Name: Detecção em Tempo Real da Produção de Espécies Reativas de Oxigênio na Resposta Imune em Arroz com Ensaio de Quimioluminescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Aprenda a detectar espécies reativas de oxigênio em tempo real em tecidos de arroz usando ensaio de quimioluminescência com L-012. Este método padronizado permite estudar respostas imunes ativadas por PAMPs de forma reprodutível.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios da Shanghai Natural Science Foundation (Número de Bolsa: 21ZR1429300/BS1500016), Shanghai Jiao Tong University (Programa Agri-X, Número de Bolsa:AF1500088/002), Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (Número de Bolsa: ZXWH2150201/001) para Jiangbo Fan, e pelo Projeto de Colaboração de Engenharia Médica da Shanghai Jiao Tong Univesity (Número de Bolsa: 21X010301734) para Can Li.

NOTA: O protocolo é aplicável a diferentes tecidos vegetais. Bainha de arroz e discos foliares foram utilizados neste protocolo para detecção de ROS após elicitação de PAMP. Uma vez que as diferenças surgem principalmente devido ao método de amostragem, apenas os procedimentos comuns são descritos a seguir, sendo mencionadas etapas específicas sempre que necessário.
1. Cultura vegetal
<ol><li>Esterilizar as sementes de arroz descascadas com etanol 70% por 1 min e, em seguida, com hipoclorito de sódio (NaClO) a 40% por 1 h. Em seguida, enxágue as sementes 5x com água estéril para remover o cloro residual.</li>
	<li>Planear as sementes assepticamente em meio 1/2 MS (2,37 g/L de meio Murashige e Skoog (MS), 30 g/L de sacarose, 2,1 g/L de fitanel, pH 5,7, autoclavado).<ol><li>No método da bainha de arroz, plaquear diretamente as sementes no recipiente de vidro estéril com meio MS.</li>
		<li>No método do disco foliar, plaquear as sementes em placas MS por 5-7 dias e transplantá-las para matriz de crescimento ou solo (Figura 1A).</li>
	</ol></li>
	<li>Cultivar as mudas em sala de crescimento com fotoperíodo de 12 h claro/12 h escuro.</li>
</ol>2. Preparo e pré-tratamento dos tecidos
<ol><li>Bainha de arroz<ol><li>Cortar a bainha de mudas de arroz com 10 dias de idade em segmentos de 3 mm com lâmina de barbear afiada ou lâmina cirúrgica para pré-tratamento 1 dia antes do ensaio de ROS (Figura 1B).</li>
		<li>Colocar cinco segmentos de bainha em um poço individual de uma placa de microtitulação de 96 poços contendo 100 μL deddH 2 O por 10-12 h, no escuro a 25 °C, o que permite que o extravasamento de íons relacionados à lesão da ferida e as respostas de defesa diminuam (Figura 2). NOTA: Tomar o cuidado de manter os cortes verticais para garantir uma área de superfície de corte consistente exposta à solução de elicitação é um passo importante para obter resultados altamente reprodutíveis. Mova os segmentos suavemente. Não faça cortes ou feridas extras nos segmentos, o que pode ser uma fonte de variação de dados. Como princípio, cada teste deve conter pelo menos cinco repetições, uma vez que a variação do valor de ROS é grande. Quanto mais replicações definidas, mais confiáveis são os dados.</li>
	</ol></li>
	<li>Disco foliar<ol><li>Cortar os discos foliares (4 mm de diâmetro) de plantas de arroz com 4-6 semanas de idade usando um punch de biópsia com um êmbolo. Sempre corte os discos foliares do terço médio da segunda folha (numerados a partir do topo) do perfilhos principal para reduzir a variação dos dados (Figura 1C).</li>
		<li>Colocar um disco foliar em um poço individual de uma placa de microtitulação de 96 poços contendo 100 μL deddH 2 O por 10-12 h para pré-tratamento, o que permite que as respostas relacionadas à ferida diminuam, pois estas podem interferir na indução de ROS por PAMPs (Figura 2). NOTA: Opere os discos de folha suavemente. Não faça cortes ou feridas extras nos discos no experimento, o que poderia resultar em variação de dados. A indução de ERO ocorre principalmente a partir das células da borda de corte, uma vez que as superfícies dos tecidos do arroz (folhas ou bainhas), são cobertas por camadas hidrofóbicas. Apenas as células das arestas de corte estão em contato com a solução de elicitação (consulte a seção de discussão).</li>
		<li>Manter todos os discos foliares flutuando, com a superfície abaxial voltada para cima, nos poços de uma placa de microtitulação para pré-tratamento com água para evitar variação associada ao lado da folha.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64776/64776fig01.jpg"> Figura 1: Condições de crescimento e estádios das plântulas de arroz para amostragem da bainha e partes da bainha e folhas de arroz utilizadas no ensaio. (A) Mudas de arroz cultivadas em meio 1/2 MS em condições estéreis por 10 dias podem ser amostradas para o ensaio de ERO. Sementes de arroz esterilizadas foram cultivadas em meio MS 1/2 e cultivadas em fotoperíodo claro de 12 h/12 h escuro em frasco de vidro transparente, com 8,5 cm de diâmetro e 15 cm de altura. (B) Diagrama esquemático das partes de amostragem das bainhas foliares. Bainhas foliares foram cortadas de mudas de arroz com 10 dias de idade. As posições das bainhas foliares estavam acima das raízes e abaixo da primeira folha. (C) Diagrama esquemático da posição de amostragem dos discos foliares. Os discos foliares podem ser cortados a partir do terço médio da segunda folha (contagem a partir do topo) do perfilhos principal de plantas saudáveis de arroz em qualquer fase de crescimento. Abreviações: ROS = espécies reativas de oxigênio; MS = Murashige e Skoog. