Microdissecção e Visualização por Microscopia Eletrônica de Varredura de Montagem Completa do Plexo Coroide de Camundongos

Para obter uma melhor compreensão da composição e estrutura do plexo coroide, um método eficiente para isolar o plexo coroide fora dos ventrículos cerebrais é um primeiro passo inestimável. Com esta técnica de microdissecção é possível dissecar o plexo coroide para fora dos ventrículos cerebrais, contendo sua função, viabilidade e estrutura sem contaminar o plexo coroide com o tecido circundante. Um obstáculo significativo no isolamento do plexo coroide é a identificação da estrutura que ainda flutua nos ventrículos cerebrais.

A coloração do plexo coroide com azul de bromofenol facilita o isolamento. Quem demonstrará o procedimento será Elien Van Wonterghem, nosso gerente de laboratório. Comece com a preparação de um anestésico terminal, solução de perfusão transcárdica e uma solução necessária para microscopia eletrônica de varredura, ou MEV, e outras soluções como mencionado no texto.

Para isolar o cérebro do camundongo, coloque o animal anestesiado terminalmente na posição de decúbito dorsal e fixe o camundongo fixando os membros em uma placa. Desinfetar o tórax borrifando etanol a 70% antes de fazer uma incisão de aproximadamente quatro centímetros logo abaixo do diafragma usando uma lâmina cirúrgica de aço carbono. Abra a pele e exponha o tórax com tesoura cirúrgica.

Corte o diafragma completamente aberto e separe o tórax para expor os pulmões e o coração batendo. Com uma bomba de perfusão, o camundongo perfunde transcardialmente 10 mililitros da solução de perfusão a uma taxa de 4,5 mililitros por minuto. Insira uma agulha de calibre 26 no ventrículo esquerdo para bombear a solução para o circuito sistêmico.

Usando tesoura cirúrgica, corte o átrio direito para o sangue sair da circulação. Após a decapitação do rato, abra o couro cabeludo fazendo uma incisão começando entre as orelhas até a parte superior dos olhos. Puxe a pele lateralmente para expor o crânio.

Em seguida, abra o crânio seguindo as suturas escamosas em direção à parte nasal. Uma vez feito, coloque o cérebro em uma placa de Petri gelada e adicione um mililitro de PBS gelado ao tecido cerebral. Para isolar o plexo coroide flutuando no quarto ventrículo, corte suavemente o cerebelo do cérebro usando um bisturi.

Remova as partes restantes do tecido do tronco cerebral do cerebelo. Gire o cérebro para que a linha de corte esteja voltada para cima, garantindo que a cavidade do quarto ventrículo seja visível no meio da seção com o plexo coroide situado no local dorsal. Se necessário, abra o ventrículo puxando o tecido conjuntivo com pinças afiadas.

Rasgue suavemente o plexo coroide para fora da parede do ventrículo usando pinças minúsculas e afiadas. Para isolar o plexo coroide do ventrículo lateral, corte sagitalmente o cérebro em dois hemisférios usando pinças minúsculas e afiadas. Gire um hemisfério cerebral para que a linha de corte seja para cima.

Para revelar o ventrículo lateral, afaste suavemente o córtex do tálamo. Retrair o hipocampo para a linha de corte sagital média. O ventrículo lateral é agora visível com o plexo coroide situado na parte inferior do ventrículo.

Se necessário, abra um pouco o ventrículo puxando o tecido conjuntivo com pinças afiadas. Use pinças minúsculas e afiadas para arrancar suavemente o plexo coroide da parede do ventrículo. Para realizar o preparo da amostra para MEV, transfira o plexo coroide recém-isolado para uma solução de fixação recém-feita e incube durante a noite a quatro graus Celsius.

Uma vez feito, lavar a amostra três vezes usando três a cinco mililitros de tampão cacodilato de sódio 0,1 molar por cinco minutos cada. Postfixar as amostras em três a cinco mililitros de tetróxido de ósmio a 2% em tampão cacodilato de sódio 0,1 molar por 30 minutos. Em seguida, lave as amostras três vezes por cinco minutos cada usando três a cinco mililitros de água ultrapura.

Em seguida, desidratar as amostras em uma série crescente de concentrações de álcool etílico geladas com 15 minutos por solução de álcool etílico. Use um secador de ponto crítico para secar a amostra corretamente. Posicione a amostra cuidadosamente em um suporte de amostra com um adesivo de carbono e visualize as amostras de plexo coroide usando MEV.

O presente protocolo facilitou o eficiente isolamento do plexo coroide do encéfalo lateral e do quarto ventrículo de camundongos. A perfusão com azul de bromofenol resultou na visualização do plexo coroide. Quando o azul de bromofenol não era permitido nas etapas posteriores de processamento, a perfusão com PBS-heparina ou nenhuma perfusão era realizada para o processamento.

A análise morfológica da microscopia eletrônica de varredura da superfície das células epiteliais do plexo coroide, ou ECP, mostra claramente a estrutura dos dois braços do quarto ventrículo e a forma típica em forma de C do plexo coroide lateral isolado do ventrículo lateral. Um maior aumento da MEV revelou estruturas vesiculais no lado apical das células CPE e microvilosidades, indicando que alterações morfológicas das células CPE em condições de doença podem ser investigadas usando MEV. É importante apenas tocar e retirar o tecido do plexo coroide para não contaminar a amostra com o tecido circundante.

Use o cuidado necessário para preservar a estrutura do plexo coroide. Uma variedade de técnicas a jusante pode ser aplicada no plexo coroide isolado para investigar sua estrutura e função, desde a análise microscópica sobre a análise do transcriptoma até a citometria de fluxo. Microdissecar o plexo coroide para fora do cérebro nos permite obter uma melhor visão sobre a estrutura e função deste minúsculo tecido cerebral.

Esse conhecimento é essencial para melhor compreender seu papel nas doenças neurológicas.