Name: Síntese de Hidrogéis de Matriz Extracelular de Cartilagem Descelularizada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprenda a sintetizar hidrogéis de matriz extracelular de cartilagem descelularizada usando tratamento térmico e digestão enzimática. Este método preserva a estrutura do tecido e reduz a imunogenicidade para aplicações em engenharia de tecidos.

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Este trabalho foi patrocinado pelo Plano de Medicina e Tecnologia de Saúde da Província de Zhejiang (2019KY050), pelo Plano de Ciência e Tecnologia da Medicina Tradicional Chinesa da Província de Zhejiang (2019ZA026), pelo Plano Chave de Pesquisa e Desenvolvimento na Província de Zhejiang (Grant No.2020C03043), pelo Plano de Ciência e Tecnologia da Medicina Tradicional Chinesa da Província de Zhejiang (2021ZQ021) e pela Fundação Provincial de Ciências Naturais de Zhejiang da China (LQ22H060007).

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital de Tongde da Província de Zhejiang.
1. Preparação do hidrogel DC-ECM
OBS: Neste estudo, a cartilagem foi obtida das articulações do joelho de porcos miniatura Bama com 12 meses de idade, evitando a coleta de tecido ósseo.
<ol><li>Pegue a cartilagem coletada, bloqueie e pique em pedaços de 1-2 mm3 com um bisturi.</li>
	<li>Colocar 20 g da cartilagem picada em um tubo centrífugo de 50 mL e adicionar 20 mL de tampão hipotônico Tris-HCl (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0) para submergir completamente o tecido. Coloque o tubo de centrifugação num congelador de -80 °C durante 3 h e, em seguida, num forno a 37 °C durante 3 h. Repita a etapa de congelamento e aquecimento seis vezes. Nesta etapa, o tampão hipotônico Tris-HCl não necessita de substituição.</li>
	<li>Agite o tubo centrífugo por 30 s usando um misturador de vórtice a uma velocidade de 1.000 rpm. Coloque uma peneira de aço inoxidável (tamanho dos poros: ~250 μm) em um novo tubo centrífugo de 50 mL.</li>
	<li>Decantar lentamente a cartilagem decelularizada na peneira de aço inoxidável, lavar o tecido três vezes com PBS estéril e coletar a cartilagem.</li>
	<li>Adicionar 10 mL de solução de tripsina (tripsina a 0,25% em PBS) e colocar o tubo em um agitador a 37 °C por 24 horas. Durante este período, substitua a tripsina a cada 4 h. Filtre a suspensão usando a peneira de aço inoxidável e preserve o tecido. A tripsina pode ser tratada durante a noite durante um dos processos de digestão, e isso não afetará a digestão final.</li>
	<li>Lavar o tecido tripsinizado com tampão hipertônico (NaCl 1,5 M, Tris-HCl 50 mM, pH 7,6).</li>
	<li>Adicionar 10 ml de solução de nuclease (50 U/ml desoxirribonuclease e 1 U/ml ribonuclease em Tris-HCl 10 mM, pH 7,5) e colocar o tubo num agitador a 37 °C durante 4 horas.</li>
	<li>Remova a solução de nuclease, lave a cartilagem três vezes com PBS estéril e adicione solução hipotônica de Tris-HCl. Coloque o tubo de centrífuga em um agitador e enxágue por 20 h à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Remover a solução hipotônica de Tris-HCl, lavar a cartilagem três vezes com PBS estéril e adicionar solução de Triton X-100 a 1% para submergir o tecido por 24 h.</li>
	<li>Retirar a solução de Triton X-100 e enxaguar completamente a cartilagem decelularizada com água destilada por 3 dias, trocando a água destilada a cada 12 h.</li>
	<li>Mergulhe a cartilagem em solução de ácido peracético (PAA 0,1% em etanol 4%) por 4 h. Retire a solução de ácido peracético e lave a cartilagem três vezes com água destilada estéril.</li>
	<li>Coloque a peneira de aço inoxidável (tamanho dos poros: ~250 μm) em um tubo de centrífuga de 50 mL. Decantar lentamente a cartilagem decelularizada na peneira de aço inoxidável e coletar a cartilagem. Testar o grau de decelularização e a retenção da matriz da cartilagem estimando o conteúdo de DNA, colágeno e glicosaminoglicanos (GAG).</li>
