Imagem Intravital da Expressão de Proteínas Fluorescentes em Camundongos com Traumatismo Cranioencefálico de Crânio Fechado e Janela Craniana Usando um Microscópio de Dois Fótons

Nosso protocolo fornece uma maneira de visualizar a resposta neuronal ao estresse mecânico em um camundongo vivo, o que pode fornecer evidências diretas de como a lesão cerebral traumática afeta o cérebro. Esta técnica pode monitorar a proteína-alvo no mesmo local do cérebro no mesmo animal para as fases aguda e crônica após traumatismo cranioencefálico. O gene de interesse e o promotor do vírus podem ser alterados de acordo com o estudo de outras proteínas nos tipos celulares específicos no cérebro.

Para começar, aplique pomada oftálmica nos olhos do rato anestesiado. Retire o cabelo do topo da cabeça aparando com tesouras regulares. Depois de estabelecer uma incisão mediana de 12 a 15 milímetros de comprimento, excise a pele sobre os hemisférios esquerdo e direito do crânio usando tesoura de mola de ponta curva.

Uma vez exposto o crânio, remova o periósteo esfregando-o suavemente com o aplicador de algodão estéril e lavando-o com soro fisiológico estéril. Uma vez seca a área do crânio, marcar o Traumatismo Cranioencefálico, ou TCE, local de impacto nas coordenadas 2,5 milímetros posterior ao bregma e dois milímetros lateral da sutura sagital à direita. Remova rapidamente o mouse do quadro estereotáxico e coloque a cabeça na almofada do buffer sob o dispositivo TBI.

Alinhe a ponta do pêndulo com o local de impacto marcado. Levante a coluna de metal puxando a corda de nylon presa 15 centímetros acima da cabeça do mouse e, em seguida, solte-a, permitindo que o peso caia livremente sobre a haste do transdutor, que está em contato com a parte superior do crânio no local do TCE. Coloque a cabeça do camundongo anestesiado sobre a estrutura estereotáxica mantida sob o microscópio cirúrgico.

Perfure suave e lentamente a superfície do crânio usando uma broca de carboneto FG4 a uma velocidade baixa do rotor para remover o periósteo restante e crie uma superfície áspera do crânio de tal forma que o cimento dentário se ligue firmemente ao crânio. Use soro fisiológico para limpar e limpar a poeira óssea da superfície do crânio. Para separar os músculos laterais do crânio, aproximadamente cinco milímetros posteriores ao olho, onde está localizada a sutura que liga o crânio parietal e temporal, insira suavemente as pontas finas fechadas e mova suavemente as pontas fechadas no sentido posterior até a sutura lambdoide.

Separe os músculos laterais do lado onde ocorrerá a implantação da janela craniana. Lave os detritos do sítio cirúrgico com soro fisiológico e seque a área com gaze. Para a implantação do poste cefálico, marcar o ponto central 2,5 milímetros posterior ao bregma e 1,5 milímetros fora da sutura sagital no hemisfério direito, utilizando caneta marcador e paquímetro cirúrgico.

Em seguida, trace a circunferência da craniotomia no crânio limpo e seco. Solte a barra da orelha e gire a cabeça, de modo que o plano da craniotomia fique perfeitamente horizontal, e então aperte a barra da orelha novamente. Use o bastão de madeira de um aplicador com ponta de algodão para adicionar duas pequenas gotas de supercola na borda frontal e traseira do poste da cabeça.

Posicionar o poste da cabeça de titânio sobre o centro da craniotomia e ajustá-lo rapidamente para repousar no mesmo plano onde a janela craniana será implantada. Aplique leve pressão até que a supercola esteja seca, o que geralmente leva aproximadamente 30 segundos. Prepare o cimento dental em um prato cerâmico pré-resfriado misturando completamente 300 miligramas de pó de cimento, seis gotas de líquido QuickBase e uma gota de catalisador.

