Detecção de Células T Polifuncionais em Crianças Vacinadas com Encefalite Japonesa através da Técnica de Citometria de Fluxo
September 23rd, 2022
O presente protocolo combina estimulação ex vivo e citometria de fluxo para analisar perfis polifuncionais de células T (TPF) em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em crianças vacinadas com o vírus da encefalite japonesa (JEV). O método de detecção e o esquema de cores da citometria de fluxo de TPFs específicos do JEV foram testados para fornecer uma referência para estudos semelhantes.
O método de detecção e o esquema de cores da citometria de fluxo do TPFS específico do vírus da encefalite japonesa foram testados para fornecer uma referência para estudos semelhantes. A demonstração do procedimento será realizada por Linlin Zhang e Meng Zhang, dois alunos do nosso laboratório. Para começar, estimule os PBMCs do grupo de estimulação JEV com partículas concentradas inativadas de JEV por 16 horas a 37 graus Celsius na presença de anticorpos monoclonais, CD28 e CD49d, CD107a, GolgiPlug e monensina.
Em seguida, estimular os PBMCs do grupo controle sem partículas virais concentradas por 16 horas a 37 graus Celsius na presença de anticorpos monoclonais, CD28 e CD49d, CD 107a, GolgiPlug e monensina. Recolher a suspensão celular de cada grupo num tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar a 500 g durante cinco minutos à temperatura ambiente e remover o sobrenadante com uma pipeta.
Ressuspenda as células em 1 mililitro de PBS. Adicione corante de viabilidade fixável à suspensão celular e incube por 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. Centrifugar a 500 g à temperatura ambiente durante cinco minutos e remover o sobrenadante.
Depois de ressuspender as células em 1 mililitro de PBS, novamente, centrifugar a 500 g à temperatura ambiente por cinco minutos e descartar o sobrenadante como demonstrado anteriormente. Para realizar a coloração do marcador de superfície celular, ressuscite as células em 100 microlitros de PBS e adicione dois microlitros de cada anticorpo marcador de superfície à suspensão celular em cada tubo. Incubar os tubos durante 30 minutos à temperatura ambiente, protegendo-os da luz.
Centrifugar a 500 g durante cinco minutos e remover o sobrenadante como demonstrado anteriormente. Novamente, ressuspenda as células em um mililitro de PBS. Centrifugar a 500 g durante cinco minutos à temperatura ambiente e eliminar cuidadosamente o sobrenadante.
Para realizar a fixação e quebra da membrana, ressuspeite as células com 500 microlitros de solução fixadora que quebra a membrana e fixe as células por 20 minutos no escuro à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugar a 500 g durante cinco minutos e remover o sobrenadante. Depois de ressuspender as células em um mililitro de PBS, centrifugar por cinco minutos a 500 g à temperatura ambiente e remover o sobrenadante com cuidado, como demonstrado anteriormente.
Em seguida, ressuspenda as células em 100 microlitros de PBS e adicione dois microlitros de cada anticorpo de citocina à suspensão celular em cada tubo para coloração de citocinas intracelulares. Incubar os tubos por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Novamente, centrifugar a 500 g por cinco minutos e remover o sobrenadante como demonstrado anteriormente.
Mais uma vez, ressuspenda as células em um mililitro de PBS. Centrifugar a 500 g durante cinco minutos à temperatura ambiente e remover cuidadosamente o sobrenadante, tal como demonstrado anteriormente. Em seguida, adicione 500 microlitros de PBS para ressuspender as células.
Após o isolamento da amostra PBMC isoladamente, como demonstrado anteriormente, divida a suspensão celular em 12 partes iguais em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro descritos no manuscrito. Da mesma forma, após a adição dos marcadores de superfície celular e anticorpo de citocinas intracelulares, como demonstrado anteriormente, adicione 500 microlitros de PBS para ressuspender as células e o vórtice com baixa velocidade. Usando uma amostra não corada, ajuste o espalhamento para a frente, o espalhamento lateral e diferentes tensões de corante fluorescente, enquanto ajusta a compensação da citometria de fluxo para eliminar os sinais de contaminação entre os diferentes fluoróforos, usando as amostras de coloração única.
Desenhe um portão de polígono através da área de dispersão para a frente, gráfico de pontos da área de dispersão lateral para selecionar a população de linfócitos intacta, excluindo os detritos, e uma porta retangular através da área de dispersão para a frente, gráfico de pontos de largura de dispersão para a frente para selecionar as células únicas. Em seguida, desenhe um portão retangular através do gráfico de pontos de área de dispersão do lado morto e morto para selecionar as células vivas e um portão retangular através do gráfico de pontos da área de dispersão lateral CD3 para identificar o CD três células T positivas. Em seguida, desenhe uma porta quádrupla através do gráfico de pontos CD4, CD8 para identificar as células T CD4 positivas ou CD8 positivas e através do gráfico de pontos CD45RO, CD27 para subdividir as células T CD4 positivas ou CD8 positivas em MTC e TEM.
Depois de desenhar as portas de CD107a, interferon gama, fator de necrose tumoral alfa, interleucina 2 e micrófago proteína inflamatória um alfa do TCM ou MET das células T CD8 positivas ou CD4 positivas para determinar a frequência de diferentes padrões de resposta, respectivamente. Carregue as amostras na citometria sequencialmente. A estratégia de gating foi empregada para identificar o TCM ou MET de células T CD8 positivas ou CD4 positivas e seus subconjuntos usando a largura da área de dispersão para frente e, em seguida, o gráfico de pontos da área de dispersão lateral.
