Name: Rápido Desenvolvimento de Circuitos de Identificação do Estado Celular com Poli-Transfecção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprenda a desenvolver circuitos genéticos de identificação do estado celular usando poli-transfecção em células mamíferas. Este método permite testar múltiplas estequiometrias em um único poço, aumentando a eficiência experimental.

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Gostaríamos de agradecer aos ex-membros do Weiss Lab que lideraram ou contribuíram para o desenvolvimento do método de politransfecção e sua aplicação em classificadores celulares: Jeremy Gam, Bre DiAndreth e Jin Huh; outros membros do laboratório Weiss que contribuíram para o desenvolvimento/otimização de métodos: Wenlong Xu, Lei Wang e Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard e membros do grupo, incluindo Patrick Donahue e Hailey Edelstein, por testar a politransfecção e fornecer feedback; e ao Prof. Nika Shakiba por convidar este manuscrito e fornecer feedback. Também gostaríamos de agradecer aos Institutos Nacionais de Saúde [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]; Fundação Nacional de Ciência [1745645]; Cancer Center Support (core) Grant [P30CCA14051, em parte] do NCI e National Institutes of Health [P50GM098792] para financiar este trabalho.

NOTA: A Tabela 1 e a Tabela 2 servem como referências significativas para este protocolo. A Tabela 1 mostra a escala de reagentes para as reações, e a Tabela 2 mostra a aritmética da razão de DNA para um exemplo de politransfecção descrito no protocolo (metade superior) e para um possível experimento de seguimento (metade inferior).
1. Preparação das células para transfecção
<ol><li>Certifique-se de que a cultura de células de rim embrionário humano (HEK293) seja 60%-80% confluente antes de iniciar o protocolo. Para isso, semeie 1 x 106 células em uma placa de Petri de cultura de tecido de 100 mm x 15 mm 2 dias antes e incube a 37 °C com 5% de CO2. NOTA: Embora nosso protocolo se concentre em células HEK293, outros tipos de células podem ser substituídos.</li>
	<li>Prepare os meios e células para transfecções conforme descrito abaixo.<ol><li>Pré-aquecer pelo menos 20 ml de uma solução de meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA; ver Tabela de Materiais) a 37 °C. Pré-aquecer pelo menos 2,4 mL de tripsina e 2,4 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 37 °C também. Meio de soro pré-aquecido reduzido para ~16 °C. OBS: Todo trabalho de cultura de tecidos deve ser realizado com cuidado em uma cabine de biossegurança.</li>
	</ol></li>
	<li>Ressuspenda as células na solução DMEM conforme descrito abaixo.<ol><li>Aspirar e descartar os meios atuais. Dispensar 2 mL de PBS na cultura de células HEK293 para lavar as células. Aspirar e eliminar o PBS.</li>
		<li>Dispensar 2 mL de tripsina na cultura celular HEK293. Coloque a placa de Petri em uma incubadora a 37 °C por 3 min ou até que as células não aderam mais à placa. Devolver a placa ao armário de biossegurança e diluir a solução celular dispensando 8 ml de solução de DMEM na placa.</li>
		<li>Misture a solução pipetando suavemente para cima e para baixo várias vezes. Aspirar todo o meio e colocá-lo em um tubo cônico de 15 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugar as células a 300 x g por 3 min para pastilha-las. Aspirar o meio (tomando cuidado para não aspirar as células) e descartá-lo. Ressuspender as células em 5 mL de solução de DMEM, misturando suavemente pipetando para cima e para baixo.</li>
	<li>Estime a concentração celular atual usando um contador de células automatizado (listado na Tabela de Materiais). Semeando seis poços (neste exemplo) em uma placa de 24 poços com 1 x 105 células (para uma densidade de semeadura de 50.000 células/cm2).</li>
