Interrogação pareada célula-específica do epigenoma e transcriptoma ovariano de camundongos
24 de fevereiro de 2023
Neste protocolo, o método de purificação por afinidade do ribossomo (TRAP) e o isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACT) foram otimizados para a interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma ovariano célula-específica usando o modelo de camundongo NuTRAP cruzado com uma linhagem de camundongo Cyp17a1-Cre.
Este método fornece uma técnica para isolar ácidos nucleicos de populações específicas de células ovarianas do mesmo camundongo sem a necessidade de triagem celular. Esta técnica pode ajudar a identificar como populações celulares específicas estão mudando sob uma variedade de condições. Por exemplo, com o envelhecimento.
A principal vantagem desta técnica é que ela permite a análise epigenômica e transcriptômica pareada de um tipo específico de célula ovariana sem a necessidade de triagem celular. Isso aumenta significativamente o rendimento, diminui o custo e elimina a necessidade de equipamentos especializados ao realizar análises específicas do tipo celular do tecido ovariano. Aqui, nosso objetivo é identificar as alterações específicas do tipo celular que ocorrem com o envelhecimento ovariano antes da senescência reprodutiva, o que tem implicações no tratamento da infertilidade feminina.
Este método pode ser aplicado a qualquer tipo de célula em sistemas do corpo para os quais um driver Cre específico do tipo de célula está disponível. A parte mais difícil desta técnica é escolher uma linha Cre apropriada para o seu tipo de célula de interesse. Recomenda-se a validação extensiva da especificidade celular.
Para começar, colete um ovário do camundongo eutanasiado em 500 microlitros de tampão de lise nuclear e pique o ovário em oito partes dentro do tampão usando microtesouras de abertura automática. Transfira o ovário picado e o tampão de lise para um homogeneizador de vidro sobre gelo e homogeneize o ovário 10 a 20 vezes com o pilão solto A.Adicione 400 microlitros de tampão de lise ao pilão de lavagem homogeneizador de dounce A.E homogeneize o ovário com pilão B apertado 10 a 20 vezes. Transfira o homogeneizado para um tubo de fundo redondo de dois mililitros e centrifugar a 200 g por 1,5 minutos a quatro graus Celsius para remover o tecido indissociado e os vasos sanguíneos.
Depois de pré-umedecer um filtro de células de 30 micrômetros com 100 microlitros de tampão de lise, filtre o sobrenadante através do filtro em um tubo cônico de 15 mililitros. Transfira os núcleos contendo a mistura para um tubo de fundo redondo de dois mililitros. Centrifugar a amostra a 500 g durante cinco minutos a quatro graus Celsius e eliminar o sobrenadante.
Ressuspender a pelota de núcleos em 250 microlitros de tampão de lise gelada por vórtice brevemente em velocidade moderada a alta. Aumente o volume para 1,75 mililitros adicionando 1,5 mililitros de tampão de lise. Misture delicadamente e descanse a suspensão dos núcleos no gelo por cinco minutos.
Pelotar os núcleos por centrifugação a 500 g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. E descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar a pelota do núcleo. Ressuspenda o pellet em 200 microlitros de tampão de armazenamento gelado e vórtice brevemente para ressuspender completamente o pellet do núcleo.
Reserve 10% do pellet ressuspendido como amostra de núcleos de entrada para análise a jusante. Pegue o palete de núcleos ressuspendidos e perfaça o volume para dois mililitros com tampão de purificação nuclear gelado, ou NPB. Adicione 30 microlitros de contas ressuspensas para cada amostra em um tubo de fundo redondo de dois mililitros.
Em seguida, adicione um mililitro de NPB e ressuspenda bem por pipetagem. Coloque o tubo no rack magnético por um minuto para separar as contas. Descarte o sobrenadante e remova o tubo do ímã.
Ressuspenda as esferas magnéticas lavadas em um mililitro de NPB. Repita a etapa de lavagem para um total de três lavagens. E após a lavagem final, ressuspenda as contas no volume inicial do NPB.
Adicione 30 microlitros das contas lavadas a dois mililitros da suspensão nuclear e ressuspenda bem a mistura dos núcleos das contas pipetando e invertendo suavemente o tubo. Coloque os tubos em um misturador rotativo em uma câmara fria ou geladeira por 30 minutos em baixa velocidade e incube as amostras de entrada sem contas nas mesmas condições. Coloque os tubos com a suspensão de núcleos e as contas sobre o ímã por três minutos para separar os núcleos biotinilados ligados às esferas de estreptavidina da fração negativa dos núcleos.
Remova o sobrenadante. Passe a fração negativa para um tubo fresco de dois mililitros e reserve-a no gelo. Para cada tubo de fração positiva, remova o tubo do ímã e ressuspenda o conteúdo em um mililitro de NPB.