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64776/64776fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64776/64776fig02.jpg"> Figura 2: Diagrama esquemático do setup da placa para medição da produção de ROS com diferentes linhas de Oryza sativa. Pré-tratamento e teste de tecidos de arroz usando uma placa de 96 poços. A Linha 1, Linha 2 e Linha 3 (até oito linhas em uma placa) podem ser qualquer material de interesse, diferentes cultivares, mutantes ou linhas transgênicas. Os tecidos foram estimulados com soluções de elicitação com PAMP (PAMP, branco) ou sem PAMP (ddH2O, cinza) para medir a resposta das ROS. Ressalta-se que quanto maior o número de amostras a serem testadas, maior o intervalo de tempo entre as leituras. Abreviações: ROS = espécies reativas de oxigênio; PAMP = padrão molecular associado a patógenos; ddH2O = água bidestilada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64776/64776fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. Preparando a solução de elicitação
<ol><li>Dissolver L-012 pó em solução aquosa de 20 mM (6,23 mg/mL) com ddH2O para fazer a solução-mãe. Em seguida, diluir a solução-mãe com tampão Tris HCl 50 mM (pH 7,5) para fazer a solução de trabalho na concentração final de 500 μM L-012. Manter a solução-mãe congelada e diluir para a solução de trabalho antes de utilizar.</li>
	<li>Preparar a solução de elicitação contendo PAMP, L-012 e peroxidase de raiz forte (HRP; 10 mg/mL em ddH2O). Para uma solução de elicitação de 10 mL, misturar 9,4 mL de solução de Tris HCl (pH 7,5) 50 mM, 400 μL da solução L-012, 100 μL de HRP e 100 μL de flg22 (PAMP; 10 mM em ddH2O). Para o controle negativo, adicionar 100 μL de ddH2O em vez de PAMP. NOTA: Manter as soluções de elicitação preparadas à temperatura ambiente para evitar o stress frio dos tecidos do arroz. Outros PAMPs também podem ser usados para tratamento conforme necessário, como quitina (20 ng/mL na concentração final). Como o L-012 é sensível à luz, cubra todos os tubos contendo a solução L-012 com folha de alumínio.</li>
</ol>4. Iniciar o software e configurar o protocolo com o leitor de microplacas referenciado (ver Tabela de Materiais)
NOTA: Leva algum tempo para configurar os parâmetros do software leitor de microplacas. Recomenda-se preparar a máquina e o protocolo (um clique para prosseguir) antes de adicionar a solução de elicitação.
<ol><li>Inicie o software. Clique no botão Experimentos para criar um novo protocolo ou usar um protocolo existente.</li>
	<li>Clique em Procedimento no pop-up para configurar a placa. Selecione os poços da placa a ser monitorada.</li>
	<li>Clique em Iniciar cinética para configurar o tempo total de execução e o intervalo de leitura. Defina o tempo de execução para 35 min ou mais, dependendo dos requisitos experimentais. Para obter leituras com a maior frequência possível, selecione Intervalo mínimo. Para tempo de integração, escolha 1 s ou mais, dependendo da intensidade do sinal. NOTA: O intervalo de leitura depende do número de amostras e da duração da integração do sinal.</li>
	<li>Clique em Validar | OK para confirmar as configurações.</li>
	<li>Clique em Detectar a nova placa no pop-up e aguarde até que o software solicite a caixa de diálogo da placa de carga. Coloque a placa a ser testada no suporte.</li>
	<li>Pare aqui para aguardar o estabelecimento do sistema de elicitação (na próxima seção). Assim que o sistema de elicitação estiver pronto, clique em Executar para iniciar a leitura.</li>
</ol>5. Estabelecer o sistema de elicitação e medir a produção de ROS em tempo real
<ol><li>Remover cuidadosamente o ddH2O dos orifícios que contêm os tecidos pré-tratados, evitando qualquer dano tecidual ou dessecação.</li>
	<li>Use uma pipeta multicanal para adicionar 200 μL da solução de elicitação aos poços contendo os tecidos.</li>
	<li>Agite suavemente para misturar. Clique em Executar para iniciar a detecção. NOTA: Com o tratamento com PAMP, os tecidos vegetais respondem e produzem ROS muito rapidamente. Portanto, sugere-se que o controle negativo sem PAMP seja tratado primeiramente para reduzir o tempo de operação, quando há múltiplos tratamentos. Operar o mais rápido possível para reduzir o atraso de elicitação entre os tratamentos. Quanto menor o tempo entre a adição da solução de elicitação e o início da detecção, melhor será a captura de dados experimentais importantes.</li>
</ol>