	<li>Adicione a solução de DMEM até 500 μL (adicione a solução de DMEM aos poços primeiro) e, em seguida, rotule um poço por tratamento da seguinte forma: nenhum controle de cor, controle mKO2, controle TagBFP, controle NeonGreen, controle de todas as cores e politransfecção 1. Os poços de controle TagBFP, mKO2 e NeonGreen são controles de cor única para todas as proteínas fluorescentes incluídas na politransfecção.</li>
</ol>2. Realização da transfecção
<ol><li>Prepare tubos para cada agregado de DNA. Separe tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e rotule os tubos como: nenhum controle de cor, controle mKO2, controle TagBFP, controle NeonGreen, controle de todas as cores, mistura de politransfecção 1 e mistura de politransfecção 2.<ol><li>Adicione 36 μL de meio de soro reduzido ao controle sem cor, controle mKO2, controle TagBFP, controle NeonGreen e todos os tubos de controle de cor. Adicionar 18 μL de soro reduzido a cada um dos tubos da mistura de politransfecção 1 e da mistura de politransfecção 2. NOTA: As concentrações plasmidiais são assumidas como sendo 150 ng/μL.</li>
		<li>Adicione 600 ng de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle sem cor. Adicione 300 ng de mKO2 e 300 ng de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle de cor mKO2. Adicione 300 ng de TagBFP e 300 ng de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle de cor TagBFP.</li>
		<li>Adicionar 300 ng de plasmídeo constitutivo NeonGreen e 300 ng de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle de cor NeonGreen. Adicione 100 ng cada de mKO2, TagBFP e NeonGreen constitutivo, bem como 300 ng de plasmídeo de enchimento, ao tubo de controle de todas as cores.</li>
		<li>Adicionar 150 ng de mKO2 ao tubo de mistura de politransfecção 1. Adicione 75 ng de plasmídeo NeonGreen e 75 ng de plasmídeo de enchimento ao tubo de mistura de politransfecção 1.</li>
		<li>Adicione 150 ng de TagBFP ao tubo de mistura de politransfecção 2. Adicionar 75 ng de plasmídeo L7ae e 75 ng de plasmídeo de enchimento ao tubo de mistura de politransfecção 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Crie a mistura mestre de transfecção em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL combinando 216 μL de meio de soro reduzido com 9,48 μL de reagente de transfecção (consulte a Tabela 1 para proporções de reagentes e escala de reação). Misture bem, pipetando para cima e para baixo, e reserve.</li>
	<li>Adicione 1,58 μL de reagente intensificador a cada um dos tubos sem controle de cor, controle de cor única e todos os tubos de controle de cor. Adicionar 79 μL de reagente potenciador a cada um dos tubos de mistura de politransfecção. Misture cada tubo individualmente pipetando vigorosamente.</li>
	<li>Adicione a mistura mestra de transfecção a cada tubo contendo DNA.<ol><li>Adicione 37,58 μL de mistura mestre de transfecção a cada um dos tubos sem controle de cor, controle de cor única e todos os tubos de controle de cor. Misture cada tubo individualmente pipetando vigorosamente.</li>
		<li>Adicionar 18,79 μL de mistura mestre de transfecção a cada um dos tubos de mistura de politransfecção. Misture cada tubo individualmente pipetando vigorosamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Dispense as misturas de transfecção nos poços.<ol><li>Pipetar 65,97 μL de cada mistura de transfecção para os controles sem cor, cor única e todas as cores para os poços correspondentes.</li>
		<li>Pipetar 32,98 μL da mistura de politransfecção 1 no poço de politransfecção e girar a placa rapidamente, mas suavemente, em um padrão apertado de figura oito ao longo de uma superfície plana para distribuir os complexos de forma eficaz. Em seguida, pipetar 32,98 μL da mistura de politransfecção 2 no mesmo poço de politransfecção e girar a placa da mesma maneira.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocar a placa em incubadora a 37 °C, com 5% de CO2 e sem agitação, por um período de 48 h. NOTA: Para aumentar a viabilidade celular, o meio celular pode ser substituído a cada 6 h após a transfecção (embora isso nem sempre seja necessário, e com células HEK293 e seus derivados, deve-se ter cuidado para não separar as células da placa ao trocar o meio).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagente</td>