	<li>Coloque a cartilagem decelularizada em uma tigela de moagem, adicione nitrogênio líquido e triture a cartilagem decelularizada para formar um pó. Tomar 2 g do pó de cartilagem decelularizada, adicionar 80 mL de ácido acético 0,5 M e 20 mg de pepsina e digerir por 24 h. Centrifugar a 400 x g por 10 min; descartar o sedimento e coletar a solução sobrenadante (solução DC-ECM).</li>
	<li>Decantar 1 mL de solução de DC-ECM por poço em placas de 6 poços. Coloque as placas de 6 poços em um liofilizador. Congele a solução DC-ECM. Quando a temperatura no liofilizador cair para -40 °C, ligue a bomba de vácuo e mantenha o grau de vácuo em 10 Pa por 22 horas.</li>
	<li>Retire a solução liofilizada DC-ECM, coloque-a em tubos de centrífuga e armazene a -20 °C. O período mínimo de armazenamento da solução DC-ECM liofilizada excede meio ano.</li>
	<li>Adicionar 1 ml de água destilada estéril para dissolver 20 mg de solução liofilizada de DC-ECM no tubo de centrifugação. Agitar por 1 min usando um misturador de vórtices a uma velocidade de 1.000 rpm em TR. Adicionar 1 mg de vitamina B2 (0,1% p/v) à solução DC-ECM, incubar a 37 °C por 60 min e irradiar com luz UV (370 nm, 3,5 mW/cm2) por 3 min para formar um hidrogel (hidrogel DC-ECM).</li>
</ol>2. Detecção de cartilagem decelularizada
<ol><li>Detecção do conteúdo de DNA da cartilagem decelularizada NOTA: Extraia o DNA usando o DNEasy Blood & Tissue Kit.<ol><li>Primeiro, tome 20 mg de cartilagem DC-ECM em um tubo de centrífuga. Adicionar 180 μL de Buffer GTL e 20 μL de Proteinase K por oscilação de vórtice e incubar a cartilagem a 56 °C durante 4 h até à sua completa dissolução.</li>
		<li>Agite o tubo da centrífuga por 15 s usando um misturador de vórtice a uma velocidade de 1.000 rpm no RT. Em seguida, adicione 200 μL de Buffer GL e etanol anidro e misture completamente por vibração de vórtice. Centrifugar as amostras durante 1 min a uma velocidade de 6.000 x g a 4 °C.</li>
		<li>Adicionar 500 μL de tampão GW1 à coluna de adsorção e centrifugar as amostras durante 1 min a uma velocidade de 12 000 x g a 4 °C. Adicionar 500 μL de tampão GW2 à coluna de adsorção e centrifugar a 20.000 x g a 4 °C durante 1 min. Finalmente, adicionar 50 μL de água esterilizada à coluna de adsorção e centrifugar por 1 min a uma velocidade de 6.000 x g a 4 °C para coletar a solução de DNA. Determinar o conteúdo de DNA usando um espectrofotômetro.</li>
	</ol></li>
	<li>Detecção do conteúdo de colágeno na cartilagem decelularizada<ol><li>Para detectar o conteúdo de colágeno na cartilagem decelularizada, use hidroxiprolina como marcador de aminoácidos colágeno. Acidificar 5 mg de cartilagem decelularizada com 5 mL de ácido clorídrico 6 M a 100 °C por 20 min e, em seguida, neutralizá-la com 5 mL de uma solução de hidróxido de sódio 6 M.</li>
		<li>Calcular o teor de hidroxiprolina medindo a absorbância da amostra a 570 nm com um espectrofotómetro. Obter uma regressão linear concentração-absorção usando a amostra padrão de hidroxiprolina.</li>
	</ol></li>
	<li>Detecção de conteúdo de GAG na cartilagem decelularizada NOTA: O conteúdo de GAG na cartilagem DC-ECM foi detectado usando um kit de detecção quantitativa colorimétrica de GAG tecidual. Todos os reagentes abaixo estão disponíveis no kit.<ol><li>Tome 200 mg de pó de cartilagem DC-ECM e adicione 500 μL de Reagente A por oscilação de vórtice. Incubar a amostra a 4 °C durante 16 h e, em seguida, centrifugar a 14.000 x g durante 10 minutos.</li>
		<li>Tomar 50 ml de solução de amostra e adicionar 50 μL de solução rica em sal (Reagente B) e 50 μL de solução ácida (Reagente C) por oscilação de vórtices. Incubar a amostra por 10 min.</li>
