Name: Produção de Soro Autólogo Condicionado Modificado e Avaliação Ex Vivo de seu Potencial de Cicatrização em Epitélio Corneano Murino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T14:15:00.000+00:00
Duration: 3 min 55 s
Description: Aprenda a preparar soro autólogo condicionado modificado para cicatrização de feridas em modelo ex vivo de epitélio corneano murino. Este método simplificado reduz custos e acelera a regeneração tecidual.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores agradecem a Ya-Lan Chien e Chia-Ying Lee pela excelente assistência técnica, e à empresa inglesa OnLine pela edição linguística. Este estudo foi financiado em parte por Chang Gung Medical Research Project (Grant No. CMRPG3L1491).

A pesquisa foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais no início da seção de protocolo. Todos os protocolos e procedimentos foram realizados de acordo com a Declaração de Helsinque e foram revisados e aprovados pelo Comitê de Revisão Institucional da Fundação Médica Chang Gung. Todos os voluntários foram informados sobre a natureza deste estudo e assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido antes de sua inclusão. Os consumíveis necessários para todo o procedimento experimental são apresentados na Figura 1 e Figura 2, bem como na Tabela de Materiais.
1. Preparação dos materiais necessários para produzir colírios mACS
<ol><li>Preparar 250 mL de solução de glicerol a 10% e manter pronto um conjunto de infusão de asas de borboleta de 21 G, uma seringa de 3 mL sem agulha e seis tubos vacutainer de 10 mL contendo heparina 158 unidades USP (Figura 1).</li>
	<li>Conecte a agulha de coleta de sangue 21 G à seringa de 3 mL e retire 3 mL de solução de glicerol a 10% na seringa preparada. NOTA: Todos os materiais devem ser esterilizados antes da inserção da agulha.</li>
	<li>Distribuir a solução de glicerol a 10% nos tubos vacutainer em sequência, com aproximadamente 0,5 mL de solução de glicerol a 10% em cada um (Figura 3A). NOTA: Devido à pressão negativa no tubo de ensaio, a agulha deve sair imediatamente após entrar para distribuir uniformemente 3 mL de solução de glicerol para os seis tubos de ensaio.</li>
	<li>Esterilizar a pele do paciente com cotonetes estéreis com álcool 75%. Puncionar a veia superficial dos membros superiores do paciente com a agulha de coleta de sangue 18G. Extrair 60-70 mL de sangue venoso da veia superficial no total.</li>
</ol>2. Preparação para colírios mACS
<ol><li>Injetar sequencialmente 10 mL do sangue venoso coletado em cada um dos seis tubos vacutainer (Figura 3B). NOTA: Esta etapa depende da pressão negativa do vácuo para encher os tubos. Para evitar a ruptura das células sanguíneas e hemólise, não aplique pressão positiva.</li>
	<li>Colocar os seis tubos vacutainer na incubadora com uma temperatura constante de 37 °C durante 4 h (Figura 3C). NOTA: O estado hipóxico é mantido e estabilizado pela pressão negativa remanescente em um tubo selado que recebeu glicerol.</li>
	<li>Retire os tubos da incubadora após 4 h e centrifugue-os a 3.500 × g por 10 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Nesse momento, prepare os materiais para extração do mACS, incluindo os frascos de colírio esterilizados, uma seringa de 3 mL com a agulha, um filtro de 0,22 μm, uma agulha de 18 G e um par de luvas estéreis (Figura 2). NOTA: A mesa cirúrgica deve ser limpa com álcool a 75% para garantir um ambiente asséptico. O sobrenadante, após centrifugação, já é um produto semiacabado do mACS.</li>
	<li>Coloque os seis tubos no rack de tubos e abra as tampas após a centrifugação completa (Figura 3D). NOTA: A esterilidade não é necessária nesta etapa.</li>
	<li>Coloque luvas estéreis e retire o mACS um a um usando uma seringa de 3 mL com uma agulha de 18 G. NOTA: Tenha cuidado para não retirar a camada inferior de células sanguíneas durante esta etapa (Figura 3E).</li>
	<li>Puxe a agulha, conecte-a ao filtro de 0,22 μm e conecte a agulha de coleta de sangue de 23 G, 1,5 com a seringa original de 3 mL à saída abaixo (Figura 3F).</li>
	<li>Empurre a agulha suavemente através do filtro de 0,22 μm para os frascos de colírio estéril preparados (Figura 3G).</li>
	<li>Repita as etapas acima até que todos os mACS tenham sido filtrados e armazenados em frascos de colírio (Figura 3H).</li>
	<li>Conservar o colírio mACS a 4 °C para utilização imediata; conservar a -20 °C para preservação a longo prazo. NOTA: Não os mantenha durante mais de 2 semanas a 4 °C ou durante mais de 3 meses a -20 °C 9,19.</li>
</ol>3. Modelo de cicatrização ex vivo do epitélio corneano murino
NOTA: O modelo animal ex vivo a seguir foi baseado na experiência prévia de Hung e col. sobre lesões mecânicas do epitélio corneano20. Os passos seguintes devem ser realizados sob o microscópio para criar uma ferida epitelial corneana bem circunscrita e consistente.
