Name: Imagem Intravital da Expressão de Proteínas Fluorescentes em Camundongos com Traumatismo Cranioencefálico de Crânio Fechado e Janela Craniana Usando um Microscópio de Dois Fótons (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprenda a visualizar respostas neuronais ao estresse mecânico em camundongos vivos após lesão cerebral traumática usando microscopia de dois fótons e janela craniana. Este método permite monitoramento longitudinal da expressão proteica em fases aguda e crônica.

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Agradecemos ao Dr. Miguel Sena-Esteves, da University of Massachusetts Chan Medical School, por presentear o vírus AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP, e a Debra Cameron, da University of Massachusetts Chan Medical School, por desenhar o esboço do crânio de camundongos. Agradecemos também aos membros atuais e passados dos laboratórios Bosco, Schafer e Henninger por suas sugestões e apoio. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa (W81XWH202071/PRARP) para DAB, DS e NH.

<ol><li>Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+traumatic+brain+injury+care+and+research%3A+a+report+from+the+National+Academies+of+Sciences%2C+Engineering%2C+and+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine.</a> JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).</li>
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<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice+triggers+a+slowly+developing+cascade+of+long-term+and+persistent+behavioral+deficits+and+pathological+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60(2021).</li>
<li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li>
<li>Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+and+FUS+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Neurology%22%5BJournal%5D)">TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).</li>
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<li>Henninger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+traumatic+axonal+injury+and+improved+functional+outcome+after+traumatic+brain+injury+in+mice+lacking+Sarm1%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1.</a> Brain. 139, 1094-1105 (2016).</li>
<li>Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+spreading+depression+denotes+concussion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Cortical spreading depression denotes concussion injury.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).</li>
<li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li>
<li>Kugler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-specific+expression+of+therapeutic+proteins%3A+evaluation+of+different+cellular+promoters+in+recombinant+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).</li>
<li>von Jonquieres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+promoter+selectivity+following+AAV-delivery+to+the+immature+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain.</a> PLoS One. 8 (6), 65646(2013).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li>
<li>Mostany, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+synaptic+dynamics+during+normal+brain+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered synaptic dynamics during normal brain aging.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).</li>
<li>Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+two-photon+imaging+of+the+neuroinflammatory+response+to+intracortical+implants+and+micro-vessel+disruptions+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice.</a> Biomaterials. 276, 121060(2021).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).</li>
<li>Isshiki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+synapse+remodelling+as+a+common+phenotype+in+mouse+models+of+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism.</a> Nature Communications. 5, 4742(2014).</li>
<li>Mondo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+analysis+of+juxtavascular+microglia+dynamics+and+interactions+with+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).</li>
<li>White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+gains+function+due+to+perturbed+autoregulation+in+a+Tardbp+knock-in+mouse+model+of+ALS-FTD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD.</a> Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).</li>
<li>Chou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+integrated+stress+response+reverses+cognitive+deficits+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).</li>
<li>Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+a+cranial+window+for+repeated+in+vivo+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (172), e62633(2021).</li>
<li>Foda, M. A., Marmarou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+diffuse+brain+injury+in+rats.+Part+II%3A+Morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization.</a> Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).</li>
<li>Flierl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+closed+head+injury+model+induced+by+a+weight-drop+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+of+anesthesia-specific+alterations+in+microglial+surveillance+and+photodamage-directed+motility+in+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421(2019).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Through-Intact-Skull+%28TIS%29+chronic+window+technique+for+cortical+structure+and+function+observation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22eLight%22%5BJournal%5D)">A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice.</a> eLight. 2 (1), 1-18 (2022).</li>
<li>Paveliev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+brain+trauma+in+mice+followed+by+longitudinal+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51559(2014).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+acute+cerebral+vascular+spasm+and+microthrombosis+after+mild+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 210(2020).</li>
<li>Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrecoup+injury+of+the+prefronto-thalamic+tract+in+a+patient+with+mild+traumatic+brain+injury%3A+A+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine%22%5BJournal%5D)">Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report.</a> Medicine. 99 (32), 21601(2020).</li>
<li>Courville, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+coup-contrecoup+injuries+of+the+brain%3B+a+critical+review+of+recent+experimental+studies+in+the+light+of+clinical+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+Los+Angeles+Neurological+Society%22%5BJournal%5D)">The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations.</a> Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).</li>
<li>Drew, L. B., Drew, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contrecoup-coup+phenomenon%3A+a+new+understanding+of+the+mechanism+of+closed+head+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurocritical+Care%22%5BJournal%5D)">The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury.</a> Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).</li>
</ol>