<ol><li>Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+as+signals+that+modulate+plant+stress+responses+and+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death.</a> Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).</li>
<li>Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+are+good%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">ROS are good.</a> Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).</li>
<li>Gilroy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS%2C+calcium%2C+and+electric+signals%3A+key+mediators+of+rapid+systemic+signaling+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants.</a> Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).</li>
<li>Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+gene+network+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen gene network of plants.</a> Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).</li>
<li>Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+burst+of+plant+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A burst of plant NADPH oxidases.</a> Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).</li>
<li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).</li>
<li>Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+and+redox+signalling+in+the+response+of+plants+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress.</a> Plant, Cell & Environment. 35 (2), 259-270 (2012).</li>
<li>Suzuki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+burst+oxidases%3A+the+engines+of+ROS+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).</li>
<li>Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+NADPH+oxidase+RBOHD+during+plant+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity.</a> Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).</li>
<li>Segonzac, C., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+plant+pattern-recognition+receptors+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria.</a> Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).</li>
<li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li>
<li>Hong, D., Joung, H. -A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attomolar+detection+of+cytokines+using+a+chemiluminescence+immunoassay+based+on+an+antibody-arrayed+CMOS+image+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).</li>
<li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+new+sensitive+chemiluminescence+probe%2C+L-012%2C+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li>
<li>Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+regulation+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 648(2015).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

O objetivo deste estudo foi estabelecer um método altamente eficiente para quantificar a produção precoce de ERO em resposta ao PAMP em tecidos de arroz. Este método fornece um procedimento padronizado para a determinação em tempo real de ROS de apoplasto produzido a partir de tecidos de arroz tratados. Este método é simples na operação, baixo custo, claro na composição e independente de kits comerciais. Usando este método, os pesquisadores podem estudar a produção em tempo real de ROS apoplasto quando as plantas são sub...

