Avaliação da integridade da barreira intestinal em camundongos usando Dextrano marcado com fluoresceína-isotiocianato
18 de novembro de 2022
No presente estudo, o dextrano marcado com fluoresceína-isotiocianato (FITC) é administrado a camundongos via gavagem oral para avaliar a permeabilidade intestinal tanto in vivo quanto em amostras plasmáticas e fecais. Como a função de barreira intestinal é afetada em muitos processos de doenças, este ensaio direto e quantitativo pode ser usado em diversas áreas de pesquisa.
Este método ajuda a responder a perguntas sobre se uma condição altera a integridade da barreira intestinal ou questões sobre se um tratamento potencial pode manter a integridade da barreira intestinal. A principal vantagem dessa técnica é que ela oferece uma técnica não invasiva e de baixa carga para avaliar e quantificar a permeabilidade intestinal in vivo. Para começar, jejue os camundongos por quatro horas e, em seguida, administre 200 microlitros da suspensão FITC-dextran via gavagem oral a cada camundongo usando uma agulha de gavagem curva esterilizada de calibre 22 de 38 milímetros.
Inicie um temporizador após a primeira gavagem e aguarde de cinco a 10 minutos entre cada gavagem para permitir medições in vivo, mantendo uma hora após a gavagem. Mantenha a suspensão FITC-dextran restante para a curva padrão. Inicie a máquina e o software clicando e segurando o botão Iniciar e permita que o sistema aqueça.
Clique em Status do dispositivo e verifique se todos os dispositivos configurados mostram OK antes de prosseguir. Em seguida, clique em Novo estudo e salve o arquivo com o nome desejado. Em seguida, clique em Opções de estudo.
Insira o ID da amostra e escolha o laser correto e experimente. Em seguida, remova a pele da área abdominal usando um barbeador elétrico e aplique pomada veterinária generosamente nos olhos para evitar a secagem. Abra a câmara de imagem e coloque o animal dorsalmente na placa de varredura.
Em seguida, prenda os membros e a cauda com fita adesiva. Em seguida, selecione a área a ser digitalizada usando a ferramenta Desenhar. Certifique-se de incluir toda a largura do abdômen desde logo acima do fígado até o reto.
Em seguida, clique na ferramenta Modificar para ajustar a área uma vez desenhada. Defina a resolução da varredura para 2,0 milímetros e clique em Iniciar para iniciar a varredura. Em seguida, abra os arquivos de imagem localizando-os sob o nome de arquivo escolhido e, simultaneamente, abra todos os arquivos com configurações sincronizadas.
Usando a barra de ferramentas de configurações de imagem, use os botões Sincronizar imagem e Sincronizar escala para sincronizar as configurações de imagem para uma comparação precisa. Em seguida, salve as imagens com as escalas ajustadas. Comparar a fluorescência abdominal de cada animal e do camundongo controle em imagens uniformemente dimensionadas usando software associado ao sistema de imagem.
Recolher um pellet fecal de cada rato num tubo estéril quatro horas após a gavagem. Em seguida, mantenha os tubos no gelo e coloque-os no escuro. Em seguida, centrifugar as amostras de sangue a 9,390 x g por 10 minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, transfira o plasma para um novo tubo estéril e mantenha-o no gelo no escuro. Diluir 50 miligramas de amostras fecais em 200 microlitros de PBS e diluir o plasma com PBS numa proporção de um para dois. Placa de 100 microlitros amostras e padrões em uma placa preta opaca de 96 poços.
Leia a fluorescência em um leitor de placas fluorescentes com excitação a 485 nanômetros e absorção a 530 nanômetros. Finalmente, determine a concentração de FITC-dextran por amostra, comparando a fluorescência com as concentrações conhecidas da curva padrão. A análise da fluorescência in vivo mostrou que os ratos que receberam apenas a dieta controle tiveram uma maior ingestão hepática de FITC-dextran e maiores níveis de fluorescência residual na cavidade abdominal em comparação com os ratos que receberam a dieta suplementada com inulina.
Os ratos que receberam a dieta suplementada com inulina tiveram níveis significativamente mais baixos de FITC-dextran em seu plasma em comparação com os ratos que receberam apenas a dieta de controle. Concordantemente, os ratos que receberam a dieta de inulina tiveram níveis significativamente mais elevados de FITC-dextran em suas fezes do que os ratos que receberam apenas a dieta de controle. Os níveis mais baixos de FITC-dextran nas fezes dos camundongos controlados indicam que ele permeou através da barreira intestinal para a circulação em vez de ser excretado adequadamente.