Não são declarados conflitos de interesse.

Neste estudo, a injeção de AAV, a administração de TCE e um cabeçote com implante de janela craniana foram combinados para análise de imagem longitudinal de neurônios marcados com EGFP dentro do córtex cerebral de camundongos (camadas IV e V) para observar os efeitos do TCE nos neurônios corticais. Este estudo observa que o local do TCE aqui escolhido, acima do hipocampo, fornece uma superfície relativamente plana e ampla para a implantação da janela craniana. Por outro lado, o crânio é relativamente estreito anteriormen...

O traumatismo cranioencefálico (TCE), que pode resultar de lesões esportivas, colisões de veículos e combates militares, é um problema de saúde mundial. O TCE pode levar a déficits fisiológicos, cognitivos e comportamentais, além de incapacidade ou mortalidadeao longo da vida 1,2. A gravidade do TCE pode ser classificada em leve, moderada e grave, sendo a grande maioria TCE leve (75%-90%)3. É cada vez mais reconhecido que o TCE, particularmente as ocorrências repetitivas de TCE, pode promover degeneração neuronal e servir como fatores de risco para várias doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Alzheimer (DA), esclerose lateral amiotrófica (ELA), demência frontotemporal (DFT) e encefalopatia traumática crônica (ETC)4,5,6. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes à neurodegeneração induzida por TCE permanecem obscuros e, portanto, representam uma área ativa de estudo. Para obter informações sobre como os neurônios respondem e se recuperam do TCE, um método para monitorar proteínas fluorescentemente marcadas de interesse, especificamente dentro dos neurônios, por imagens intravitais longitudinais em camundongos após TCE é descrito aqui.
Para tanto, este estudo mostra como combinar um procedimento cirúrgico para a administração de TCE de crânio fechado semelhante ao relatado anteriormente7,8, juntamente com um procedimento cirúrgico para implante de janela craniana para imagem intravital a jusante, como descrito por Goldey e cols.9. Notadamente, é inviável implantar uma janela craniana primeiro e, posteriormente, realizar um TCE na mesma região, pois o impacto da queda de peso que induz o TCE é suscetível de danificar a janela e causar danos irreparáveis ao camundongo. Portanto, esse protocolo foi desenhado para administrar o TCE e, em seguida, implantar a janela craniana diretamente sobre o local do impacto, tudo dentro da mesma sessão cirúrgica. Uma vantagem de combinar o TCE e o implante de janela craniana em uma única sessão cirúrgica é a redução do número de vezes que um camundongo é submetido à cirurgia. Além disso, permite monitorar a resposta imediata (ou seja, na escala de tempo de horas) ao TCE, em vez de implantar a janela em uma sessão cirúrgica posterior (ou seja, imagens iniciais iniciadas em uma escala de tempo de dias pós-TCE). A janela craniana e a plataforma de imagem intravital também oferecem vantagens sobre a monitorização de proteínas neuronais por métodos convencionais, como a imunomarcação de tecidos fixos. Por exemplo, menos camundongos são necessários para imagens intravitais, já que o mesmo camundongo pode ser estudado em vários pontos de tempo, em oposição a coortes separadas de camundongos necessárias para pontos de tempo discretos. Além disso, os mesmos neurônios podem ser monitorados ao longo do tempo, permitindo rastrear eventos biológicos ou patológicos específicos dentro da mesma célula.
Como prova de conceito, a expressão neurônio-específica da proteína fluorescente verde aumentada (EGFP) sob o promotor de sinapsina é demonstrada aqui10. Essa abordagem pode ser estendida para 1) diferentes tipos de células cerebrais utilizando outros promotores específicos de tipos celulares, como promotor de proteína básica de mielina (MBP) para oligodendrócitos e promotor de proteína glial fibrilar ácida (GFAP) para astrócitos11 , 2) diferentes proteínas-alvo de interesse pela fusão de seus genes com o gene EGFP e 3) co-expressão de múltiplas proteínas fundidas a diferentes fluoróforos. Aqui, o EGFP é embalado e expresso através da administração de vírus adenoassociado (AAV) através de uma injeção intracraniana. Um TCE de crânio fechado é administrado usando um dispositivo de queda de peso, seguido pelo implante de uma janela craniana. A visualização do EGFP neuronal é obtida através da janela craniana, usando microscopia de dois fótons para detectar a fluorescência do EGFP in vivo. Com o laser de dois fótons, é possível penetrar mais profundamente no tecido cortical com o mínimo de fotodano, permitindo repetidas imagens longitudinais das mesmas regiões corticais dentro de um camundongo individual por dias e até meses12,13,14,15. Em suma, essa abordagem de combinação de cirurgia de TCE com imagem intravital visa avançar no entendimento dos eventos moleculares que contribuem para a patologia da doença induzida por TCE16,17.