<ol><li>Anestesiar os camundongos C57BL/6 com isoflurano a 3%-4%. Recuar o punção da biópsia de pele sobre a córnea central murina, deixando um círculo raso no epitélio como uma margem uniforme da ferida. NOTA: Seja gentil para evitar a ruptura do globo ocular.</li>
	<li>Desbridar o epitélio corneano dentro da área confirmada até a camada de Bowman, com um removedor de anel de ferrugem corneana equipado com uma broca de 0,5 mm.</li>
	<li>Para estabelecer o modelo animal ex vivo da ferida corneana mecânica, colher o globo ocular e preparar bem a cultura.<ol><li>Eutanasiar os ratos primeiro; Em seguida, pressione suavemente as bordas orbitárias superior e inferior dos camundongos, introduza a ponta da pinça sobre o espaço retrobulbar, saia do globo ocular e segure-o pela pinça.</li>
		<li>Cortar o nervo óptico e o tecido mole periorbital com tesoura corneana para isolar perfeitamente o globo ocular.</li>
		<li>Prepare um prato de 96 poços com cera derretida em seu interior. Crie rapidamente um orifício redondo usando as pontas das pinças e aguarde a solidificação.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar os meios a serem testados: 0,5% mACS, 0,5% AS para comparação, soro fisiológico normal como controle negativo e meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). NOTA: mACS é obtido usando o protocolo mencionado acima.</li>
	<li>Para a cultura ex vivo , coloque o globo ocular colhido na placa preparada de 96 poços. Adicionar 200 μL de cada meio na placa de 96 poços.</li>
	<li>Coloque a placa de cultura de 96 poços na incubadora a 37 °C com 5% de CO2. Garantir que os meios de cultura sejam trocados a cada 24 h.</li>
	<li>Para confirmar o efeito sequencial da cicatrização da ferida, monitorar a área da ferida epitelial sob o microscópio a cada 8 h por coloração de fluoresceína.<ol><li>Dissolva a fluoresceína no papel fluoresceína com soro fisiológico.</li>
		<li>Solte o corante fluoresceína na córnea central murina, depois observe e documente-o sob um microscópio. Um resultado típico é mostrado na Figura 4. NOTA: Uma gota (aproximadamente 0,05 mL) de corante fluoresceína é suficiente para a observação.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Fox, R. I., Chan, R., Michelson, J. B., Belmont, J. B., Michelson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effect+of+artificial+tears+made+with+autologous+serum+in+patients+with+keratoconjunctivitis+sicca%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Beneficial effect of artificial tears made with autologous serum in patients with keratoconjunctivitis sicca.</a> Arthritis and Rheumatology. 27 (4), 459-461 (1984).</li>
<li>Noble, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+autologous+serum+eye+drops+with+conventional+therapy+in+a+randomised+controlled+crossover+trial+for+ocular+surface+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Comparison of autologous serum eye drops with conventional therapy in a randomised controlled crossover trial for ocular surface disease.</a> The British Journal of Ophthalmology. 88 (5), 647-652 (2004).</li>
<li>Bradley, J. C., Bradley, R. H., McCartney, D. L., Mannis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+growth+factor+analysis+in+dry+eye+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Serum growth factor analysis in dry eye syndrome.</a> Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (8), 717-720 (2008).</li>
<li>Alshammari, T. M., Al-Hassan, A. A., Hadda, T. B., Aljofan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+serum+sample+extraction+methods+and+their+suitability+for+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Pharmaceutical+Journal%22%5BJournal%5D)">Comparison of different serum sample extraction methods and their suitability for mass spectrometry analysis.</a> Saudi Pharmaceutical Journal. 23 (6), 689-697 (2015).</li>
<li>Tsubota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+dry+eye+by+autologous+serum+application+in+Sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Treatment of dry eye by autologous serum application in Sjögren's syndrome.</a> The British Journal of Ophthalmology. 83 (4), 390-395 (1999).</li>
<li>Urzua, C. A., Vasquez, D. H., Huidobro, A., Hernandez, H., Alfaro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+double-blind+clinical+trial+of+autologous+serum+versus+artificial+tears+in+dry+eye+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Randomized double-blind clinical trial of autologous serum versus artificial tears in dry eye syndrome.</a> Current Eye Research. 37 (8), 684-688 (2012).</li>