Coloque o tubo sobre o ímã por um minuto e descarte o sobrenadante. Ressuspender a mistura de núcleos fracionados da fração positiva em 30 microlitros de NPB. Transfira o ovário e 100 microlitros de tampão de homogeneização para um homogeneizador de vidro e homogeneize 10 a 20 vezes com o pilão solto A.Adicione 400 microlitros de tampão de homogeneização TRAP ao pilão de lavagem A e transfira o homogeneizado para um tubo de fundo redondo de dois mililitros.
Lave o homogeneizador com mais um mililitro de tampão de homogeneização TRAP e transfira o volume lavado para o tubo de fundo redondo de dois mililitros. Centrifugar o homogeneizado a 12.000 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. E transfira o sobrenadante limpo para um tubo de fundo redondo de dois mililitros.
Depois de descartar o pellet, transfira 100 microlitros do homogeneizado limpo para um tubo de fundo redondo de dois mililitros fresco e reserve-o como entrada no gelo. Incubar o restante do homogeneizado limpo com cinco microgramas por mililitro de anticorpo anti-GFP por uma hora a quatro graus Celsius enquanto gira em um misturador de ponta a ponta. Incubar a amostra de entrada na mesma condição.
Transfira 50 microlitros das esferas magnéticas da proteína G para cada amostra em um tubo de fundo redondo de dois mililitros. Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem com baixo teor de sal às contas e pipeta suavemente para misturar. Coloque o tubo em um suporte magnético por um minuto para coletar as contas contra o lado do tubo.
Depois de descartar o sobrenadante, remova o tubo do suporte magnético e adicione um mililitro de tampão de lavagem com baixo teor de sal ao tubo. Pipetar suavemente para misturar. Novamente, coloque o tubo no suporte magnético e repita o passo para um total de três lavagens.
Após a lavagem final, ressuspenda as contas no volume inicial de tampão de lavagem com baixo teor de sal. Transfira as esferas lavadas ressuspensas para a mistura de anticorpos da amostra de antígeno e incube a quatro graus Celsius durante a noite enquanto gira em um misturador de ponta a ponta. Incubar as amostras de entrada durante a noite nas condições equivalentes.
Depois disso, separe a fração positiva ou as esferas magnéticas com o RNA dos ribossomos alvo da fração negativa ou do sobrenadante usando o suporte magnético por 2,5 a 3 minutos. Aspirar a fração negativa. Coloque-o em um tubo de fundo redondo de dois mililitros fresco e reserve-o no gelo.
Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem com alto teor de sal ao tubo com a fração positiva e pipete suavemente para misturar. Coloque o tubo em um suporte magnético mantido sobre gelo por um minuto para separar as contas. Depois de descartar o sobrenadante, retire o tubo do ímã e repita o passo para um total de três lavagens.
Após a lavagem final, ressuspender as esferas em 350 microlitros de tampão de lise de RNA suplementado com 3,5 microlitros de 2-mercaptoetanol. Incubar os tubos à temperatura ambiente enquanto mistura durante 10 minutos a 900 RPM num agitador digital. Separe as esferas da solução que agora contém o RNA dos ribossomos alvo com um suporte magnético por um minuto à temperatura ambiente.
Coletar a fração positiva eluída em um tubo fresco de 1,5 mililitro. A imagem de imunofluorescência foi realizada nos ovários parafinizados de camundongos Cyp17-Cre positivo NuTRAP flox e Cyp17-Cre negativo NuTRAP flox. A proteína EGFP foi corada usando o anticorpo primário de cabra anti-GFP e o anticorpo secundário de Alexa 488 anti-cabra de burro, e os núcleos foram corados com DAPI.
As imagens foram obtidas em microscópio de fluorescência com aumento de 20x. O RNA da fração de entrada e TRAP positivo foi isolado de ovários de camundongos NuTRAP flox Cyp17-Cre positivo e sequenciado de forma pareada. A análise de componentes principais de todos os genes expressos mostrou uma separação da entrada do TRAP e das frações positivas no primeiro componente.
O gráfico vulcânico de genes diferencialmente expressos entre as frações de entrada e positivas é mostrado aqui. A comparação da fração positiva do TRAP com a entrada mostrou um enriquecimento global dos genes marcadores de células do estroma/teca e a depleção dos genes marcadores de ovócitos, granulosas, imunes e de células musculares lisas na fração positiva do TRAP. Após a primeira centrifugação da suspensão nuclear para remover vasos sanguíneos indissociados, os núcleos estão no sobrenadante.
Certifique-se de manter o sobrenadante e descarte o pellet neste ponto. Seguindo o método intacto, várias técnicas epigenômicas podem ser conduzidas, incluindo ensaios de acessibilidade da cromatina ou modificações no DNA, entre outros. Seguindo o método TRAP, RT-qCPR ou sequenciamento de RNA podem ser realizados para avaliar o translatome.
Esta é a primeira aplicação do método NuTRAP no ovário de camundongos. Isso permite análises epigenômicas e transcriptômicas de alto rendimento de tipos específicos de células ovarianas, que podem ser usadas para estudar o envelhecimento ou o câncer ovariano.
