In vivo Entrega de Genes em Células Epiteliais Mamárias de Camundongos Através de Injeção Intraductal Mamária

O presente protocolo descreve a injeção intraductal de vetores virais via teto para entregar genes de interesse nas células epiteliais mamárias.

Este método entrega o material genético nas células epiteliais da glândula mamária de forma especial, temporária e quantitativamente controlável. Como a entrega de material genético nas células epiteliais mamárias é especial, temporária e quantitativamente controlada, os modelos mamários gerados por este método mimetizam melhor a gênese natural do tumor. Comece a preparação da seringa cortando as agulhas de cubo de metal de calibre 33 até aproximadamente um centímetro de comprimento e armazenando-as em álcool.

Retire seringas e agulhas do álcool e empurre o álcool restante para fora da seringa e agulhas. Em seguida, desmonte a seringa para secar ao ar. Após a secagem, monte a seringa.

Retire os tubos de estoque viral do freezer de 80 graus Celsius negativos e descongele-os no gelo. Para adicionar azul de bromofenol, mergulhe a ponta da pipeta a uma profundidade de um centímetro no pó de azul de bromofenol. Em seguida, traga a quantidade de vestígios anexados de azul de bromofenol para a suspensão do vírus.

Misture o azul de bromofenol com a solução do vírus pipetando para cima e para baixo 10 vezes, antes de colocar o vírus no gelo. Verifique a profundidade da anestesia apertando o dedo do pé de uma rata fêmea anestesiada. Aplique pomada nos olhos para evitar o ressecamento enquanto o animal estiver sob anestesia.

Coloque o mouse em decúbito dorsal em uma almofada quente e prenda os quatro membros ao banco usando fita adesiva. Identifique o mamilo a ser injetado e exponha-o aparando o cabelo ao redor usando uma tesoura. Aplique álcool a 70% e quatro cotonetes em três rodadas alternadas na área do mamilo para limpar e expor o mamilo.

Transeccionar a ponta distal de um mamilo usando um par de tesouras de mola de microdissecção esterilizadas, até que uma pequena abertura ductal central possa ser vista sob uma lâmpada de aumento. Em seguida, carregue 10 microlitros da mistura de azul de bromofenol vírus na seringa e insira cuidadosamente a agulha na abertura do mamilo com a ajuda da lâmpada de lupa. Injete os 10 microlitros inteiros do vírus na árvore do duto e coloque o mouse em um aquecedor de lâminas definido a 45 graus Celsius até que o mouse acorde completamente.

Abra a cavidade torácica três a cinco dias após a injeção do vírus. Cortar a pele ao longo da linha média ventral e dos membros superiores e inferiores com tesoura. Levante a pele e exponha as glândulas mamárias.

Remova a glândula mamária injetada da pele e uma glândula não injetada como controle usando pinça e tesoura. Uma vez feito, coloque a glândula mamária em uma lâmina de vidro e espalhe a glândula para sua forma original antes de observá-la e imaginá-la sob um microscópio estéreo fluorescente. O sucesso da injeção intraductal foi confirmado pela exposição da glândula mamária e observação de uma árvore ductal azulada.

Após dois a cinco dias da injeção do vírus lenti-EGFPFUCGW, a infecção das células epiteliais mamárias foi avaliada observando-se todo o preparo do monte sob estereomicroscópio fluorescente. Para a análise por citometria de fluxo das proteínas fluorescentes ou marcadores de superfície celular produzidos pelo vírus, as glândulas não infectadas e as glândulas infectadas foram coletadas e processadas em uma única suspensão celular para estimar a taxa de infecção viral. O ERBBB2 ativado levou a lesões pré-cancerosas em poucas semanas e tumores em poucos meses.

O tamanho dos mamilos pode variar significativamente devido às diferenças de massa, idade, peso corporal e força entre camundongos individuais. Aparar corretamente a ponta do mamilo para expor a abertura do ducto mamário e o encaixe da agulha é um passo importante para injetar o vírus com sucesso.