celulares. Por exemplo, um modelo de co-cultura indireta entre quatro tipos diferentes de células em monocamada e/ou em 3D (esferoides) pode ser projetado. Uma combinação de modelos de co-cultura direta e indireta também pode ser realizada misturando diferentes tipos celulares no mesmo compartimento. O efeito de estruturas complexas (organoides, explantes teciduais, etc.) sobre diferentes tipos celulares poderia ser outro exemplo de modelos que podem ser feitos. Além disso, as inserções impressas em 3D são compatíveis com ensaios funcionais de biologia celular (proliferação, migração, formação de pseudotubos, diferenciação, etc.) e com testes bioquímicos (extração de DNA, RNA, proteínas, lipídios, etc.). Finalmente, os insertos impressos em 3D fornecem uma ampla gama de esquemas experimentais de modelos de co-cultura com a possibilidade de combinar simultaneamente diferentes ensaios no mesmo experimento nos diferentes compartimentos.
Algumas capacidades dos encartes impressos em 3D são apresentadas para validá-los como um modelo de co-cultura rápido e fácil de usar. Em comparação com um estudo publicado anteriormente sobre comunicação celular parácrina, a capacidade das pastilhas impressas em 3D de serem um valioso modelo de co-cultura é demonstrada. Para avaliar esse ponto, a regulação da proliferação e migração de células endoteliais pelos queratinócitos foi comparada entre o sistema de inserção impresso em 3D e o sistema clássico usando meios condicionados. Os insertos impressos em 3D permitem a obtenção de resultados semelhantes rapidamente em relação ao sistema convencional que utiliza meios condicionados. De fato, as pastilhas impressas em 3D fornecem um modelo robusto para estudar interações celulares em ambas as direções sem a necessidade de produzir meios condicionados e com a possibilidade de realizar em paralelo os ensaios de proliferação e migração em um mesmo experimento.
Para concluir, neste artigo, um novo modelo pronto para uso para estudar a comunicação celular é proposto. Compatíveis com todos os tipos celulares aderentes, as pastilhas impressas em 3D permitem realizar inúmeras combinações de co-cultura que visam estar mais próximas das condições in vivo .

<table><tbody><tr><td>Autoclave</td><td>Getinge</td><td>APHP</td><td>Ciclo sólido, 121 > C por 20 min</td></tr><tr><td>Biomed</td><td>Clear Formlabs</td><td>RS-F2-BMCL-01</td><td>Impressão realizada pela empresa 3D-Morphoz (Reims, França)</td></tr> <tr><td>Detergentes para cultura de células&nbsp;</td><td>Tounett</td><td>A18590/0116</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de Proliferação Celular WST-1</td><td>Roche</td><td>11,64,48,07,001</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de contagem</td><td>NanoEnTek</td><td>EVE-050</td><td></td></tr><tr><td>Culture-Insert 2 Well in &mu;-Dish 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>80206</td><td>dispositivo de câmaras de duas migrações.&nbsp;</td></tr><tr><td>Meio de células endoteliais</td><td>ScienCell</td><td>1001</td><td>Meio basal +/- 25 mL de soro fetal bovino (FBS, 0025), 5 mL de suplemento de crescimento de células endoteliais (ECGS, 1052) e 5 mL de solução de penicilina/estreptomicina (P/S, 0503).</td></tr><tr><td>EVE Contador de células automatizado</td><td>NanoEnTek</td><td>NESCT-EVE-001E&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Core</td><td>Fisher Scientific</td><td>AMEX1200</td><td>10x de ampliação Kit de</td></tr><tr><td>reagente e catalisador de silício alimentar</td><td>Artificina</td><td>RTV 3428 A e B&nbsp;</td><td>(10:1)</td></tr><tr><td>Impressora FORM 3B</td><td>Formlabs</td><td>PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC</td><td>Impressão realizada pela empresa 3D-Morphoz</td></tr><tr><td>Células Endoteliais Microvasculares Dérmicas Humanas (HDMEC)</td><td>ScienCell</td><td>2000</td><td></td></tr><tr><td>Queratinócitos da Bainha da Raiz Externa (KORS)</td><td>ScienCell</td><td>2420</td><td></td></tr><tr><td>Macro Ferramenta de Cicatrização de Feridas Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Software usado para a medição da superfície descoberta (para ensaios de migração)</td></tr> <tr><td>Meio de células-tronco mesenquimais&nbsp;</td><td>ScienCell</td><td>7501</td><td>Meio basal +/-25 mL de soro fetal bovino (FBS, 0025), 5 mL de suplemento de crescimento de células-tronco mesenquimais (MSCGS, 7552) e 5 mL de solução de penicilina/estreptomicina (P/S, 0503)</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas SPECTRO star NANO</td><td>BMG Labtech BMG</td><td></td><td>Software LABTECH</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Promocell</td><td>C-40232</td><td>Sem Ca2+ / Mg2+</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>NanoEnTek</td><td>EBT-001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina / EDTA</td><td>Promocell</td><td>C-41020</td><td>Incubação de KORS a 37 &graus; C com 5% de CO2 por 5 min. Incubação de HDMECs por 5 min em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Placa de 96 poços Nunclon Delta Surface</td><td>Thermoscientific</td><td>167008</td><td></td></tr></tbody></table>

um inserto inovador impresso em 3d projetado para permitir culturas de células 2d e 3d diretas