		<li>Adicionar 750 μL de solução corante (Reagente D) por oscilação de vórtice e incubar a amostra por 30 min no escuro. Centrifugar a amostra a 14.000 x g por 10 min e, em seguida, descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Adicione 1 μL de solução de limpeza (Reagente E) e misture bem. Centrifugar a amostra a 14.000 x g por 10 min e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Adicionar 1 μL de solução de dissociação (Reagente F) à amostra e misturar bem. Incubar a amostra durante 30 min em condições de escuridão. Finalmente, determinar o teor de GAG usando um espectrofotômetro a 600 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise em microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão (MET) da cartilagem decelularizada<ol><li>Comparar a cartilagem decelularizada e o tecido cartilaginoso normal. Colocar a amostra numa solução de glutaraldeído a 2,5%, incubar a 4 °C durante a noite e, em seguida, lavar com PBS três vezes.</li>
		<li>Fixar a amostra em OsO4 a 1% por 1 h e, em seguida, lavar três vezes com PBS.</li>
		<li>Desidratar a amostra por imersão sequencial em etanol 50%, 70%, 90% e 100%, bem como acetona 100% por 15 min cada. Colocar a amostra numa solução mista de hexametildisilazano e etanol (1:1) durante 15 minutos, seguida de imersão em hexametildisilazano puro durante 15 minutos.</li>
		<li>Coloque a amostra em um secador HCP-2 e, em seguida, seque usando nitrogênio líquido. Em seguida, revestir o espécime totalmente seco com uma fina camada de ouro-paládio usando revestimento de pulverização e imagem usando MEV. O revestimento foi realizado a uma potência de 120 W por 5 min. O experimento foi conduzido nas seguintes condições: tensão de trabalho de 15 kV e grau de vácuo inferior a 5 x 10−5 Pa.</li>
		<li>Para a análise de MET, colocar a amostra em uma mistura de acetona anidra e resina (1:1) por 1 h, seguida de uma mistura de acetona anidra e resina (1:3) por 3 h. Em seguida, coloque a amostra em resina durante a noite.<ol><li>Colocar a amostra em cápsulas de embutir cheias médias e aquecer a 70 °C durante 9 horas.</li>
			<li>Após a incorporação, corte o espécime em fatias finas de 70 nm usando um micrótomo ultrafino e coloque em uma malha de cobre.</li>
			<li>Pipetar 20 μL de solução corante de acetato de uranila sobre a malha de cobre e manchar por 15 min na RT. Retire a solução corante lavando suavemente a malha duas vezes com água destilada.</li>
			<li>Em seguida, pipetar 20 μL de solução corante de citrato de chumbo sobre a tela de cobre e corar por 15 min em RT. Lave a malha três vezes com água destilada.</li>
			<li>Coloque a malha de cobre em uma placa de Petri limpa forrada com papel de filtro. Após a secagem ao ar, fotografar os cortes com MET. A sonda foi aplicada com força descendente de 500 nN, escaneada a uma taxa de 1 Hz, e tinha uma constante elástica (k-valor) de 40 Nm-1. O raio da ponta da sonda foi medido em 8 nm.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Vega, S. L., Kwon, M. Y., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+hydrogels+for+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Recent advances in hydrogels for cartilage tissue engineering.</a> European Cells & Materials. 33, 59-75 (2017).</li>
<li>Yang, J., Zhang, Y. S., Yue, K., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-laden+hydrogels+for+osteochondral+and+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cell-laden hydrogels for osteochondral and cartilage tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 57, 1-25 (2017).</li>
<li>Bejleri, D., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+extracellular+matrix+materials+for+cardiac+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Decellularized extracellular matrix materials for cardiac repair and regeneration.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (5), e1801217(2019).</li>
<li>Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+extracellular+matrix%3A+New+promising+and+challenging+biomaterials+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine.</a> Biomaterials. 289, 121786(2022).</li>
<li>Barbulescu, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+extracellular+matrix+scaffolds+for+cardiovascular+tissue+engineering%3A+Current+techniques+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Decellularized extracellular matrix scaffolds for cardiovascular tissue engineering: Current techniques and challenges.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (21), 13040(2022).</li>