<table><tbody><tr><td>Escovas aplicadoras de precisão ajustável</td><td>Parkell</td><td>S379</td><td></td></tr><tr><td>BD seringa de insulina</td><td>BD</td><td>NDC/HRI #08290-3284-38</td><td>5/16 "x 31G</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue</td><td>NDC67618-151-17</td><td>incluindo 7,5% de iodopovidona</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>PAR Farmacêutica</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>Cefazolina</td><td>HIKMA Farmacêutica</td><td>NDC 0143-9924-90</td><td></td></tr><tr><td>Prato de mistura de cerâmica</td><td>Parkell</td><td>SKU: S387</td><td>Para preparação de cimento dentário</td></tr><tr><td>Aplicadores com ponta de algodão</td><td>ZORO</td><td>catlog #: G9531702</td><td></td></tr><tr><td>Catalisador</td><td>Parkell</td><td>S371</td><td>nome completo: "C" Universal TBB Catalisador</td></tr><tr><td>Pó de cimento dental</td><td>Parkell</td><td>S396</td><td>Radiopaco L-Powder para C & B Metabond</td></tr><tr><td>broca dental</td><td>Foredom</td><td>H.MH-130</td><td></td></tr><tr><td>controlador de broca dental</td><td>Foredom</td><td>HP4-310</td><td></td></tr><tr><td>dexametasona</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-519-05</td><td></td></tr><tr><td>EF4 broca de carboneto</td><td>Microcopy</td><td>Lote # C150113</td><td>cabeça Dia/Lgth/mm 1.0/4.2</td></tr><tr><td>Ethonal</td><td>Fisher Scientific</td><td>04355223EA</td><td>75%</td></tr> <tr><td>FG1/4 broca de carboneto</td><td>Microcopy</td><td>Lot# C150413</td><td>Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4</td></tr><tr><td>FG4 broca de carboneto</td><td>Microcopy</td><td>Lot# C150309</td><td>Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1</td></tr><tr><td>Headpost</td><td>N/A</td><td>N/A</td> Aparelho de aquecimento <td>fabricado sob medida</td></tr><tr><td></td><td>CWE</td><td>TC-1000 Mouse</td><td>equipado com o instrumento estereotáxico e usado durante a cirurgia</td></tr><tr><td>cirúrgica Manta de aquecimento</td><td>CVS farmácia</td><td>E12107</td><td>dispositivo de aquecimento extra e ser usado após a cirurgia</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Pivetal</td><td>NDC 46066-755-03</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de indução de isoflurano</td><td>Vetequip</td><td>89012-688</td><td>câmara de indução para curto</td></tr><tr><td>Máquina de volatilização de isoflurano</td><td>Vetequip</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Suporte da máquina de volatilização de isoflurano</td><td>Vetequip</td><td>901801</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio cirúrgico Leica</td><td>Leica</td><td>10450243</td><td></td></tr><tr><td>Pomada oftálmica lubrificante</td><td>Picetal</td><td>NDC 46066-753-55</td><td></td></tr><tr><td>Caneta marcadora</td><td>Delasco</td><td>SMP-BK</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Norbrook</td><td>NDC 55529-040-10</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de microinjeção e seu controlador</td><td>World Precision Instruments</td><td>micro4 e UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de microlitro</td><td>Hamilton</td><td>Hamilton 80014</td><td>1701 RN, 10 &mu; Calibre L para seringa e calibre 32 para agulha, 2 pol, estilo de ponta 3</td></tr><tr><td>pinças de mosquito</td><td>CAROLINA</td><td>Item #: 625314</td><td>Aço inoxidável, curvo, 5 pol</td></tr><tr><td>Agente depilatório</td><td>McKesson