<li>Cui, D., Li, G., Akpek, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+serum+eye+drops+for+ocular+surface+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Autologous serum eye drops for ocular surface disorders.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 21 (5), 493-499 (2021).</li>
<li>Jirsova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+autologous+serum+eye+drops+in+severe+dry+eye+patients%3B+subjective+and+objective+parameters+before+and+after+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The application of autologous serum eye drops in severe dry eye patients; subjective and objective parameters before and after treatment.</a> Current Eye Research. 39 (1), 21-30 (2014).</li>
<li>Pan, Q., Angelina, A., Marrone, M., Stark, W. J., Akpek, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+serum+eye+drops+for+dry+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Autologous serum eye drops for dry eye.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 2 (2), (2017).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+serum+eye+drops+versus+artificial+tear+drops+for+dry+eye+disease%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+randomized+controlled+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Autologous serum eye drops versus artificial tear drops for dry eye disease: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials.</a> Ophthalmic Research. 63 (5), 443-451 (2020).</li>
<li>Soni, N. G., Jeng, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-derived+topical+therapy+for+ocular+surface+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Blood-derived topical therapy for ocular surface diseases.</a> The British Journal of Ophthalmology. 100 (1), 22-27 (2016).</li>
<li>Solomon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((anti-inflammatory+forms+of+interleukin-1+in+the+tear+fluid+and+conjunctiva+of+patients+with+dry-eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">anti-inflammatory forms of interleukin-1 in the tear fluid and conjunctiva of patients with dry-eye disease.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42 (10), 2283-2292 (2001).</li>
<li>Meijer, H., Reinecke, J., Becker, C., Tholen, G., Wehling, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+anti-inflammatory+cytokines+in+whole+blood+by+physico-chemical+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">The production of anti-inflammatory cytokines in whole blood by physico-chemical induction.</a> Inflammation Research. 52 (10), 404-407 (2003).</li>
<li>Bielory, B. P., Shah, S. P., O'Brien, T. P., Perez, V. L., Bielory, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+therapeutics+for+ocular+surface+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Emerging therapeutics for ocular surface disease.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (5), 477-486 (2016).</li>
<li>Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+eye+disease%3A+an+immune-mediated+ocular+surface+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder.</a> Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).</li>
<li>Yang, J., Guo, A., Li, Q., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-rich+plasma+attenuates+interleukin-1%CE%B2-induced+apoptosis+and+inflammation+in+chondrocytes+through+targeting+hypoxia-inducible+factor-2%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Platelet-rich plasma attenuates interleukin-1β-induced apoptosis and inflammation in chondrocytes through targeting hypoxia-inducible factor-2α.</a> Tissue and Cell. 73, 101646(2021).</li>
<li>Shakouri, S. K., Dolati, S., Santhakumar, J., Thakor, A. S., Yarani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+conditioned+serum+for+degenerative+diseases+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Growth+Factors%22%5BJournal%5D)">Autologous conditioned serum for degenerative diseases and prospects.</a> Growth Factors. 39 (1-6), 59-70 (2021).</li>
<li>Gull, M., Pasek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glycerol+and+its+derivatives+in+the+biochemistry+of+living+organisms%2C+and+their+prebiotic+origin+and+significance+in+the+evolution+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Catalysts%22%5BJournal%5D)">The role of glycerol and its derivatives in the biochemistry of living organisms, and their prebiotic origin and significance in the evolution of life.</a> Catalysts. 11 (1), 86(2021).</li>