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

As análises clássicas da comunicação indireta entre diferentes tipos celulares requerem o uso de meios condicionados. Além disso, a produção de meios condicionados permanece demorada e distante de condições fisiológicas e patológicas. Embora alguns modelos de co-cultura estejam comercialmente disponíveis, eles permanecem restritos a ensaios específicos e são principalmente para dois tipos de células. 
Aqui, são usados insertos impressos em 3D que são compatíveis com inúmeros ensaios funcionais. A pastilha permite a separação de um poço de uma placa de 6 poços em quatro compartimentos. Uma ampla gama de combinações pode ser definida. Além disso, janelas são projetadas em cada parede dos compartimentos para que a comunicação intercelular potencial entre cada compartimento seja possível no meio de cultura de forma dependente do volume. Por exemplo, a comunicação intercelular parácrina pode ser estudada entre quatro tipos celulares em monocamada, em 3D (esferoides) ou combinando ambos. Além disso, uma mistura de diferentes tipos de células pode ser semeada no mesmo compartimento em formato 2D ou 3D (organoides). A ausência de fundo nos insertos impressos em 3D permite as condições usuais de cultura na placa, possível revestimento na placa que contém o inserto e visualização direta por microscopia óptica. Os múltiplos compartimentos oferecem a possibilidade de coletar diferentes tipos celulares de forma independente ou de utilizar, em cada compartimento, diferentes reagentes para extração de RNA ou proteínas. Neste estudo, uma metodologia detalhada é fornecida para usar o novo inserto impresso em 3D como um sistema de co-cultura. Para demonstrar várias capacidades deste modelo flexível e simples, ensaios funcionais de comunicação celular previamente publicados foram realizados nos novos insertos impressos em 3D e demonstraram ser reprodutíveis. As pastilhas impressas em 3D e a cultura celular convencional em meio condicionado levaram a resultados semelhantes. Em conclusão, o inserto impresso em 3D é um dispositivo simples que pode ser adaptado a inúmeros modelos de co-culturas com tipos celulares aderentes.

No presente trabalho, um sistema de co-cultivo otimizado foi descrito para obter dados robustos, confiáveis e significativos comparáveis aos métodos clássicos através do uso de meios condicionados. As inserções impressas em 3D mimetizam as condições do microambiente in vivo de diferentes tipos celulares em interação, superando as dificuldades e a demorada produção de meios condicionados a montante nos experimentos. Um estudo publicado anteriormente foi reconduzido para analisar as interações indiretas entre dois...

Neste artigo, um novo inserto impresso em 3D é apresentado como um modelo de co-cultura e validado através do estudo da comunicação intercelular parácrina entre células endoteliais e queratinócitos.

Um inserto inovador impresso em 3D projetado para permitir culturas de células 2D e 3D diretas

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...