Corporation</td><td>N / A</td><td>Nair Hair Aloe & amp Microscópio de Loção de Depilação de Lanolina</td></tr><tr><td>1</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Microscópio Nikon para preparação de janela craniana</td></tr><tr><td>Microscópio 2</td><td>Zeiss</td><td>LSM 7 MP</td> microscópio <td>de dois fótons</td></tr><tr><td>Laser multifotônico</td><td>Coherent</td><td>Chameleon Ultra II, Modelo: MRU X1, VERDI Laser de 18W</td><td>para microscopia de dois fótons</td></tr><tr><td>Sutura cirúrgica não absorvível</td><td>Harvard Apparatus</td><td>catlog# 59-6860</td><td>6-0, com agulha redonda</td></tr><tr><td>Adesivo óptico Norland 81</td><td>Norland Products</td><td>NOA 81</td><td></td></tr><tr><td>Sem-Snag Agulha Titular</td><td>CAROLINA</td><td>Item #: 567912</td><td></td></tr><tr><td>Base rápida líquida</td><td>Parkell</td><td>S398</td> <td>"B" Base rápida para C & B Metabond</td></tr><tr><td>Tesoura regular 1</td><td>Eurostat</td><td>eurostat es5-300</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura regular 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>No. 501759-G</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura redondo 1</td><td>Instrumentos Warner</td><td>CS-5R Cat# 64-0700</td><td>para 5 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura redondo 2</td><td>Instrumentos Warner</td><td>CS-3R Cat# 64-0720</td><td>para 3 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>Anéis</td> <td>de borrachaOrings-Online</td><td>Item # OO-014-70-50</td><td>O-Rings</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Bioworld</td><td>L19102411PR</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola 1</td><td>World Precision Instruments</td><td>No. 91500-09</td><td>ponta reta</td></tr><tr><td>Tesoura de mola 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>No. 91501-09</td><td>ponta curva</td></tr><tr><td>Plataforma estereotáxica</td><td>KOPF</td><td>Modelo 900LS</td><td></td></tr><tr><td>Super cola</td><td></td><td>Henkel Item #: Paquímetro cirúrgico 1647358</td><td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>No. 501200</td><td></td></tr><tr><td>Pinça cirúrgica 1</td><td>CIÊNCIAS DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA</td><td>Catlog# 0508-5/45-PO</td><td>estilo 5/45,</td></tr><tr><td>pinça cirúrgica curva 2</td><td>CIÊNCIAS DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA</td><td>catlog# 0103-5-PO</td><td>estilo 5,</td></tr><tr><td>pinça cirúrgica reta 3</td><td>CIÊNCIAS</td> <td>DE MICROSCOPIA ELETRÔNICAcatlog# 72912</td><td></td></tr><tr><td>Pinça cirúrgica 4</td><td>CIÊNCIAS DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA</td><td>Catlog# 0508-5/45-PO</td><td>estilo 5/45, curvado</td></tr><tr><td>Gaze cirúrgica</td><td>ZORO</td><td>catlog #: G0593801</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada cirúrgica</td><td>Leica</td><td>Leica KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>UV box</td><td>Spectrolinker</td><td>XL-1000</td><td>também chamada de reticulador UV</td></tr><tr><td>Vaporguard</td><td>Vetequip</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo de Tecido Vetbond</td><td>3M Número da peça para cuidados com animais</td><td>:014006</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem intravital da expressão de proteínas fluorescentes em camundongos com traumatismo cranioencefálico de crânio fechado e janela craniana usando um microscópio de dois fótons