Aplique rapidamente uma quantidade generosa de mistura de cimento dentário no perímetro externo da circunferência traçada e cubra qualquer superfície óssea exposta. No entanto, não cobrir o local da craniotomia. Solte a barra auricular e prenda o poste da cabeça à estrutura metálica para garantir que a cabeça seja estável para uma perfuração precisa ao longo da circunferência da craniotomia marcada.

Para realizar a craniotomia, use um paquímetro cirúrgico para verificar o diâmetro do círculo marcado como demonstrado anteriormente, e ajuste conforme necessário, para que a janela craniana se encaixe confortavelmente dentro da craniotomia. Usando uma broca dental elétrica, etch e afinar o crânio ao longo da parte externa do círculo marcado usando um bit de carboneto FG4 primeiro, que cria uma trilha dentro da qual afinar o crânio. Irrigar a área com soro fisiológico para lavar a poeira óssea.

Continue a afinar o crânio usando uma mordida de carboneto FG 1/4 até que o crânio fique fino e transparente. Periodicamente, pare a perfuração e irrige toda a área com soro fisiológico estéril novamente para reduzir o aquecimento da broca e lavar a poeira óssea. Complete o afinamento do crânio usando uma broca de carboneto EF4 e continue afinando e perfurando o resto do crânio ao longo da trilha.

Insira uma pinça de ponta fina de 0,5 milímetro através do local rachado e levante o retalho ósseo suavemente para cima sem recuar o cérebro subjacente. Após a retirada do retalho ósseo, irrigar a área de craniotomia com soro fisiológico. Usando a pinça cirúrgica curva inclinada, remova suavemente a matéria aracnoide visível.

Use a pinça cirúrgica de ponta reta para pegar a janela de vidro estéril com a tampa de vidro de três milímetros voltada para baixo. Coloque e ajuste a janela de vidro acima do local da craniotomia para certificar-se de que a janela pode se encaixar confortavelmente à borda da craniotomia. A tampa de vidro de cinco milímetros está no topo.

Prepare o cimento dentário como demonstrado anteriormente e aguarde aproximadamente seis minutos até que o cimento se torne pastoso e espesso. Enquanto espera que o cimento se torne pastoso e espesso, aplique uma quantidade adequada de pressão na janela através de um manipulador estereotáxico para verificar se o crânio pode entrar em contato seguro e firmemente com a janela de vidro. Use uma escova aplicadora de precisão ajustável para adicionar uma pequena quantidade de cimento ao lado da borda da janela para selar a janela de vidro com o crânio.

Aguarde aproximadamente 10 minutos para deixar o cimento secar completamente, solte suavemente e remova o manipulador acima da janela. Complete aparando o cimento dentário usando a broca dental com uma broca de metal duro FG4 se o excesso de cimento cobrir a janela. Cerca de quatro horas após a cirurgia, foram realizadas imagens de dois fótons, onde no nível superficial a vasculatura aparecia preta e, no nível profundo de aproximadamente 400 micrômetros, a expressão da proteína EGFP estava difusamente distribuída por todo o corpo celular.

Uma semana e quatro meses após o TCE, o padrão de vasculatura observado no tempo zero do dia foi usado como referência para localizar a mesma região de imagem. O padrão de vasculatura é semelhante ao do dia zero. Da mesma forma, a expressão de EGFP foi detectada em todo o corpo celular.

A intensidade da fluorescência no dia zero e quatro meses foi semelhante tanto no nível superficial quanto no profundo. No entanto, a intensidade da fluorescência em uma semana foi menor do que a do dia zero e quatro meses, possivelmente devido à repressão translacional relatada para outros modelos de TCE. É crucial tomar o máximo cuidado ao operar a etapa de craniotomia para evitar danificar o tecido cerebral.

Não insira a ponta da broca no cérebro. Usando essa técnica, os pesquisadores podem visualizar diferentes proteínas de interesse na mesma célula longitudinalmente em diferentes fases pós-TCE, fornecendo informações sobre a localização, expressão e solubilidade dessa proteína no cérebro de mamíferos após o trauma.