			<td colspan="3">Quantidade</td>
			<td colspan="3">Escala</td>
		</tr><tr><td>Meio de soro reduzido para mistura de DNA</td>
			<td colspan="3">36 μL por tubo de controle, 18 μL por tubo de politransfecção</td>
			<td colspan="3">0,05 μL Meio sérico reduzido/ng DNA por tubo, com 10-20% de volume extra para explicar a pipetagem</td>
		</tr><tr><td>ADN</td>
			<td colspan="3">300-600 ng por tubo</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>P3000</td>
			<td colspan="3">1,58 μL por tubo de controle, 0,79 μL por tubo de politransfecção</td>
			<td colspan="3">0,0022 μL P3000/ng DNA por tubo, com 10-20% extra</td>
		</tr><tr><td>Meio de soro reduzido para Lipo master mix</td>
			<td colspan="3">36 μL por tubo de controle, 18 μL por tubo de politransfecção</td>
			<td colspan="3">0,05 μL de DNA total do meio sérico/ng, com 10-20% de volume extra para explicar a pipetagem</td>
		</tr><tr><td>Transfecção e reagente potencializador</td>
			<td colspan="3">1,58 μL por tubo de controle, 0,79 μL por tubo de politransfecção</td>
			<td colspan="3">0,0022 μL de Lipofectamina 3000/ng DNA, com 10-20% extra</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Escalonamento de reagentes para transfecções. A tabela indica a proporção correta de reagente a ser incluída para a quantidade de DNA incluída em um único poço. Isso pode ser usado para escalar reações de forma eficaz e formar misturas mestras. As quantidades de reagente foram dimensionadas para incluir um excesso de 20%.
3. Preparação das células para citometria de fluxo
<ol><li>Pré-aquecer pelo menos 4,2 ml da solução de DMEM a 37 °C. Pré-aquecer pelo menos 4,2 mL de tripsina e 4,2 mL de PBS a 37 °C. Mantenha a solução tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) a 4 °C até estar pronta para uso.</li>
	<li>Ressuspender as células na solução tampão FACS (PBS suplementado com BSA a 1%, ácido etilenodiaminotetracético a 5 mM [EDTA] e azida sódica a 0,1% [NaN3], para reduzir a aglomeração; ver Tabela de Materiais), conforme descrito abaixo.<ol><li>Aspirar e descartar os meios atuais em cada poço. Dispense 5 mL de PBS em cada poço para lavar as células. Aspirar e eliminar o PBS.</li>
		<li>Dispense 5 mL de tripsina em cada poço. Coloque o prato numa incubadora a 37 °C durante 3 minutos ou até que as células deixem de aderir ao prato. Devolver a placa ao gabinete de biossegurança e diluir as soluções celulares dispensando 5 ml de solução de DMEM em cada poço.</li>
		<li>Para cada poço, misture a solução pipetando suavemente para cima e para baixo várias vezes. Para cada poço, aspirar todo o meio e colocá-lo em um tubo cônico de 15 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugar as células a 300 x g por 3 min para pastilha-las. Aspirar o meio, tomando cuidado para não aspirar as células e descartá-lo. Em cada tubo, ressuspenda as células em 5 mL de solução tampão FACS, misturando suavemente pipetando para cima e para baixo.</li>
	<li>Passe cada solução de suspensão celular através de um filtro (para remover aglomerados) em tubos cônicos separados de citometria de fluxo. Mantenha esses tubos no gelo por no máximo 1 h e realize citometria de fluxo o mais rápido possível.</li>
</ol>4. Realização de citometria de fluxo
NOTA: Operar um citômetro de fluxo requer treinamento adequado e conhecimento das tarefas necessárias. Como o software e o equipamento podem variar e os usuários devem ser treinados em geral, esta seção refere-se a operações específicas que são úteis para executar.
<ol><li>Primeiro, examine as células transfectadas com o controle do plasmídeo de carga (sem controle de cor) para selecionar as características celulares e evitar anomalias (incluindo agregados, detritos, etc.). Embora existam muitas combinações de parâmetros para distinguir células, use as três opções gerais a seguir como uma boa maneira de visualizar características distintivas.<ol><li>Observe a área de dispersão lateral (log ou escala linear por preferência/tipo de célula) versus a área de dispersão direta (escala linear).</li>