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

O objetivo deste protocolo é demonstrar como visualizar longitudinalmente a expressão e localização de uma proteína de interesse dentro de tipos celulares específicos do cérebro de um animal, mediante exposição a estímulos exógenos. Aqui, a administração de um traumatismo cranioencefálico (TCE) fechado e o implante simultâneo de uma janela craniana para subsequentes imagens intravitais longitudinais em camundongos são mostrados. Camundongos são injetados intracranialmente com um vírus adenoassociado (AAV) expressando proteína fluorescente verde aumentada (EGFP) sob um promotor neuronal específico. Após 2 a 4 semanas, os camundongos são submetidos a um TCE repetitivo usando um dispositivo de queda de peso sobre o local de injeção do AAV. Dentro da mesma sessão cirúrgica, os camundongos são implantados com um cabeçote de metal e, em seguida, uma janela craniana de vidro sobre o local do TCE. A expressão e a localização celular do EGFP são examinadas usando um microscópio de dois fótons na mesma região cerebral exposta a trauma ao longo de meses.

Como prova de conceito para este protocolo, partículas virais expressando AAV-Syn1-EGFP foram injetadas no córtex cerebral de camundongos machos TDP-43 Q331K/Q331K (fundo C57BL/6J)19 com a idade de 3 meses. Nota-se que animais selvagens C57BL/6J também podem ser usados, no entanto, este estudo foi realizado em camundongos TDP-43 Q331K/Q331K porque o laboratório é focado na pesquisa de doenças neurodegenerativas. Uma cirurgia de TCE foi realizada 4 semanas após a injeção de AA...

Este estudo demonstra a entrega de um traumatismo cranioencefálico repetitivo em camundongos e o implante simultâneo de uma janela craniana para posterior imagem intravital de um EGFP expresso por neurônio usando microscopia de dois fótons.

Imagem Intravital da Expressão de Proteínas Fluorescentes em Camundongos com Traumatismo Cranioencefálico de Crânio Fechado e Janela Craniana Usando um Microscópio de Dois Fótons