As espécies reativas de oxigênio (EROs) compreendem uma série de derivados quimicamente ativos do oxigênio, incluindo radicais ânion superóxido (O2-) e seus derivados, radicais hidroxila (OH-), peróxido de hidrogênio e produtos de oxigênio singlete ou reações de oxidação-redução, que são constantemente produzidos em plastídios e cloroplastos, mitocôndrias, peroxissomas e outros locais subcelulares 1 . As ERO desempenham papéis importantes em muitos processos biológicos e são essenciais para todas as plantas 2,3,4. O amplo espectro de funções das ROS varia desde a regulação do crescimento e desenvolvimento até a percepção de estresses abióticos e bióticos 5,6,7,8.
No sistema imune vegetal, os receptores localizados na membrana plasmática das células vegetais - os chamados receptores de reconhecimento padrão (PRRs) - percebem padrões moleculares associados a patógenos derivados de patógenos (PAMPs). Esse reconhecimento desencadeia uma série de respostas imunes rápidas, incluindo influxo de cálcio, explosão de ROS e cascata MAPK; assim, essa camada de imunidade é denominada imunidade desencadeada por PAMP (PTI). O ROS burst é uma resposta marcante do ITP, cuja determinação é amplamente aplicada em estudos relacionados a PTI 9,10. A produção de EROs desencadeada por PAMPs é atribuída às proteínas da família NADPH oxidase residentes na membrana plasmática, ou proteínas da família RBOH (respiratory burst oxidase homolog), que transferem elétrons de NADPH citosólico ou NADH para oxigênio extracelular para produzir superóxido (O 2-) que é espontaneamente convertido em peróxido de hidrogênio (H 2 O 2) pela superóxido dismutase8 . A explosão de ROS desencadeada por PAMP é bastante rápida, aparecendo apenas alguns minutos após o tratamento com PAMP e atingindo um pico de ~10-12 min. A grande maioria das moléculas de ROS compreende peróxido de hidrogênio (H2 O2), que pode ser fácil e constantemente detectado com um ensaio de quimioluminescência.
Na quimioluminescência, o reagente quimioluminescente reage com oxigênio ativo, sob a ação de um catalisador, para produzir os intermediários de estado excitado. Em seguida, os elétrons no produto retornam ao estado fundamental através de transição não radiativa e emitem fótons. Os quimioluminescentes comuns incluem luminol e L-012, com luminol dominando a aplicação11,12,13. No entanto, mais pesquisadores estão escolhendo L-012 para detectar a produção de ROS, uma vez que L-012 tem uma eficiência de emissão de luz muito maior sob condições de pH neutro ou quase neutro em comparação com o luminol.
Este trabalho descreve um método otimizado de quimioluminescência, baseado em L-012, para a detecção em tempo real da produção de ERO após a eliciação de PAMPs em tecidos-discos foliares e bainha de arroz (Oryza sativa). O método aqui apresentado é simples, estável e padronizado, e é altamente adaptável para atender a diferentes necessidades experimentais. Os dados obtidos com este método são altamente reprodutíveis sob condições firmemente controladas.