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Visão Geral
Este estudo otimiza os métodos de purificação por afinidade de ribossomos em tradução (TRAP) e isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACT) para análise conjunta do transcriptoma e epigenoma ovarianos em um modelo murino. A abordagem permite a análise de populações celulares ovarianas específicas sem a necessidade de separação celular, facilitando o entendimento de alterações específicas de tipo celular associadas ao envelhecimento.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Análise específica de tipo celular
- Envelhecimento ovariano
- Investigação transcriptômica e epigenômica
Antecedentes
- Compreender o envelhecimento ovariano é essencial para abordar a infertilidade feminina.
- Os métodos atuais frequentemente exigem separação celular, o que pode limitar a produtividade.
- Esta técnica oferece uma maneira simplificada de analisar ovários do mesmo camundongo.
Métodos Utilizados
- Métodos TRAP e INTACT otimizados
- Modelo de camundongo NuTRAP cruzado com a linhagem Cyp17a1-Cre
- Coleta de ovário único e protocolos específicos para isolamento nuclear
Resultados Principais
- Permitiu a análise emparelhada de dados transcriptômicos e epigenômicos.
- Revelou alterações específicas de tipo celular nos ovários relacionadas ao envelhecimento.
- Validou o potencial deste método para aplicação mais ampla em diversos tipos celulares.
Conclusões
- O método demonstra eficácia no isolamento de ácidos nucleicos de populações celulares ovulares específicas.
- Essa abordagem tem implicações significativas para estudos voltados à saúde reprodutiva feminina.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A investigação emparelhada do epigenoma e do transcriptoma ovarianos com resolução em nível de tipo celular aborda uma lacuna crítica na compreensão dos mecanismos de envelhecimento e doenças ovarianas. O modelo NuTRAP, que utiliza os métodos TRAP e INTACT, permite o perfilhamento de ácidos nucleicos específico por célula em alto rendimento, sem necessidade de separação celular, favorecendo a confiança preditiva na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas. Essa capacidade é diretamente relevante para decisões em portfólios na biologia reprodutiva e na descoberta translacional de biomarcadores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de alterações moleculares específicas de tipo celular subjacentes ao envelhecimento ovariano e a doenças.
- Apoia a validação funcional de alvos ao associar estados epigenômicos e transcriptômicos em populações celulares definidas.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao isolar as contribuições das células estromais para fenótipos ovarianos.
- Aprimora a confiança preditiva para o avanço de alvos implicados na senescência reprodutiva.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Fornece amostras validadas de ácidos nucleicos específicas para cada célula para sequenciamento e ensaios moleculares subsequentes.
- Elimina a necessidade de separação celular, aumentando a produtividade e reduzindo a complexidade operacional.
- Permite a preparação reprodutível de material biológico para leituras quantitativas de transcriptômica e epigenômica.
- Permite a padronização de ensaios em diferentes tipos celulares ovarianos utilizando linhagens com marcador Cre.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha o perfil molecular com populações celulares ovarianas relevantes para a doença, visando o desenvolvimento de biomarcadores translacionais.
- Permite continuidade da descoberta até a validação pré-clínica, apoiando análises moleculares resolvidas por tipo celular.
- Reduz riscos em hipóteses translacionais ao esclarecer as contribuições específicas de cada célula no envelhecimento ovariano e na infertilidade.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir o perfil molecular específico de tipos celulares a partir de um único ovário, apoiando tanto descobertas iniciais quanto fluxos de trabalho de pesquisa translacional.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses e a clarificação de vias em modelos de envelhecimento ovariano e doenças.
- Triagem: Fornece amostras reprodutíveis e quantitativas de ácidos nucleicos para sequenciamento e ensaios moleculares subsequentes.
- Análises: Fornece dados transcriptômicos e epigenômicos pareados para comparação estatística robusta de populações celulares.
- Pesquisa Translacional: Apoia o alinhamento de biomarcadores e a validação de modelos relevantes para doenças na biologia reprodutiva.
- Reutilização Empresarial: Adaptável a qualquer tipo celular com um vetor Cre disponível, permitindo ampla aplicação em diversos programas de pesquisa.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos específicos de tipo celular.
- Valor Operacional: Otimiza fluxos de trabalho ao eliminar a classificação celular, aumentando a produtividade e a reprodutibilidade.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao permitir análises moleculares celulares com alto conteúdo informativo.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos e modelos na pesquisa ovariana e reprodutiva.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em genética Cre-lox e validação da especificidade por tipo celular.
- Necessita de acesso à instrumentação padrão de biologia molecular e infraestrutura de sequenciamento.
- Exige padronização rigorosa entre equipes para garantir reprodutibilidade e comparabilidade dos dados.
- Adaptável a diferentes sistemas modelo com linhagens Cre disponíveis para populações celulares específicas.
- Depende da disponibilidade e validação de linhagens Cre apropriadas para o tipo celular de interesse.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:16
Creation of the Nuclei Suspension
4:03
Isolation of Nuclei Tagged in Specific Cell Types (INTACT)
6:02
Performing Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP)
10:02
Results: Validation of Cyp17-NuTRAP Mouse Model
11:26
Conclusion