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

Nosso protocolo fornece uma maneira de visualizar a resposta neuronal ao estresse mecânico em um camundongo vivo, o que pode fornecer evidências diretas de como a lesão cerebral traumática afeta o cérebro. Esta técnica pode monitorar a proteína-alvo no mesmo local do cérebro no mesmo animal para as fases aguda e crônica após traumatismo cranioencefálico. O gene de interesse e o promotor do vírus podem ser alterados de acordo com o estudo de outras proteínas nos tipos celulares específicos no cérebro.Para começar, aplique pomada oftálmica nos olhos do rato anestesiado. Retire o cabelo do topo da cabeça aparando com tesouras regulares. Depois de estabelecer uma incisão mediana de 12 a 15 milímetros de comprimento, excise a pele sobre os hemisférios esquerdo e direito do crânio usando tesoura de mola de ponta curva.Uma vez exposto o crânio, remova o periósteo esfregando-o suavemente com o aplicador de algodão estéril e lavando-o com soro fisiológico estéril. Uma vez seca a área do crânio, marcar o Traumatismo Cranioencefálico, ou TCE, local de impacto nas coordenadas 2,5 milímetros posterior ao bregma e dois milímetros lateral da sutura sagital à direita. Remova rapidamente o mouse do quadro estereotáxico e coloque a cabeça na almofada do buffer sob o dispositivo TBI.Alinhe a ponta do pêndulo com o local de impacto marcado. Levante a coluna de metal puxando a corda de nylon presa 15 centímetros acima da cabeça do mouse e, em seguida, solte-a, permitindo que o peso caia livremente sobre a haste do transdutor, que está em contato com a parte superior do crânio no local do TCE. Coloque a cabeça do camundongo anestesiado sobre a estrutura estereotáxica mantida sob o microscópio cirúrgico.Perfure suave e lentamente a superfície do crânio usando uma broca de carboneto FG4 a uma velocidade baixa do rotor para remover o periósteo restante e crie uma superfície áspera do crânio de tal forma que o cimento dentário se ligue firmemente ao crânio. Use soro fisiológico para limpar e limpar a poeira óssea da superfície do crânio. Para separar os músculos laterais do crânio, aproximadamente cinco milímetros posteriores ao olho, onde está localizada a sutura que liga o crânio parietal e temporal, insira suavemente as pontas finas fechadas e mova suavemente as pontas fechadas no sentido posterior até a sutura lambdoide.Separe os músculos laterais do lado onde ocorrerá a implantação da janela craniana. Lave os detritos do sítio cirúrgico com soro fisiológico e seque a área com gaze. Para a implantação do poste cefálico, marcar o ponto central 2,5 milímetros posterior ao bregma e 1,5 milímetros fora da sutura sagital no hemisfério direito, utilizando caneta marcador e paquímetro cirúrgico.Em seguida, trace a circunferência da craniotomia no crânio limpo e seco. Solte a barra da orelha e gire a cabeça, de modo que o plano da craniotomia fique perfeitamente horizontal, e então aperte a barra da orelha novamente. Use o bastão de madeira de um aplicador com ponta de algodão para adicionar duas pequenas gotas de supercola na borda frontal e traseira do poste da cabeça.Posicionar o poste da cabeça de titânio sobre o centro da craniotomia e ajustá-lo rapidamente para repousar no mesmo plano onde a janela craniana será implantada. Aplique leve pressão até que a supercola esteja seca, o que geralmente leva aproximadamente 30 segundos. Prepare o cimento dental em um prato cerâmico pré-resfriado misturando completamente 300 miligramas de pó de cimento, seis gotas de líquido QuickBase e uma gota de catalisador.Aplique rapidamente uma quantidade generosa de mistura de cimento dentário no perímetro externo da circunferência traçada e cubra qualquer superfície óssea exposta. No entanto, não cobrir o local da craniotomia. Solte a barra auricular e prenda o poste da cabeça à estrutura metálica para garantir que a cabeça seja estável para uma perfuração precisa ao longo da circunferência da craniotomia marcada.Para realizar a craniotomia, use um paquímetro cirúrgico para verificar o diâmetro do círculo marcado como demonstrado anteriormente, e ajuste conforme necessário, para que a janela craniana se encaixe confortavelmente dentro da craniotomia. Usando uma broca dental elétrica, etch e afinar o crânio ao longo da parte externa do círculo marcado usando um bit de