<table><tbody><tr><td>Placa de microtitulação de 96 poços</td><td>WHB</td><td>WHB-96-01</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Innochem</td><td>A43543</td><td></td></tr><tr><td>flg22</td><td>Sangon Biotech</td><td>p20973</td><td>PAMP</td></tr><tr><td>Gen5</td><td>Software BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-012</td><td>FUJIFILM</td><td>120-04891</td><td>8-amino-5-cloro-7-fenil-2,3-dihidropirido [3,4-d] piridazina-1,4-diona, CAS #: 143556-24-5</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>MS Medium</td><td>Solarbio</td><td>M8521</td><td></td></tr><tr><td>NaCLO</td><td>Aladdin</td><td>S101636</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase de rábano (HRP)</td><td>Sigma</td><td>P8375</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Sampler</td><td>Miltex&nbsp;</td><td>15110-40</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A502792</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610195</td><td></td></tr></tbody></table>

detecção em tempo real da produção de espécies reativas de oxigênio na resposta imune em arroz com ensaio de quimioluminescência

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Espécies reativas de oxigênio (ROS) desempenham papéis vitais em uma variedade de processos biológicos, incluindo a detecção de estresses abióticos e bióticos. Após a infecção do patógeno ou desafio com produtos químicos associados a patógenos (padrões moleculares associados a patógenos [PAMPs]), uma série de respostas imunes, incluindo uma explosão de ROS, são rapidamente induzidas em plantas, o que é chamado de imunidade desencadeada por PAMP (PTI). A explosão de ROS é uma resposta característica do PTI, que é catalisada por um grupo de NADPH oxidases localizadas na membrana plasmática - as proteínas da família RBOH. A grande maioria das ERO compreende peróxido de hidrogênio (H2 O2), que pode ser fácil e constantemente detectado por um método de quimioluminescência à base de luminol. A quimioluminescência é uma reação produtora de fótons na qual o luminol, ou seu derivado (como L-012), sofre uma reação redox com ROS sob a ação de um catalisador. Este trabalho descreve um método otimizado de quimioluminescência baseado em L-012 para detectar a produção de ROS de apoplasto em tempo real após a elicitação por PAMP em tecidos de arroz. O método é fácil, estável, padronizado e altamente reprodutível sob condições firmemente controladas.

Aqui, tomamos o material de arroz como exemplo para determinar as ROS produzidas com o tratamento flg22. A geração de ROS após a elicitação é transitória. No arroz, o aumento na produção de ROS foi detectado pela primeira vez em 1-2 min, atingiu o pico em 10-12 min e retornou à linha de base em ~30-35 min (Figura 3). Em comparação com o teste controle, no qual PAMP estava ausente na solução de elicitação, resultando em indução de ROS sem óbvia, um burst específico de ROS foi induzido apenas ...

Aqui, descrevemos um método para a detecção em tempo real da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) apoplásicas em tecidos de arroz em resposta imune desencadeada por padrão molecular associado a patógenos. Este método é simples, padronizado e gera resultados altamente reprodutíveis em condições controladas.

Detecção em Tempo Real da Produção de Espécies Reativas de Oxigênio na Resposta Imune em Arroz com Ensaio de Quimioluminescência