Os altos níveis de FITC-dextran no plasma reforçaram esse achado. O tempo é essencial ao tentar este procedimento. A leitura por fluorescência e a coleta de amostras devem ocorrer o mais próximo possível de uma hora e quatro horas após a gavagem para cada camundongo individual.
Visão Geral
Este estudo avalia a permeabilidade intestinal em camundongos utilizando dextrana marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) administrada por meio de gavagem oral. O método permite a avaliação da função da barreira intestinal in vivo, o que é crucial para compreender diversos processos de doenças.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Integridade da barreira intestinal
- Pesquisa com modelos animais
- Técnicas de avaliação não invasivas
Contexto
- A permeabilidade intestinal é frequentemente alterada em condições de doença.
- Manter a integridade da barreira intestinal é essencial para a saúde.
- Métodos não invasivos são preferidos em estudos com animais.
Métodos Utilizados
- Administração de dextrano-FITC por gavagem oral
- Camundongos como sistema biológico experimental
- Leitora de placas fluorescente para quantificação
Resultados Principais
- Camundongos com dieta controle apresentaram níveis hepáticos mais elevados de fluorescência em comparação com aqueles com dieta suplementada com inulina.
- Níveis plasmáticos mais baixos de dextrano-FITC foram observados em camundongos que receberam a dieta com inulina.
- Camundongos suplementados com inulina apresentaram níveis mais elevados de dextrano-FITC nas fezes, indicando manutenção eficaz da barreira intestinal.
Conclusões
- Este estudo demonstra um método confiável para avaliar a função da barreira intestinal.
- Os achados destacam a importância de intervenções dietéticas na manutenção da integridade intestinal.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação quantitativa da integridade da barreira intestinal é essencial para reduzir riscos em programas iniciais voltados à saúde intestinal e à inflamação sistêmica. O ensaio com dextrana-FITC fornece uma leitura direta e em tempo real da permeabilidade intestinal, permitindo uma avaliação confiável de intervenções terapêuticas e modificações dietéticas em modelos pré-clínicos. Essa capacidade apóia decisões preditivas no ponto de interseção entre a biologia descoberta e a pesquisa translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta da função da barreira intestinal como um desfecho mecanicista.
- Apoia a desmistificação biológica de alvos que modulam a integridade da mucosa.
- Facilita a confiança preditiva na seleção de candidatos para indicações relacionadas ao intestino.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece um sistema validado e quantitativo para medir a permeabilidade intestinal in vivo.
- Padroniza os resultados dos ensaios para reprodutibilidade em telas de compostos e intervenções dietéticas.
- Permite avaliação escalonável e não invasiva de moduladores da barreira intestinal em modelos animais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha resultados pré-clínicos com biomarcadores relevantes para a doença relacionados à saúde intestinal.
- Apoia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica de terapias direcionadas à barreira intestinal.
- Informa decisões de avanço ajustadas ao risco com base em desfechos funcionais da barreira intestinal.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este ensaio com FITC-dextrano se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico, conectando estudos mecanicistas e validação translacional de biomarcadores para a função da barreira intestinal.
- Biologia da Descoberta: Quantifica o impacto de intervenções genéticas, dietéticas ou farmacológicas na permeabilidade mucosa.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos reprodutíveis para comparação cruzada de intervenções candidatas.
- Análises: Oferece medições baseadas em fluorescência que permitem comparação estatística da integridade da barreira intestinal entre grupos.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se com estratégias clínicas de biomarcadores de permeabilidade intestinal ao avançar candidatos.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma padronizada e reutilizável para avaliação da barreira intestinal em múltiplos programas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na modulação da barreira intestinal e na validação de alvos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e produtividade dos ensaios em fluxos de trabalho pré-clínicos.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir ao fornecer leituras funcionais diretas da integridade da barreira.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de ativos que visam a saúde intestinal ou inflamação sistêmica.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em manipulação de animais, gavagem oral e imagem de fluorescência.
- Requer acesso a sistemas de imagem in vivo e leitores de placas com fluorescência.
- Exige padronização entre equipes quanto ao cronograma e processamento de amostras para garantir reprodutibilidade.
- Adaptável a diversos modelos de intervenção dietética, genética ou farmacológica em camundongos.
- O momento da coleta das amostras é crítico para uma avaliação precisa da permeabilidade.