carboneto FG4 primeiro, que cria uma trilha dentro da qual afinar o crânio. Irrigar a área com soro fisiológico para lavar a poeira óssea.Continue a afinar o crânio usando uma mordida de carboneto FG 1/4 até que o crânio fique fino e transparente. Periodicamente, pare a perfuração e irrige toda a área com soro fisiológico estéril novamente para reduzir o aquecimento da broca e lavar a poeira óssea. Complete o afinamento do crânio usando uma broca de carboneto EF4 e continue afinando e perfurando o resto do crânio ao longo da trilha.Insira uma pinça de ponta fina de 0,5 milímetro através do local rachado e levante o retalho ósseo suavemente para cima sem recuar o cérebro subjacente. Após a retirada do retalho ósseo, irrigar a área de craniotomia com soro fisiológico. Usando a pinça cirúrgica curva inclinada, remova suavemente a matéria aracnoide visível.Use a pinça cirúrgica de ponta reta para pegar a janela de vidro estéril com a tampa de vidro de três milímetros voltada para baixo. Coloque e ajuste a janela de vidro acima do local da craniotomia para certificar-se de que a janela pode se encaixar confortavelmente à borda da craniotomia. A tampa de vidro de cinco milímetros está no topo.Prepare o cimento dentário como demonstrado anteriormente e aguarde aproximadamente seis minutos até que o cimento se torne pastoso e espesso. Enquanto espera que o cimento se torne pastoso e espesso, aplique uma quantidade adequada de pressão na janela através de um manipulador estereotáxico para verificar se o crânio pode entrar em contato seguro e firmemente com a janela de vidro. Use uma escova aplicadora de precisão ajustável para adicionar uma pequena quantidade de cimento ao lado da borda da janela para selar a janela de vidro com o crânio.Aguarde aproximadamente 10 minutos para deixar o cimento secar completamente, solte suavemente e remova o manipulador acima da janela. Complete aparando o cimento dentário usando a broca dental com uma broca de metal duro FG4 se o excesso de cimento cobrir a janela. Cerca de quatro horas após a cirurgia, foram realizadas imagens de dois fótons, onde no nível superficial a vasculatura aparecia preta e, no nível profundo de aproximadamente 400 micrômetros, a expressão da proteína EGFP estava difusamente distribuída por todo o corpo celular.Uma semana e quatro meses após o TCE, o padrão de vasculatura observado no tempo zero do dia foi usado como referência para localizar a mesma região de imagem. O padrão de vasculatura é semelhante ao do dia zero. Da mesma forma, a expressão de EGFP foi detectada em todo o corpo celular.A intensidade da fluorescência no dia zero e quatro meses foi semelhante tanto no nível superficial quanto no profundo. No entanto, a intensidade da fluorescência em uma semana foi menor do que a do dia zero e quatro meses, possivelmente devido à repressão translacional relatada para outros modelos de TCE. É crucial tomar o máximo cuidado ao operar a etapa de craniotomia para evitar danificar o tecido cerebral.Não insira a ponta da broca no cérebro. Usando essa técnica, os pesquisadores podem visualizar diferentes proteínas de interesse na mesma célula longitudinalmente em diferentes fases pós-TCE, fornecendo informações sobre a localização, expressão e solubilidade dessa proteína no cérebro de mamíferos após o trauma.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra a aplicação de traumatismo cranioencefálico (TCE) em camundongos. Depois de expor o crânio, o local do TCE é marcado. O mouse é então posicionado sob o dispositivo TBI. O impacto é feito levantando a haste de metal e permitindo que ela caia livremente sobre o impactor, que está em contato com o crânio.

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Imagem de fluorescência da dinâmica neuroimune usando um implante de crânio

Source:&lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove. com/v/53582/quantificação-da-arquitetura-vascular-cerebral-usando-microscopia-de-dois-fótons-em-um-modelo-de-camundongo-de-neuroinflamação-induzida-por-HIV'&gt; Nishimura, C. et al. Quantificação da Arquitetura Vascular Cerebral usando Microscopia de Dois Fótons em um Modelo de Camundongo de Neuroinflamação Induzida pelo HIV. J. Vis. Exp. (2016). Este vídeo demonstra a visualização in vivo de capilares corticais no cérebro de...

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