<li>Zhang, W., Du, A., Liu, S., Lv, M., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+in+decellularized+extracellular+matrix-derived+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">Research progress in decellularized extracellular matrix-derived hydrogels.</a> Regenerative Therapy. 18, 88-96 (2021).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+decellularized+extracellular+matrix+scaffolds+for+articular+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Cell-derived decellularized extracellular matrix scaffolds for articular cartilage repair.</a> International Journal of Artificial Organs. 44 (4), 269-281 (2021).</li>
<li>Li, T., Javed, R., Ao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenogeneic+decellularized+extracellular+matrix-based+biomaterials+for+peripheral+nerve+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials for peripheral nerve repair and regeneration.</a> Current Neuropharmacology. 19 (12), 2152-2163 (2021).</li>
<li>Xia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+cartilage+as+a+prospective+scaffold+for+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+%26+Engineering+C-Materials+for+Biological+Applications%22%5BJournal%5D)">Decellularized cartilage as a prospective scaffold for cartilage repair.</a> Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 101, 588-595 (2019).</li>
<li>Chen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desktop-stereolithography+3D+printing+of+a+radially+oriented+extracellular+matrix%2Fmesenchymal+stem+cell+exosome+bioink+for+osteochondral+defect+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Desktop-stereolithography 3D printing of a radially oriented extracellular matrix/mesenchymal stem cell exosome bioink for osteochondral defect regeneration.</a> Theranostics. 9 (9), 2439-2459 (2019).</li>
<li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues%3A+Structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+delivery+in+tissue-specific+hydrogel+enabled+meniscal+repair+in+an+orthotopic+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stem cell delivery in tissue-specific hydrogel enabled meniscal repair in an orthotopic rat model.</a> Biomaterials. 132, 59-71 (2017).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensified+stiffness+and+photodynamic+provocation+in+a+collagen-based+composite+hydrogel+drive+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Intensified stiffness and photodynamic provocation in a collagen-based composite hydrogel drive chondrogenesis.</a> Advanced Science. 6 (16), 1900099(2019).</li>
<li>Young, J. L., Holle, A. W., Spatz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P.Nanoscale+and+mechanical+properties+of+the+physiological+cell-ECM+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">P.Nanoscale and mechanical properties of the physiological cell-ECM microenvironment.</a> Experimental Cell Research. 343 (1), 3-6 (2016).</li>
<li>Abdolghafoorian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+heart+valve+decellularization+on+xenograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Clinical+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Effect of heart valve decellularization on xenograft rejection.</a> Experimental and Clinical Transplantation. 15 (3), 329-336 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo fornece uma abordagem sistemática para a preparação de hidrogéis de matriz extracelular de cartilagem decelularizada que mimetizam intimamente a MEC nativa do tecido cartilaginoso. O protocolo envolve uma combinação de ruptura física, química e enzimática para remover material celular, preservando a estrutura e a composição da MEC. As etapas críticas do protocolo incluem ajustar o tempo e os métodos de decelularização e garantir a descelularização completa.
Comparado a outros mé...