Este protocolo pode ser usado para investigar numerosos estudos de cultura e fornecer uma nova ferramenta para investigar a comunicação celular direta. Este novo dispositivo economiza tempo significativo no estabelecimento de um modelo de cultura e é aplicável a diferentes tipos de células que requerem um revestimento específico ou não. De fato, os quatro compartimentos das inserções impressas em 3D permitem cultivar diferentes tipos de células em monocamada, ou em 3D da mesma forma com diferentes combinações.As pastilhas impressas em 3D são mais duráveis, flexíveis, escaláveis e podem ser usadas para projetar modelos experimentais para estudos de fisiopatologias, como imunologia ou androgênese. Para começar, misture os dois componentes, silício alimentar e catalisador fornecidos no kit na proporção de 10:1, usando uma espátula esterilizada a etanol 70% de acordo com as instruções do fabricante. Aplique as pastilhas sobre a mistura de silicone com uma pinça para que a mistura seja distribuída homogeneamente na borda inferior da pastilha.Coloque as pastilhas nos orifícios de uma placa de seis poços e aplique uma pressão suave para garantir que as pastilhas estejam em contato próximo com a placa para evitar qualquer vazamento do meio de cultura celular. Coloque a placa a 37 graus Celsius para apoiar o processo de solidificação do silício por uma hora. Após a solidificação, esterilizar as placas com as pastilhas, imergindo-as em banho de etanol 70% por 30 minutos a uma hora.Em seguida, descarte o álcool por pipetagem e deixe a placa secar durante a noite em uma capa de cultura celular. Para cultivar os queratinócitos da bainha radicular externa e as células endoteliais microvasculares dérmicas humanas, descartar o meio dos frascos e adicionar cinco mililitros de tripsina para desprender as células. Colocar o balão contendo os queratinócitos da bainha radicular externa a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5% durante cinco minutos e incubar o balão contendo as células endoteliais microvasculares humanas dérmicas durante cinco minutos à temperatura ambiente.Em um tubo cônico estéril de 15 mililitros, misturar a solução de tripsina contendo os queratinócitos da bainha radicular externa com cinco mililitros de meio de células-tronco mesenquimais suplementado com 5% de SFB e fatores de crescimento e as células endoteliais microvasculares humanas com cinco mililitros de meio de células endoteliais suplementadas com 5% de SFB e fatores de crescimento. Centrifugar os queratinócitos da bainha radicular externa e as suspensões de células endoteliais microvasculares dérmicas humanas a 200 G por cinco minutos à temperatura ambiente. Após descartar o sobrenadante, ressuspender as células em dois mililitros de seus respectivos meios.Misture 10 microlitros da suspensão celular com 10 microlitros de corante azul de tripano e adicione 10 microlitros da mistura na câmara da lâmina de contagem. Insira a lâmina de contagem no sistema de contagem de células e detecte o número e a viabilidade da célula. Depois de preparar a suspensão celular a uma concentração de 50.000 células por mililitro no respectivo meio, distribua 800 microlitros a um mililitro da suspensão celular nos grandes compartimentos individuais e 100 a 150 microlitros nos pequenos compartimentos individuais com uma pipeta.Veja os queratinócitos em meio de células-tronco mesenquimais suplementado com 5% FBS e fatores de crescimento e células endoteliais microvasculares humanas dérmicas em meio de células endoteliais, suplementado com 5% FBS e fatores de crescimento nos pequenos e outros grandes compartimentos. Colocar a placa de cultura celular a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono, ou nas condições usuais, para permitir a adesão e/ou maturação celular. Esvazie os meios de cultura dos diferentes compartimentos das pastilhas usando uma pipeta.Em seguida, lave as células com um mililitro de PBS quente de 37 graus Celsius nos grandes compartimentos e 200 microlitros nos pequenos compartimentos. Adicione três mililitros de um meio comum selecionado para ser compatível com todos os tipos de células. Colocar a placa contendo as co-culturas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante 24 a 48 horas.Separar as células usando tripsina para contagem de suspensão celular e verificar a viabilidade usando a coloração de azul de tripano. Após a observação da morfologia, conte o número de células dos diferentes compartimentos durante o experimento em microscópio óptico após 24 a 48 horas de incubação. Primeiro, remova as pastilhas da placa de seis poços no final do experimento por uma leve torção e, em seguida, remova o silício das pastilhas puxando-o.Lave as pastilhas com detergentes convencionais para cultura de células e materiais de limpeza. Em seguida, esterilize as pastilhas para uso futuro em autoclave ou mergulhando-as em banho de etanol 70% por uma hora. O fenótipo e a viabilidade celular foram comparados, onde 90% de viabilidade foi observada nos poços das placas dos seis poços, e a 91% foi observada nas pastilhas impressas em 3D para queratinócitos da bainha radicular externa.A viabilidade das células endoteliais microvasculares dérmicas humanas foi de 85% nos poços da placa de seis poços, enquanto 86% nas pastilhas impressas em 3D. As comunicações celulares indiretas entre queratinócitos e células endoteliais nas inserções impressas em 3D demonstraram que, na presença de queratinócitos nas inserções, a proliferação das células endoteliais microvasculares humanas aumentou significativamente em 1,5 vezes após 24 horas e em 3,1 vezes após 48 horas em comparação com o controle. No entanto, demonstrou-se que o queratinócito do meio de condição da bainha radicular externa aumenta significativamente a proliferação de células endoteliais microvasculares dérmicas humanas em 1,5 vezes após 24 horas e em 2,1 vezes após 48 horas.O modelo de co-cultura de pastilhas impressas em 3D foi testado para determinar o efeito dos queratinócitos na migração de células endoteliais microvasculares dérmicas humanas. Na condição controle, as células endoteliais migraram e cobriram aproximadamente 44% da área da ferida após 24 horas. Na presença de queratinócitos, observou-se um aumento significativo na migração de células endoteliais microvasculares dérmicas humanas, o que mostra que 43%67% e 99% da área da ferida foi coberta após três, 12 e 24 horas, respectivamente.Da mesma forma, a migração de HDMECs aumenta na presença de queratinócitos do meio de condição da bainha radicular externa. É fundamental garantir a vedação da pastilha à placa, a fim de evitar o vazamento do meio de células de um compartimento para outro. Diversas aplicações podem ser feitas, como proliferação, migração, ensaios de formação de sedativos de DNA, RNA, proteína e outras análises.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descrevemos uma plataforma baseada em chip para o cultivo tridimensional de células em micro-biorreatores. Um chip pode abrigar até 10 milhões. células que podem ser cultivadas sob condições estritamente definidas em relação ao fluxo de fluidos, etc tensão de oxigênio em um circuito de circulação estéril, fechado.