<li>Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflections+on+dry+eye+syndrome+treatment%3A+therapeutic+role+of+blood+products%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reflections on dry eye syndrome treatment: therapeutic role of blood products.</a> Frontiers in Medicine. 5, 33(2018).</li>
<li>Hung, K. H., Yeh, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+and+in+vivo+animal+models+for+mechanical+and+chemical+injuries+of+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ex vivo and in vivo animal models for mechanical and chemical injuries of corneal epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (182), e63217(2022).</li>
<li>Geerling, G., Maclennan, S., Hartwig, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+serum+eye+drops+for+ocular+surface+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Autologous serum eye drops for ocular surface disorders.</a> The British Journal of Ophthalmology. 88 (11), 1467-1474 (2004).</li>
<li>Rutgers, M., Saris, D. B., Dhert, W. J., Creemers, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+profile+of+autologous+conditioned+serum+for+treatment+of+osteoarthritis%2C+in+vitro+effects+on+cartilage+metabolism+and+intra-articular+levels+after+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Cytokine profile of autologous conditioned serum for treatment of osteoarthritis, in vitro effects on cartilage metabolism and intra-articular levels after injection.</a> Arthritis Research & Therapy. 12 (3), R114(2010).</li>
<li>Antebi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+physiological+hypoxia+potentiates+the+therapeutic+function+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Short-term physiological hypoxia potentiates the therapeutic function of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 265(2018).</li>
<li>Chen, Y. M., Wang, W. Y., Lin, Y. C., Tsai, S. H., Lou, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+autologous+serum+eye+drops+with+contact+lenses+in+the+treatment+of+chemical+burn-induced+bilateral+corneal+persistent+epithelial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Use of autologous serum eye drops with contact lenses in the treatment of chemical burn-induced bilateral corneal persistent epithelial defects.</a> BioMed Research International. 2022, 6600788(2022).</li>
<li>Diaz-Valle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+efficacy+of+topical+insulin+with+autologous+serum+eye+drops+in+persistent+epithelial+defects+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Comparison of the efficacy of topical insulin with autologous serum eye drops in persistent epithelial defects of the cornea.</a> Acta Ophthalmologica. 100 (4), e912-e919 (2022).</li>
<li>Metheetrairut, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+epitheliotrophic+factors+in+platelet-rich+plasma+versus+autologous+serum+and+their+treatment+efficacy+in+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of epitheliotrophic factors in platelet-rich plasma versus autologous serum and their treatment efficacy in dry eye disease.</a> Scientific Reports. 12 (1), 8906(2022).</li>
<li>NaPier, E., Camacho, M., McDevitt, T. F., Sweeney, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+keratopathy%3A+current+challenges+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic keratopathy: current challenges and future prospects.</a> Annals of Medicine. 54 (1), 666-673 (2022).</li>
<li>Garcia-Conca, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+treatment+of+hyposecretory+dry+eye+with+platelet-rich+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of treatment of hyposecretory dry eye with platelet-rich plasma.</a> Acta Ophthalmologica. 97 (2), e170-e178 (2019).</li>
<li>Gholian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+autologous+conditioned+serum+dressings+in+hard-to-heal+wounds%3A+a+randomised+prospective+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Use of autologous conditioned serum dressings in hard-to-heal wounds: a randomised prospective clinical trial.</a> Journal of Wound Care. 31 (1), 68-77 (2022).</li>