A engenharia de tecidos cartilaginosos é um campo em rápido desenvolvimento que busca regenerar tecido cartilaginoso danificado ou doente1. Um dos principais desafios nesse campo é o desenvolvimento de arcabouços biomiméticos que possam suportar o crescimento e a diferenciação dos condrócitos, células responsáveis pela produção decartilagem2. A MEC do tecido cartilaginoso desempenha um papel crítico na regulação do comportamento dos condrócitos. DC-ECM é um arcabouço eficaz para aplicações de engenharia de tecidos3.
Várias técnicas foram desenvolvidas para produzir DC-ECM a partir de tecido cartilaginoso, incluindo métodos químicos, enzimáticos e físicos. No entanto, esses métodos frequentemente resultam na geração de hidrogéis de MEC insuficientemente biomiméticos, o que limita seu potencial para uso em aplicações de engenharia de tecidos 4,5. Assim, há necessidade de um método mais eficaz para a produção de hidrogéis DC-ECM.
O desenvolvimento desta técnica é importante porque pode avançar no campo da engenharia de tecidos, fornecendo uma nova abordagem para a criação de arcabouços biomiméticos que podem apoiar a regeneração e reparação tecidual. Além disso, essa técnica poderia ser facilmente adaptada para produzir hidrogéis de MEC a partir de outros tecidos, ampliando assim suas potenciais aplicações.
No corpo mais amplo da literatura, tem havido um interesse crescente no uso de DC-ECM como arcabouço para aplicações de engenharia de tecidos6. Numerosos estudos têm demonstrado a eficácia dos hidrogéis DC-ECM em promover o crescimento e diferenciação celular em vários tecidos, incluindo a cartilagem 7,8. Portanto, o desenvolvimento de um protocolo para a produção de hidrogéis DC-ECM que mimetizem intimamente a MEC natural do tecido cartilaginoso é uma contribuição significativa para o campo.
O protocolo apresentado neste trabalho aborda essa necessidade, fornecendo um novo método para a produção de hidrogéis DC-ECM que mimetizam intimamente a MEC natural do tecido cartilaginoso. O protocolo envolve a descelularização do tecido cartilaginoso, o isolamento da MEC resultante e a criação de um hidrogel por meio da reticulação da MEC com um polímero biocompatível. O hidrogel resultante tem mostrado resultados promissores no suporte ao crescimento e diferenciação de condrócitos.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl, pH7.6</td><td>Beyotime</td><td>ST776-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH8.0</td><td>Beyotime</td><td>ST780-500 mL-80</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C Freezer</td><td>Eppendorf</td><td>F440340034</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease</td><td>Aladdin</td><td>D128600-80KU</td><td></td></tr><tr><td>DNEasy Sangue & Kit de Tecidos</td><td>Qiagen</td><td>No. 69506</td><td></td></tr><tr><td>GAG kit de detecção quantitativa colorimétrica</td><td>Shanghai Haling</td><td>HL19236.2</td><td></td></tr><tr><td>Secador HCP-2&nbsp;</td><td>Hitachi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop8000</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>Espectrofotômetro</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease</td><td>Aladdin</td><td>R341325-100 mg</td><td></td></tr><tr><td>Sigma500</td><td>ZIESS</td><td>N/A</td><td>Microscópio eletrônico de varredura</td></tr><tr><td>Spectra S</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>Microscópio eletrônico de transmissão</td></tr><tr><td>Peneira de aço inoxidável</td><td>SHXB-Z-1</td><td>Shanghai Xinbu</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Beyotime</td><td>P0096-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina&nbsp;</td><td>Lâmpada</td> ultravioleta <td>Gibco 15050065</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Omnicure 2000</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vitamina B2</td><td>Gibco</td><td>R4500-5G</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>Shanghai Qiasen</td><td>78HW-1&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