		<li>Observe a altura da dispersão lateral (escala logarítmica) versus a largura da dispersão lateral (escala linear).</li>
		<li>Observe a largura de dispersão para frente (escala linear) versus a altura de dispersão para frente (escala linear).</li>
	</ol></li>
	<li>Em seguida, observe os controles de cor única. Use o controle de todas as cores para sintonizar as tensões do instrumento, de modo que os sinais de cada proteína fluorescente sejam normalizados para unidades arbitrárias equivalentes (u.a.) de fluorescência. Em seguida, execute os controles de cor única para cada proteína fluorescente, que são usados para definir a matriz de compensação, permitindo a correção de sangria. NOTA: Idealmente, o intervalo dinâmico completo dos valores de fluorescência deve estar visível. A normalização adicional dos sinais de proteínas fluorescentes pode ser feita através da conversão para unidades padronizadas ( por exemplo, moléculas de fluoresceína equivalente [MEFLs; ver Beal et al.15]). Para habilitar a conversão de MEFL durante a análise, execute contas de calibração do arco-íris. Essa calibração também é útil para reduzir a variação instrumental e do sinal do dia-a-dia16.</li>
	<li>Execute o tubo de amostra de politransfecção. NOTA: Sempre que possível, recomenda-se executar células de 1.000 x 10^ (^ = misturas), pois as politransfecções de dimensões mais altas precisam ser subdivididas em mais compartimentos durante a análise, e cada compartimento precisa de células suficientes (idealmente >10) para fazer comparações estatisticamente significativas.</li>
</ol>5. Realização de análise pós-experimento
<ol><li>Inicialmente, use os dados dos controles (e, se aplicável, das contas) para garantir resultados precisos. Use uma das ferramentas de software disponíveis para realizar o fechamento de células vivas (usando portões descritos acima), compensação e correção de autofluorescência. NOTA: Normalmente, usamos código MATLAB personalizado (por exemplo, https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis ou Cytoflow17), que tem uma interface gráfica do usuário e uma biblioteca python adequada para a fase de pré-processamento e para análise de politransfecção.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Método</td>
			<td>Complexo</td>
			<td>ng Marcador fluorescente</td>
			<td>ng L7ae (fração)</td>
			<td>ng Repórter (fração)</td>
			<td>ng Filler DNA (fração)</td>
			<td>Total (ng)</td>
		</tr><tr><td>Politransfecção 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>600</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>1</td>
			<td>150</td>
			<td>75 (½)</td>
			<td></td>
			<td>75 (½)</td>
			<td>300</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>2</td>
			<td>150</td>
			<td></td>
			<td>75 (½)</td>
			<td>75 (½)</td>
			<td>300</td>
		</tr><tr><td>Politransfecção 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>600</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>1</td>
			<td>150</td>
			<td>25 (1/6)</td>
			<td></td>
			<td>125 (5/6)</td>
			<td>300</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>2</td>
			<td>150</td>
			<td></td>
			<td>125 (5/6)</td>
			<td>25(1/6)</td>
			<td>300</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Quantidades de DNA para politransfecção demonstradas no protocolo e um exemplo de experimento de acompanhamento com proporções de plasmídios sintonizados. A metade superior da tabela mostra a composição dos plasmídeos usados em um experimento simples de politransfecção. A metade inferior mostra a composição de um experimento atualizado que ajusta as razões de plasmídios para melhor subamostrar um espaço de concentração hipotético, onde o modulador de expressão gênica está em uma proporção mais ótima de 1:5 em relação ao seu repórter, produzindo mais células transfectadas para amostragem em torno dessa razão.