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

Este protocolo descreve um método otimizado de quimioluminescência baseado em L-012 para detectar a produção de ROS em tempo real após a elicitação de PAMP em tecidos de arroz. Este método é fácil, padronizado e altamente reprodutível sob condições firmemente controladas. Quem demonstrará esse procedimento será On Ying, estudante de doutorado do meu laboratório.Para começar, esterilize as sementes de arroz descascadas com etanol 70% por um minuto e, em seguida, com hipoclorito de sódio a 40% por uma hora. Enxágue as sementes cinco vezes com água estéril para remover o cloro residual. No método da bainha de arroz, plaquear diretamente as sementes no recipiente de vidro estéril com meio Murashige e Skoog ou MS.Para plaquear as sementes pelo método do disco foliar, plaqueie-as em placas MS por cinco a sete dias e, em seguida, transplante-as para a matriz de crescimento ou solo. Cultivar as mudas em uma sala de crescimento com um período de fotos de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Cortar a bainha de mudas de arroz com 10 dias de idade em segmentos de três milímetros com lâmina de barbear afiada ou lâmina cirúrgica para pré-tratamento um dia antes do ensaio de ROS.Coloque cinco segmentos de bainha em um poço individual de uma placa de microtitulação de 96 poços contendo 100 microlitros de água bidestilada por 10 a 12 horas. Corte os discos foliares de plantas de arroz de quatro a seis semanas usando um punch de biópsia com um êmbolo. Sempre corte os discos foliares a partir do terço médio da segunda folha do perfilhador principal para reduzir a variação dos dados.Em seguida, colocar um disco foliar em um poço individual de uma placa de microtitulação de 96 poços contendo 100 microlitros de água bidestilada por 10 a 12 horas para pré-tratamento. Mantenha todos os discos foliares flutuando e virados para cima nos poços de uma placa de microtitulação para pré-tratamento de água para evitar variação associada ao lado da folha. Prepare a solução de elicitação combinando 9,4 mililitros de 50 micromolares Tris Hcl, 400 microlitros de solução L012, 100 microlitros de peroxidase de rabanete de cavalo e 100 microlitros de Flg22.Adicionar 200 microlitros de solução de elicitação aos poços. Inicie o software e clique no botão de experimentos para criar um novo protocolo ou usar um protocolo existente. Clique no procedimento no pop-up para configurar a placa e selecionar os poços da placa a serem monitorados.Clique em iniciar cinética e defina o tempo de execução para 30 minutos ou mais, dependendo dos requisitos experimentais. Selecione o intervalo mínimo para obter as leituras com a maior frequência possível. E para o tempo de integração, escolha um segundo ou mais, dependendo da intensidade do sinal.Clique em validar, seguido de Ok para confirmar as configurações, em seguida, clique em detectar a nova placa no pop-up e aguarde até que o software avise a caixa de diálogo da placa de carga. Remova cuidadosamente a água bidestilada dos poços que contêm os tecidos pré-tratados, evitando qualquer dano tecidual ou dessecação. Use uma pipeta multicanal para adicionar 200 microlitros da solução de elicitação aos poços contendo os tecidos.Coloque a placa a ser testada no suporte e inicie a detecção. Para a indução de ERO por Flg22, foram utilizados discos foliares e bainhas de três milímetros de comprimento. A geração de ROS é monitorada por 35 minutos.As barras indicam as médias dos desvios-padrão calculados a partir de cinco repetições técnicas. No arroz, o aumento na produção de ERO foi detectado pela primeira vez em um a dois minutos, atingiu o pico em 10 a 12 minutos e retornou à linha de base em cerca de 30 a 35 minutos. A quantidade total de ROS foi calculada a partir da curva.Para obter a quantidade total de valores de ROS, aplique a fórmula aos conjuntos de dados correspondentes para calcular o ROS gerado em cada intervalo de tempo, que pode ser combinado aplicando a soma da fórmula para calcular a quantidade total gerada. Um único orifício ou duas metades de um disco foliar foram colocados nos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços pré-tratada com 100 microlitros de água bidestilada por 10 a 12 horas e, em seguida, tratada com Flg22 para indução de EROs. Os valores de leitura das duas amostras de meio disco são muito maiores do que os do disco de folha inteira.Em média, os valores totais das duas amostras de meio disco são quase 1,6 vezes maiores do que os do disco foliar inteiro, o que é proporcional ao comprimento da borda, não à área das amostras. Esse resultado confirma que as ERO são geradas principalmente nas células do local da ferida. Ao tentar com este procedimento, opere com os tecidos suavemente e não faça cortes extras que poderiam ser uma fonte de variação de dados.Este método pode ser aplicado a qualquer outro processo fisiológico produtor de ERO em tecidos vegetais.

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Biologia

Aqui nós propor métodos simples para testar e avaliar a presença de espécies reativas de oxigênio nas células.

Produção e Detecção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) em Câncer

Um método eficiente para obter insights sobre visualizando o parácrinos derivados de indução de ROS endotelial sinalização de Ca2 + é descrito. Esse método leva vantagem de medir parácrina ROS derivados provocou mobilização de Ca2 + em células endoteliais vasculares em um modelo de co-cultura.