síntese de hidrogéis de matriz extracelular de cartilagem descelularizada

Synthesis of Decellularized Cartilage Extracellular Matrix Hydrogels

Os hidrogéis de matriz extracelular de cartilagem decelularizada (DC-ECM) são biomateriais promissores para a engenharia de tecidos e medicina regenerativa devido à sua biocompatibilidade e capacidade de mimetizar propriedades teciduais naturais. Este protocolo visa produzir hidrogéis DC-ECM que mimetizem intimamente a MEC nativa do tecido cartilaginoso. O protocolo envolve uma combinação de ruptura física e química e digestão enzimática para remover o material celular, preservando a estrutura e a composição da MEC. O DC-ECM é reticulado usando um agente químico para formar um hidrogel estável e biologicamente ativo. O hidrogel DC-ECM tem excelente atividade biológica, estrutura espacial e função de indução biológica, além de baixa imunogenicidade. Essas características são benéficas para promover a adesão, proliferação, diferenciação e migração celular e para criar um microambiente superior para o crescimento celular. Este protocolo fornece um recurso valioso para pesquisadores e clínicos na área de engenharia de tecidos. Os hidrogéis biomiméticos podem potencialmente melhorar o desenvolvimento de estratégias eficazes de engenharia tecidual para o reparo e regeneração da cartilagem.

Para preparar um melhor hidrogel de cartilagem DC-ECM, estudamos e revisamos a literatura anterior e comparamos os vários protocolos de decelularização em termos de razão de decelularização, imunogenicidade e funcionalidade mecânica9.
Com base nisso, preparamos o hidrogel de cartilagem DC-ECM e exploramos o efeito de uma matriz extrativa radialmente orientada/biotinta de exossomo de células-tronco mesenquimais no tratamento de defeitos osteocondrais. Os resultados mostr...

Este trabalho apresenta um novo método para a síntese de hidrogéis de matriz extracelular de cartilagem decelularizada (DC-ECM). Os hidrogéis DC-ECM têm excelente biocompatibilidade e fornecem um microambiente superior para o crescimento celular. Portanto, podem ser arcabouços celulares ideais e sistemas de liberação biológica.

Síntese de Hidrogéis de Matriz Extracelular de Cartilagem Descelularizada

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their ...