<li>Raeissadat, S. A., Rayegani, S. M., Jafarian, N., Heidari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+conditioned+serum+applications+in+the+treatment+of+musculoskeletal+diseases%3A+a+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Science+OA%22%5BJournal%5D)">Autologous conditioned serum applications in the treatment of musculoskeletal diseases: a narrative review.</a> Future Science OA. 8 (2), 776(2022).</li>
<li>Tokawa, P. K. A., Brossi, P. M., Baccarin, R. Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+conditioned+serum+in+equine+and+human+orthopedic+therapy%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Autologous conditioned serum in equine and human orthopedic therapy: A systematic review.</a> Research in Veterinary Science. 146, 34-52 (2022).</li>
<li>Evans, C. H., Chevalier, X., Wehling, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+conditioned+serum.+Physical+Medicine+and+Rehabilitation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Autologous conditioned serum. Physical Medicine and Rehabilitation.</a> Clinics of North America. 27 (4), 893-908 (2016).</li>
<li>Coskun, H. S., Yurtbay, A., Say, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+rich+plasma+versus+autologous+conditioned+serum+in+osteoarthritis+of+the+knee%3A+clinical+results+of+a+five-year+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Platelet rich plasma versus autologous conditioned serum in osteoarthritis of the knee: clinical results of a five-year retrospective study.</a> Cureus. 14 (4), e24500(2022).</li>
</ol>

Todos os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Neste estudo, um protocolo para a preparação de mACS é descrito e o benefício do colírio mACS na cicatrização de feridas de modelos animais é ainda mostrado. A modificação crucial deste protocolo mACS é a adição de aproximadamente 0,5 mL de solução de glicerol a 10% em cada tubo de ensaio, o que cria condições hipóxicas adequadas durante as 4 h de incubação a 37 °C. Esta configuração fornece o AS com estresse adequado e células prontas para secretar os fatores de crescimento necessários que ajudam a cicatrização de feri...

Os efeitos terapêuticos do soro autólogo (EA) nas doenças do olho seco foram relatados pela primeira vez na década de 1980 por Fox et al.1. Acredita-se que tanto a propriedade lubrificante quanto os componentes bioquímicos epiteliotrópicos essenciais na EA, mimetizando lágrimas naturais, beneficiem a proliferação de células epiteliais corneanas. Nas últimas décadas, vários estudos têm sido realizados com base nisso. Os componentes tróficos incluem fator de crescimento epidérmico (EGF), vitamina A, fator transformador de crescimento β (TGF-β) e outras citocinas. Curiosamente, o soro é rico em TGF-β e vitamina A, que se acredita desempenharem um papel fundamental na proliferação epidérmica 2,3,4,5. Além disso, no tratamento de pacientes com doenças da superfície ocular, vários estudos têm demonstrado algumas vantagens do colírio de EA nos resultados relatados pelo paciente,outros parâmetros objetivos do olho seco6,7 e achados microscópicos, como a densidade celular8. Estudos de metanálise revelaram que pode haver alguns benefícios na melhora das síndromes dos pacientes com o tratamento com colírios EA, mas ainda faltam resultados e observações a longo prazo 9,10.
Ao contrário da EA, o plasma rico em plaquetas (PRP) é derivado da adição de um anticoagulante durante a preparação, com posterior centrifugação diferencial e ativação química das plaquetas. Em comparação com a EA, vários produtos químicos e fatores de crescimento, como TGF-β, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e EGF, estão presentes no PRP. Também tem sido aplicada em doenças da superfície ocular com benefícios clínicos no alívio dossintomas11.
A ligação cruzada entre defeitos epiteliais e inflamação é complexa. Notadamente, a imunofisiopatologia é outra questão importante nas doenças da superfície ocular. Acredita-se que citocinas pró-inflamatórias, como IL-1β e IFN-γ, sejam mediadores fundamentais em cascatas inflamatórias12. Novos caminhos de tratamento são assim abertos a partir da compreensão do mecanismo imunológico. Estratégias para interromper esse processo inflamatório, incluindo a produção de antagonista do receptor de interleucina-1 (IL-1Ra) e outras citocinas anti-inflamatórias, também podem desempenhar um papel importante nas doenças da superfície ocular13,14,15.