<ol><li>Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+gene+circuits+and+cellular+decision-making+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells.</a> Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).</li>
<li>Sayeg, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationally+designed+microRNA-based+genetic+classifiers+target+specific+neurons+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain.</a> ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).</li>
<li>Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Input+RNAi-based+logic+circuit+for+identification+of+specific+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells.</a> Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).</li>
<li>Nissim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+RNA-based+immunomodulatory+gene+circuits+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy.</a> Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).</li>
<li>Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+dual-promoter+integrator+for+targeting+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells.</a> Molecular Systems Biology. 6, 444(2010).</li>
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<li>Prochazka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete-to-analog+signal+pluripotent+stem+cells+conversion+in+human%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human.</a> BioRxiv. , (2021).</li>
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<li>Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-21+as+a+key+regulator+of+oncogenic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">miR-21 as a key regulator of oncogenic processes.</a> Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).</li>
<li>Stanton, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+mining+of+prokaryotic+repressors+for+orthogonal+logic+gates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).</li>
<li>Stanton, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+transfer+of+prokaryotic+sensors+and+circuits+to+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).</li>
</ol>

R.W. é co-fundador da Strand Therapeutics e da Replay Bio; R.W. e R.J. registraram uma patente provisória relacionada a um classificador de tipo celular.

Métodos de prototipagem rápida, como CAD (computer-aided design), protoboard e impressão 3D, revolucionaram as disciplinas de engenharia mecânica, elétrica e civil. A capacidade de pesquisar rapidamente muitas soluções possíveis para um determinado desafio acelera muito o progresso em um campo. Acreditamos que a politransfecção é uma tecnologia análoga para a engenharia biológica, permitindo a prototipagem rápida de circuitos genéticos. Além disso, outras tecnologias de prototipagem rápida requerem iteração sequencial pr...

O campo da biologia sintética de mamíferos progrediu rapidamente, desde o desenvolvimento de partes simples de sentido e resposta em linhagens celulares cultivadas até a otimização de redes complexas de genes para enfrentar desafios do mundo real em diagnóstico e terapêutica1. Esses circuitos sofisticados são capazes de detectar entradas biológicas de perfis de microRNA a citocinas e pequenas moléculas de fármacos, e implementar circuitos de processamento lógico, incluindo transistores, filtros passa-banda, chaves de alternância e osciladores. Também têm mostrado resultados promissores em modelos animais de doenças como câncer, artrite, diabetes e muitas outras 1,2,3,4,5. No entanto, à medida que a complexidade de um circuito cresce, otimizar os níveis de cada um de seus componentes torna-se cada vez mais desafiador.
Um tipo particularmente útil de circuito genético é um classificador celular, que pode ser programado para detectar e responder a estados celulares. A produção seletiva de proteínas ou RNA em estados celulares específicos é uma ferramenta poderosa para orientar e programar a diferenciação de células e organoides, identificar e destruir células doentes e/ou tipos celulares indesejáveis e regular a função de células terapêuticas 1,2,3,4,5 . No entanto, a criação de circuitos em células de mamíferos que possam classificar com precisão os estados celulares de várias espécies de RNA e/ou proteínas celulares tem sido altamente desafiadora.
Uma das etapas mais demoradas do desenvolvimento de um circuito de classificação celular é otimizar os níveis de expressão relativa de genes de componentes individuais, como sensores e fatores de processamento, dentro do circuito. Para acelerar a otimização de circuitos e permitir a construção de circuitos mais sofisticados, trabalhos recentes têm utilizado a modelagem matemática de circuitos classificadores de células e seus componentes para prever composições e topologias ótimas 6,7. Embora isso tenha mostrado resultados poderosos até agora, a análise matemática é limitada pela necessidade de caracterizar sistematicamente o comportamento de entrada-saída de genes componentes no circuito, o que é demorado. Além disso, uma miríade de problemas dependentes do contexto pode surgir em circuitos genéticos complexos, fazendo com que o comportamento de um circuito completo desafie as previsões baseadas em caracterizações de partes individuais 8,9.
Para desenvolver e testar mais rapidamente circuitos complexos de mamíferos, como classificadores de estado celular, nosso laboratório desenvolveu uma técnica chamada politransfecção10, uma evolução dos protocolos de cotransfecção de plasmídeos. Na co-transfecção, múltiplas espécies de DNA plasmidial são complexadas juntamente com um reagente lipídico ou polimérico carregado positivamente e, em seguida, entregues às células de forma correlacionada (Figura 1A). Na politransfecção, os plasmídeos são complexados separadamente com o reagente, de modo que o DNA de cada complexo de transfecção é entregue às células de forma descorrelacionada (Figura 1B). Usando este método, as células dentro da população transfectada são expostas a numerosas combinações de razões de duas ou mais cargas úteis de DNA carregando diferentes componentes do circuito.
Para medir as proporções dos componentes do circuito entregues a cada célula, cada complexo de transfecção dentro de uma politransfecção contém um repórter fluorescente constitutivamente expresso que serve como um proxy para a captação celular do complexo. O DNA de preenchimento que não contém nenhum elemento ativo dentro de uma célula de mamífero é usado para ajustar a quantidade relativa do repórter fluorescente e dos componentes do circuito entregues a uma célula em um único complexo de transfecção e é discutido com mais detalhes na discussão. Um exemplo de DNA de preenchimento usado no laboratório de Weiss é um plasmídeo contendo uma sequência de terminador, mas sem promotor, sequência codificadora, etc. Células com diferentes proporções de componentes do circuito podem então ser comparadas para encontrar razões ideais para a função do circuito gênico. Isso, por sua vez, produz previsões úteis para a escolha de promotores e outros elementos do circuito para alcançar níveis ideais de expressão gênica ao combinar componentes do circuito em um único vetor para integração genética (por exemplo, um lentivírus, transposon ou plataforma de pouso). Assim, em vez de escolher razões entre componentes do circuito com base na intuição ou através de um processo demorado de tentativa e erro, a politransfecção avalia uma ampla gama de estequiometrias entre partes genéticas em uma reação de pote único.
Em nosso laboratório, a politransfecção permitiu a otimização de muitos circuitos genéticos, incluindo classificadores celulares, controladores de feedback e feedforward e motivos biestáveis. Este método simples, mas poderoso, acelera significativamente os ciclos de projeto de circuitos genéticos complexos em células de mamíferos. Desde então, a politransfecção tem sido usada para caracterizar vários circuitos genéticos para revelar suas funções multidimensionais de transferência de entrada-saída em alta resolução10, otimizar uma topologia de circuito alternativo para classificação de estado celular 11 e acelerar vários projetos publicados12,13 e em andamento.
Aqui descrevemos e descrevemos o fluxo de trabalho para o uso da politransfecção para otimizar rapidamente um circuito genético (Figura 2). O protocolo mostra como gerar dados de politransfecção de alta qualidade e evitar vários erros comuns no protocolo de politransfecção e na análise dos dados (Figura 3). Em seguida, demonstra como usar a politransfecção para caracterizar componentes de circuitos simples e, no processo, comparar os resultados da politransfecção com a cotransfecção (Figura 4). Finalmente, os resultados da politransfecção mostram otimização do circuito classificador de câncer (Figura 5).