Visualização dos Vascular Ca 2 + Sinalização Disparado por parácrina ROS Derivado

Este vídeo demonstra um ensaio para medir a explosão oxidativa em folhas de Arabidopsis após a elicitação imunológica. Os discos foliares, cortados das folhas das plantas, são incubados com peptídeos bacterianos que funcionam como padrões moleculares associados a micróbios ou MAMPs. Após a detecção dos MAMPs, as células vegetais induzem a produção de ROS extracelular, que é detectada usando um ensaio de quimioluminescência.

Um ensaio para detectar explosão oxidativa em discos de folhas de Arabidopsis após elicitação imune

Este vídeo demonstra um ensaio para detecção em tempo real da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em tecidos de arroz após a elicitação do padrão molecular associado a patógenos (PAMP). Os segmentos da bainha cortada e os discos das folhas são expostos a um peptídeo derivado de flagelos bacterianos que funciona como um PAMP. Após o reconhecimento do peptídeo por meio de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) nas células vegetais, ocorre uma produção rápida e transitória de...

Um ensaio para detectar a produção de espécies reativas de oxigênio em tecidos de arroz após elicitação imunológica

Nós adaptamos um conjunto de protocolos para a medição de espécies reativas de oxigênio (ROS) que podem ser aplicados em vários modelos celulares ameba e mamíferos para estudos qualitativos e quantitativos.

Detectando, visualizar e quantificar a geração de espécies reativas de oxigênio em um modelo de sistema Amoeba

Este trabalho descreve dois métodos para quantificar as respostas de defesa em Arabidopsis Arabidopsis thaliana após a exposição aos elicitors imunes: o estouro oxidativo transiente, e a inibição do crescimento de plântulas.

Ensaios de explosão oxidativa desencadeada por padrão e inibição do crescimento de plântulas em Arabidopsis Arabidopsis thaliana

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar espécies totais de oxigênio reativa celular (ROS) usando diacetato de 2',7'-diclorodihifluoresceína (DCFH-DA). Este método pode visualizar a localização ros celular em células aderentes com um microscópio de fluorescência e quantificar a intensidade ros com um leitor de placas de fluorescência. Este protocolo é simples, eficiente e econômico.

Detecção de Espécies totais de oxigênio reativo em células aderentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Escherichia coli é a principal causa de meningite bacteriana gram-negativa neonatal. Durante a infecção bacteriana, espécies reativas de oxigênio produzidas por neutrófilos desempenham um papel bactericida importante. Aqui introduzimos um método para detectar as espécies reativas de oxigênio em neutrófilos em resposta à meningite E. coli.

Quantificação em tempo real de espécies de oxigênio reativo em neutrófilos infectados com meningite escherichia coli

Aqui, apresentamos um protocolo de ensaio de quimiotaxis melhorado. O objetivo deste protocolo é reduzir as etapas e custos dos métodos tradicionais de quimioterapia bacteriana e servir como um recurso valioso para a compreensão das interações entre plantas e micróbios.

Um ensaio de quimiotaxis melhorado para a identificação rápida de quimioattractants rizobacterianos em Exudates radiculares

Este protocolo descreve um novo método para quantificar espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelulares usando diidroetídio (DHE) como sonda de fluorescência usando uma abordagem de triagem de alto rendimento. O protocolo descreve os métodos para avaliação quantitativa das espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelulares nas três diferentes linhagens celulares de carcinoma hepatocelular.

Avaliação de triagem de alto rendimento da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) usando corante de fluorescência Dihidroetídio (DHE)

Aprenda a detectar espécies reativas de oxigênio em tempo real em tecidos de arroz usando ensaio de quimioluminescência com L-012. Este método padronizado permite estudar respostas imunes ativadas por PAMPs de forma reprodutível.

Detecção em Tempo Real da Produção de Espécies Reativas de Oxigênio na Resposta Imune em Arroz com Ensaio de Quimioluminescência (Vídeo) | JoVE Journal

Detecção em Tempo Real da Produção de Espécies Reativas de Oxigênio na Resposta Imune em Arroz com Ensaio de Quimioluminescência

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