Nosso protocolo é significativo, pois permite a criação de doenças em hidrogéis que se assemelham muito à natureza do tecido cartilaginoso. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de produzir doença em hidrogéis com evidente atividade biológica em estrutura espacial, baixa imunogenicidade e função industrial biológica. Para começar, pique a cartilagem coletada usando um bisturi em pedaços de um a dois milímetros cúbicos de tamanho.Em um tubo de centrífuga de 50 milímetros, submerja 20 gramas da cartilagem picada em 20 mililitros de tampão hipotônico de cloridrato de Tris. Coloque o tubo a 80 graus Celsius por três horas e, em seguida, no forno a 37 graus Celsius por três horas. Vórtice o tubo da centrífuga por 30 segundos a 1000 RPM.Em seguida, filtre a cartilagem decelularizada usando uma peneira plástica colocada em um tubo centrífugo de 50 mililitros. Lave a cartilagem três vezes com PBS estéril antes de coletá-la. Adicione 10 mililitros de solução de tripsina à cartilagem coletada e incube-a em um agitador a 37 graus Celsius por 24 horas, substituindo a tripsina a cada quatro horas.Após filtrar a suspensão, lavar a cartilagem tripsinizada com tampão hipertônico. Uma vez preservada a cartilagem, adicione 10 mililitros de solução de nuclease e coloque-a em um agitador a 37 graus Celsius por quatro horas. Após a lavagem com PBS estéril, adicione solução hipertônica de Tris-cloridrato à cartilagem e coloque-a no agitador, conforme demonstrado.Uma vez lavado com PBS estéril, submergir o tecido em solução de Triton X-100 a 1% por 24 horas. Após a retirada do Triton X-100, enxaguar a cartilagem decelularizada com água destilada por três dias, trocando a água a cada 12 horas. Após três dias, adicionar solução de ácido peracético à cartilagem e deixá-la de molho por quatro horas.Uma vez lavada com PBS, coletar a cartilagem usando uma peneira plástica como demonstrado anteriormente. Usando nitrogênio líquido, prepare pó de cartilagem decelularizada. Adicione 80 mililitros de ácido acético 0,5 molar e 20 miligramas de pepsina a dois gramas de pó de cartilagem e digerir a mistura por 24 horas a 37 graus Celsius.Após a digestão, centrifugar a suspensão a 400 G por 10 minutos e coletar o sobrenadante, que agora é chamado de solução DC-ECM Para armazenar a solução DC-ECM, adicione um mililitro da solução a cada poço de uma placa de seis poços e coloque-a em um liofilizador. Uma vez que a solução é liofilizada, transfira-a para um tubo de centrífuga. Para formar um hidrogel, dissolva 20 miligramas de solução liofilizada DC-ECM em um mililitro de água destilada estéril.Uma vez agitado, adicione um miligrama de vitamina B2 à solução de DC-ECM. Após a incubação, irradiar com luz UV por três minutos. Adicione o tampão GTL e proteinase K a 20 miligramas de pó de cartilagem DC-ECM e misture bem usando oscilação de vórtice.Para a dissolução completa da cartilagem, incubar a mistura a 56 graus Celsius por quatro horas. Uma vez vórtice, adicionar 200 microlitros de tampão GTL seguido de etanol anidro. Após vórtice, centrifugar a amostra a 6000 G durante um minuto a quatro graus Celsius.Em seguida, colete e quantifique o DNA conforme descrito no manuscrito. Para analisar o colágeno, acidifique cinco miligramas de pó DC-ECM em ácido clorídrico a 100 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, neutralize-o com cinco mililitros de solução de hidróxido de sódio seis molar.Calcular o teor de hidroxiprolina da amostra neutralizada usando absorbância a 570 nanômetros em relação ao padrão de hidroxiprolina. Adicionar 500 microlitros de reagente A a 200 miligramas de pó de DC-ECM após a mistura. Incubar a amostra a quatro graus Celsius durante 16 horas.Uma vez centrifugado, coletar 50 microlitros da solução da amostra e adicionar 50 microlitros do reagente B, seguido do reagente C.Após incubar a amostra por 10 minutos, adicionar 750 microlitros do reagente D e incubar por 30 minutos no escuro. Após a centrifugação, adicione um microlitro de reagente E ao pellet e misture bem antes de centrifugir. Em seguida, dissociar a amostra antes da medição do teor de GAG.Na cartilagem DC-ECM preparada, o conteúdo de DNA foi significativamente eliminado. No entanto, o conteúdo de colágeno e GAG foi mantido em relação à cartilagem nativa. A análise por MEV e ETM demonstrou a ultraestrutura da DC-ECM preparada.O hidrogel preparado no tubo invertido não fluiu para o fundo, demonstrando gelificação. Além disso, em comparação com a solução somente DC-ECM, a adição de vitamina B2 reduziu o tempo de gelificação devido à reticulação induzida durante a formação do hidrogel DC-ECM. A viscosidade do hidrogel DC-ECM foi maior que a viscosidade da solução e o aumento das taxas de cisalhamento diminuiu a viscosidade da solução.Além disso, o alto módulo de armazenamento da solução DC-ECM e do hidrogel indicou que ambos tinham propriedades de gel e não de líquido. A análise por MEV demonstrou que o tamanho dos poros da solução de DC-ECM diminuiu significativamente na forma de hidrogel após reticulação e liofilização. O protocolo envolve uma combinação de ruptura física e química e digestão enzimática para remover o material celular, preservando a estrutura e a conversação da MEC.

synthesis-of-decellularized-cartilage-extracellular-matrix-hydrogels

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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