<table><tbody><tr><td>Tubos cônicos Corning Falcon de 15mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de 24 poços</td><td>Qualquer empresa de escolha</td><td></td> <td>(Não pirogênica, estéril, RNase, DNase, DNA e livre de pirogênio)</td></tr> <tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Qualquer empresa de escolha</td><td></td><td>Capaz de expor tubos Falcon de 15mL a 300 rcf</td></tr><tr><td>Contador de Células Automatizado Countess 3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Câmara de Contagem de Células Countess</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Cytoflow</td><td>Pacote de software</td><td></td> não comercial <td>https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>10-013-CV</td><td>Use a mídia correta para o seu tipo de célula</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Células HEK</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>Use o tipo de célula relevante para seus experimentos. As células HEK tendem a transfectar com muita eficiência.</td></tr><tr><td>Células HeLa</td><td>ATCC</td><td>CRL-12401</td><td>Use o tipo de célula relevante para seus experimentos.</td></tr><tr><td>Potenciador de lipofectamina 3000 e P3000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000001</td><td>Use o reagente correto para o seu tipo de célula; reagente de transfecção e intensificador</td></tr><tr><td>LSRFortessa citômetro de fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais Gibco</td><td></td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga, 1,5 mL</td><td>Qualquer empresa de sua escolha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>meio de soro reduzido</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Contas de calibração Rainbow</td><td>Spherotech</td><td>URCP-100-2H</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>VWR</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

rápido desenvolvimento de circuitos de identificação do estado celular com poli-transfecção

Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection

Circuitos genéticos de mamíferos têm demonstrado o potencial para detectar e tratar uma ampla gama de estados de doenças, mas a otimização dos níveis de componentes do circuito permanece desafiadora e trabalhosa. Para acelerar esse processo, nosso laboratório desenvolveu a politransfecção, uma extensão de alto rendimento da transfecção tradicional de mamíferos. Na politransfecção, cada célula da população transfectada realiza essencialmente um experimento diferente, testando o comportamento do circuito em diferentes números de cópias de DNA e permitindo que os usuários analisem um grande número de estequiometrias em uma reação de pote único. Até o momento, foram demonstradas politransfecções que otimizam as proporções de circuitos de três componentes em um único poço de células; Em princípio, o mesmo método pode ser usado para o desenvolvimento de circuitos ainda maiores. Os resultados da politransfecção podem ser facilmente aplicados para encontrar proporções ótimas de DNA para co-transfect para circuitos transientes ou para escolher níveis de expressão para componentes de circuitos para a geração de linhagens celulares estáveis.
Aqui, demonstramos o uso da politransfecção para otimizar um circuito de três componentes. O protocolo começa com princípios de planejamento experimental e explica como a politransfecção se baseia em métodos tradicionais de cotransfecção. Em seguida, a politransfecção das células é realizada e seguida por citometria de fluxo alguns dias depois. Finalmente, os dados são analisados examinando fatias dos dados de citometria de fluxo de célula única que correspondem a subconjuntos de células com determinadas razões de componentes. No laboratório, a politransfecção tem sido usada para otimizar classificadores de células, controladores de feedback e feedforward, motivos biestáveis e muito mais. Este método simples, mas poderoso, acelera os ciclos de projeto de circuitos genéticos complexos em células de mamíferos.