A caracterização polifuncional das respostas de células T CD4 positivas e CD8 positivas ao JEV indicou que níveis aumentados de CD107a, interferon gama, fator de necrose tumoral alfa e interleucina 2 foram detectados nas células TCM CD8 positivas das crianças vacinadas após estimulação JEV em comparação com aquelas em crianças não vacinadas. No entanto, o nível de macrófago inflamatório proteína um alfa não diferiu entre os dois grupos. Níveis mais elevados de CD107a e interferão gama foram detectados nas células TEM CD8 positivas do grupo vacinado sob estimulação JEV em comparação com o grupo não vacinado.
Considerando que o fator de necrose tumoral alfa, a interleucina 2 e a proteína inflamatória de macrófagos um alfa não foram significativamente elevados nessas células positivas. O antígeno JEV induziu com sucesso níveis mais elevados de CD107a, interferon gama, fator de necrose tumoral alfa e proteína inflamatória de macrófagos um alfa nas células TCM CD4 positivas do grupo vacinado em comparação com o grupo não vacinado. No entanto, a proporção de células positivas para interleucina 2 não diferiu entre os dois grupos sob estimulação JEV.
A proporção de células TEM CD107a positivas, interferon gama positivas e fator de necrose tumoral alfa positivas, sub-CD4 positivas no grupo vacinado foi maior na presença de JEV, do que no grupo não vacinado. A imunogenicidade das células T dos estímulos e as estratégias de correspondência de cores compatíveis são etapas críticas neste protocolo.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para analisar perfis de células T polifuncionais em células mononucleares do sangue periférico de crianças vacinadas contra o vírus da encefalite japonesa. Ele combina estimulação ex vivo com citometria de fluxo para avaliar as respostas das células T.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Citometria de Fluxo
- Infeções Virais
Fundo
- O vírus da encefalite japonesa (JEV) é uma causa significativa de encefalite viral.
- Entender as respostas das células T é crucial para o desenvolvimento de vacinas.
- Células T polifuncionais podem fornecer insights sobre respostas imunológicas.
- A citometria de fluxo permite uma análise detalhada dos perfis das células T.
Propósito do Estudo
- Analisar perfis de células T em crianças vacinadas.
- Estabelecer uma referência para estudos imunológicos similares.
- Avaliar a eficácia do método de detecção e esquema de cores da citometria de fluxo.
Métodos Utilizados
- Estimulação ex vivo de CPMCs com partículas inativadas e concentradas de JEV.
- Uso de anticorpos monoclonais (CD28, CD49d, CD107a) durante a estimulação.
- Incorporação de GolgiPlug e monensina para melhorar a detecção.
- Análise por citometria de fluxo para avaliar a funcionalidade das células T.
Principais Resultados
- Estimulação bem-sucedida de CPMCs demonstrada.
- A citometria de fluxo identificou efetivamente perfis de células T específicas para JEV.
- Os resultados fornecem uma base para futuros estudos sobre respostas de células T.
- Metodologia validada para uso em contextos de pesquisa similares.
Conclusões
- O protocolo é eficaz para analisar respostas de células T em populações vacinadas.
- A citometria de fluxo serve como uma ferramenta confiável para estudos imunológicos.
- Os resultados contribuem para a compreensão das respostas imunológicas ao JEV.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Quantitative detection of polyfunctional T cells using flow cytometry enables robust assessment of vaccine-induced cellular immunity in early discovery and translational research. This approach provides predictive confidence for immune protection by characterizing T cell quality and functional diversity, supporting risk-adjusted advancement of vaccine candidates. The method is directly relevant for portfolio decisions where immune correlates of protection are critical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of vaccine-induced T cell responses at the single-cell level for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by quantifying cytokine and degranulation marker expression in T cell subsets.
- Facilitates predictive confidence in immune correlates for candidate triage and prioritization.
Screening & Assay Development
- Establishes validated flow cytometry gating strategies for reproducible detection of polyfunctional T cells.
- Standardizes quantitative readouts for cytokine and chemokine production across experimental groups.
- Enables scalable screening of immune responses to different vaccine formulations or antigens.
Translational & Preclinical Research
- Aligns T cell functional profiling with translational biomarker strategies for immune memory and protection.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling cross-reactive immune response assessment.
- Provides mechanistic insights into long-term immune memory relevant for disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
This flow cytometry-based method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for vaccine and immunotherapy development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on T cell-mediated immunity and clarifies immune pathway activation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for immune function assays in candidate evaluation.
- Analytics: Provides multi-parametric measurements of cytokine, chemokine, and degranulation marker expression for comparative analysis.
- Translational Research: Enables alignment of functional T cell markers with immune protection endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable workflow for immune monitoring across vaccine and infectious disease programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in immune correlates and reduces mechanistic ambiguity in vaccine response.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable immune profiling workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by focusing on functional immune endpoints.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of vaccine and immunotherapy candidates based on robust immune readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, gating strategies, and multi-parametric data analysis.
- Needs access to advanced cytometry instrumentation and validated antibody panels.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and staining protocols.
- Adaptable to various model systems but may require optimization for different antigens or cell types.
- Dependent on careful compensation and gating to ensure accurate quantification of polyfunctional T cells.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Stimulation of PBMCs by Inactivated JEV Particles to Induce Cytokine Expression and Ex Vivo Intracellular Staining
4:28
Flow Cytometry Set-Up, Gating Strategy, and Data Analysis
6:56
Results: Flow Cytometry Analysis of Polyfunctional T Cell Profiles in PBMCs Within Japanese Encephalitis Virus Vaccinated Children
9:12
Conclusion