Chip baseado em Cultura de Células tridimensional em perfundidos Micro-biorreatores

Nós relatamos um dispositivo e um novo método para estudar células e embriões. células individuais são precisamente ordenados em matrizes microcavidade. Seu confinamento 3D é um passo para ambientes 3D encontrados em condições fisiológicas e permite a orientação organela. Ao controlar a forma da célula, esta configuração minimiza variabilidade relatados em ensaios convencionais.

Ordenando células individuais e único embriões em 3D Confinamento: Um novo dispositivo de alta Screening conteúdo

Em organismos multicelulares, os fatores solúveis secretados provocam respostas de diferentes tipos de células como resultado da sinalização parácrina. Os sistemas de co-cultura de inserção oferecem uma maneira simples de avaliar as mudanças mediadas por fatores solúveis secretados na ausência de contato célula-célula.

Desenvolvimento de um Sistema Insert Co-cultura de dois tipos celulares na ausência de célula-célula Contact

Aqui, descrevemos um protocolo rápido e flexível para a formação de esferoides de células 3D por meio da agregação celular. Isso é facilmente adaptado a vários tipos de células e é adequado para uso em uma variedade de aplicações, incluindo ensaios de migração celular, invasão ou anoikis, e para imagens e quantificação de interações célula-matriz.

Um Método celular agregação eficiente e flexível para 3D Spheroid Produção

Este protocolo descreve uma plataforma para a fabricação de anéis de tecido Self montado em tamanhos variáveis, usando um molde de plástico personalizado 3D-impresso. PDMS negativos são curados em molde 3D-impresso; Então a agarose é convertido nos negativos PDMS curados. As células são semeadas em poços de agarose resultante onde eles agregam em anéis de tecido.

Fabricação de poços de Agarose personalizado para a propagação de células e tecido anel Self-assembly usando moldes 3D-impresso

Desenvolvemos um modelo de câncer de mama heterogênea consistindo de células de tumor e fibroblasto imortalizadas incorporadas em um bioink de alginato/gelatina de bioprintable. O modelo recapitula o microambiente do tumor na vivo e facilita a formação de esferoides tumor multicelulares, produzindo insights sobre os mecanismos de condução tumorigênese.

Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D em Vitro sistemas modelo induzem a formação de esferoide de célula

Apresentamos um procedimento para controlar a forma de cluster inicial célula em uma matriz extracelular 3D para obter uma formação de padrão repetitivo. Um dispositivo cúbico contendo dois diferentes hidrogel é empregado para conseguir imagens multi-direcional para formação de padrão de tecido.

Controle de Cluster inicial célula 3D em um dispositivo de cubo híbrido Gel para formações padrão repetitivo

Nós descrevemos um método para construir dispositivos para a cultura 3D e a experimentação com pilhas e os organoids multicelular. Este dispositivo permite a análise de respostas celulares a sinais solúveis em microambientes 3D com gradientes quimioatrativos definidos. Os organóides são melhores do que as células únicas na detecção de entradas barulhentas fracas.

Análise 3D de respostas multicelulares a gradientes Quimioatrativos

Este trabalho apresenta um protocolo de fabricação para um novo tipo de substrato de cultura com centenas de microrecipientes por mm2, no qual organoides podem ser cultivados e observados por microscopia de alta resolução. Os protocolos de semeadura celular e imunocoloração também são detalhados.

Uma plataforma de alto rendimento para cultura e imagem 3D de organoides

Este estudo apresenta uma metodologia econômica e eficiente para gerar estruturas celulares 3D usando um sistema baseado em carimbos para criar micropoços em moldes de agarose. O sistema promove a formação de esferóides/organoides uniformes, melhorando assim as interações celulares. Essa abordagem reduz a variabilidade experimental e oferece suporte a aplicações em testes de medicamentos e engenharia de tecidos.

Geração de esferoides/organoides tridimensionais a partir de culturas de células bidimensionais usando um novo dispositivo de carimbo

Aprenda a usar um inserto impresso em 3D para culturas celulares 2D e 3D diretas. Este método facilita a comunicação intercelular entre queratinócitos e células endoteliais, aumentando a proliferação e migração celular.

Um inserto inovador impresso em 3D projetado para permitir culturas de células 2D e 3D diretas

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