Na Figura 1, comparamos a co-transfecção com a politransfecção. Em uma co-transfecção, todos os plasmídeos são liberados na mesma mistura de transfecção, resultando em alta correlação entre a quantidade de cada plasmídeo que uma única célula recebe (Figura 1A). Enquanto o número de plasmídeos totais entregues a cada célula varia significativamente, a fluorescência das duas proteínas repórteres nas células individuais em toda a população está bem correlacionada, ...

Circuitos genéticos complexos são demorados para projetar, testar e otimizar. Para facilitar esse processo, células de mamíferos são transfectadas de forma a permitir o teste de múltiplas estequiometrias de componentes do circuito em um único poço. Este protocolo descreve as etapas para o planejamento experimental, transfecção e análise dos dados.

Rápido Desenvolvimento de Circuitos de Identificação do Estado Celular com Poli-Transfecção

Mammalian genetic circuits have demonstrated the potential to sense and treat a wide range of disease states, but optimization of the levels of circuit ...

Nosso protocolo facilita e agiliza o entendimento das relações entre as partes biológicas. Podemos testar o comportamento de muitas combinações métricas de razão de peças em um único poço. Esta técnica permite aos pesquisadores caracterizar as complexas relações entre os componentes do circuito de forma mais abrangente com maior eficiência experimental do que as abordagens convencionais.Este método é aplicável para biologia sintética e para quaisquer questões biológicas, investigando mudanças comportamentais em uma célula em resposta a diferentes níveis de genes transfectados onde o débito pode ser medido via citometria de fluxo. Comece a preparar tubos para cada agregado de DNA reservando tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro rotulados como sem controle de cor, controle mKO2, controle TagBFP, controle verde neon, controle de todas as cores, mistura de politransfecção um e mistura de politransfecção dois. Adicione 36 microlitros de meio de soro reduzido ao controle sem cor, controle mKO2, controle TagBFP, controle verde neon e todos os tubos de controle de cor, em seguida, adicione 18 microlitros de meio de soro reduzido a cada mistura de politransfecção um e mistura de politransfecção dois tubos.Em seguida, adicione 600 nanogramas de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle sem cor, 300 nanogramas de mKO2 e 300 nanogramas de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle de cor mKO2 e adicione 300 nanogramas de TagBFP e 300 nanogramas de plasmídeo de preenchimento ao tubo de controle de cor TagBFP. Ao tubo de controle de cor verde neon, adicione 300 nanogramas de verde neon constitutivo e 300 nanogramas de plasmídeo de carga, em seguida, adicione 100 nanogramas de cada mKO2, TagBFP, verde neon constitutivo e 300 nanogramas de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle de todas as cores. Para a mistura de politransfecção um tubo, adicione 150 nanogramas de mKO2, 75 nanogramas de plasmídeo verde neon repórter e 75 nanogramas de plasmídeo de preenchimento.Para a mistura de politransfecção dois tubos, adicione 150 nanogramas de TagBFP, 75 nanogramas de plasmídeo L7Ae e 75 nanogramas de plasmídeo de enchimento. Uma vez feito, crie a mistura mestre de transfecção em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro combinando 216 microlitros de meio de soro reduzido com 9,48 microlitros de reagente de transfecção. Misture bem pipetando para cima e para baixo antes de colocá-lo de lado.Adicione 1,58 microlitros de reagente intensificador sem controle de cor, controle de cor única e todos os tubos de controle de cor e adicione 79 microlitros de reagente intensificador a cada tubo de mistura de politransfecção. Misture cada tubo individualmente pipetando vigorosamente. Adicione 37,58 microlitros de mistura mestre de transfecção ao controle sem cor, controle de cor única e todos os tubos de controle de cor e misture pipetando vigorosamente.Em seguida, adicione 18,79 microlitros de mistura mestre de transfecção a cada tubo de mistura de politransfecção e misture bem cada tubo com pipetagem vigorosa. Distribua as misturas de transfecção nos poços pipetando 65,97 microlitros de cada mistura de transfecção para os controles sem cor, cor única e todas as cores para os poços correspondentes, em seguida, transfira 32,98 microlitros da mistura de politransfecção um para o poço de politransfecção e distribua os complexos de forma eficaz, girando a placa rapidamente, mas suavemente em um apertado, Figurar padrão ao longo de uma superfície plana, em seguida, pipetar 32,98 microlitros da poli-transfecção misturar dois no mesmo poço de poli-transfecção e girar a placa da mesma maneira. Incubar as células por dois dias.Realizar citometria de fluxo para ler a fluorescência dos marcadores de transfecção e o repórter de saída para cada célula. Uma co-transfecção bem realizada, distinta da poli-transfecção mostrada no vídeo, mostra uma estreita correlação entre TagBFP e EYFP, expressando plasmídeos que foram co-entregues. Em contraste, uma co-transfecção mal realizada mostra uma fraca correlação entre os dois plasmídeos.A politransfecção bem realizada mostrou boa cobertura do espaço bidimensional e boa compensação de qualquer sangramento espectral entre proteínas fluorescentes. Os dados de politransfecção com um baixo número de células vivas foram difíceis de subdividir em compartimentos suficientes com um número suficiente de células em cada silo para análise. Uma politransfecção com baixa eficiência de transfecção resultou em cobertura esparsa do espaço bidimensional para análise.A razão efetiva do DNA na expressão de saída foi testada colocando-se uma proteína repressora, L7Ae com mKO2, e uma proteína de saída, verde neon com TagBFP, em misturas de transfecção separadas. A expressão do verde de néon foi então monitorada em diferentes níveis de mKO2 e TagBFP. Os resultados de co-transfecção e politransfecção foram comparados para este circuito.Os resultados de 11 co-transfecções individuais que combinaram as partes de DNA mostradas anteriormente foram agrupados em um único conjunto de dados e comparados com os dados de politransfecção. A comparação das curvas dose-resposta de L7Ae reprimindo o repórter de saída mostrou que o nível mediano de saída por silo foi muito semelhante entre os dados de co-transfecção e politransfecção. Uma aplicação bem sucedida de poli-transfecção foi demonstrada para otimizar um classificador de tipo celular.O micro RNA-21 presente nas células HeLa e não-HEK atua para derrubar a expressão de BM3R1 porque BM3R1 reprime a produção do circuito de saída mKO2. Quando o micro RNA 21 está presente em uma célula, a expressão de mKO2 será ativada. A quantidade de Gal4-VP16 sintoniza a expressão de mKO2 em baixos níveis de BM3R1.Cada componente do circuito foi co-entregue com um marcador fluorescente diferente. Essa politransfecção quantifica quanto de cada componente do circuito cada célula recebeu. O mKO2 é produzido em MIR21, produzindo células HeLa, mas não em células HEK.A saída de mKO2 foi analisada após a entrega desses componentes de circuito em misturas de transfecção separadas com repórteres fluorescentes distintos para indicar a quantidade de cada componente do circuito recebido por uma determinada célula. Essa subamostragem previu que, nessa proporção, o circuito co-transfectado apresentou especificidade de 91%, sensibilidade de 62% e acurácia de 77%, ao classificar células HEK293 versus células HeLa. O ponto de dor mais comum neste protocolo é a falta de uma correlação estreita dentro de cada mistura de transfecção.Portanto, lembre-se de misturar vigorosamente os tubos de transfecção logo após a adição do reagente intensificador e, em seguida, ser suave com a mistura e pipetagem dos tubos de transfecção depois que a mistura de transfecção contendo lipídios for adicionada Os componentes genéticos neste procedimento podem ser substituídos por quaisquer outros componentes genéticos para responder a perguntas sobre seu desempenho funcional em vários ambientes. Este método desenvolveu rapidamente circuitos genéticos, tais como classificadores de células, controladores de feedback e feedforward, motivos bi-estáveis e muito mais.

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Bioengineering

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