Desde 1998, a ortocina, soro condicionado autólogo (SCA) comercializado, tem sido utilizada clinicamente em pacientes ortopédicos portadores de osteoartrite (OA), artrite reumatoide (AR) e distúrbios da coluna vertebral13. Em comparação com EA e PRP, o tratamento com esferas de vidro revestidas quimicamente e incubação hipóxica para ativar monócitos são as características específicas da SCA16. Teoricamente, mais fatores anti-inflamatórios podem ser secretados pela adição de estresse de sobrevivência às células, resultando em uma maior concentração de componentes imunomoduladores essenciais, incluindo IL-1Ra. Os melhores benefícios terapêuticos da SCA na OA, em comparação com a EA, também foram relatados17. As doenças da superfície ocular compartilham antecedentes imunológicos semelhantes com as doenças inflamatórias ortopédicas em alguns aspectos. Portanto, com base nos resultados bem-sucedidos da terapia derivada do sangue humano no campo ortopédico, a SCA pode ter vantagens sobre os tratamentos convencionais na prática clínica pelas propriedades epiteliotrópicas e imunomoduladoras. Embora a SCA tenha sido amplamente utilizada em doenças inflamatórias ortopédicas, suas aplicações clínicas em oftalmologia ainda precisam ser exploradas, o que pode ser dificultado pelo seu alto custo, falta de respaldo na literatura e falta de padronização do processo de preparo, resultando em desempenho diversificado.
Neste artigo em vídeo, um método novo, econômico e conveniente foi demonstrado para gerar a SCA modificada (mACS), ou plasma rico em fatores de crescimento (PRGF), produzindo uma solução de colírio com um valor prático comparável às SCAs comercializadas. As idéias-chave de adicionar anticoagulantes e desencadear as células sanguíneas para secretar citocinas anti-inflamatórias por incubação estressada foram mantidas, mas ao contrário dos métodos quimicamente induzidos, como aqueles baseados em esferas de vidro revestidas com CrSO4 e kits comerciais, o estado crítico de estresse é fisicamente induzido pela incubação hipóxica neste método. Além disso, o glicerol foi adicionado para proporcionar benefícios extras, incluindo aumento da estabilidade da membrana das células sanguíneas, manutenção de uma pressão adequada do líquido extracelular osmótico18 e uma fonte adequada de nutrientes em condições hipóxicas que evitam o estresse excessivo das células.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Placa de cultura de 96 poços</td><td>Merck KGaA, Alemanha</td><td>CLS3997</td><td></td></tr><tr><td>Espéculo de tampa Barraquer</td><td>katena</td><td>K1-5355</td><td>15 mm</td></tr><tr><td>Porta-agulhas Barraquer</td><td>Katena</td><td>K6-3310</td><td>sem trava&nbsp;</td></tr><tr><td>Barron Vacuum Punch 8,0 mm</td><td>katena</td><td>K20-2108</td><td>para cortar papel de filtro</td></tr><tr><td>BD 10,0 mL tubos vacutainer contendo heparina 158 unidades USP</td><td>Becton,Dickinson and Company, US</td><td>367880</td><td>Pelo menos 6 tubos, necessários para coletar sangue para experimentos subsequentes e evitar aglutinação sanguínea</td></tr><tr><td>BD 21 G conjunto de infusão com asas de borboleta</td><td>Becton,Dickinson and Company, US</td><td>367281</td><td>Para distribuição uniforme de solução de glicerol</td></tr><tr><td>C57BL/6 camundongos&nbsp;</td><td>Centro Nacional de Animais de Laboratório</td><td>RMRC11005</td><td>para modelo de camundongo</td></tr><tr><td>Castroviejo fórceps 0.12 mm</td><td>katena&nbsp;</td><td>K5-2500</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf, Alemanha</td><td>5811000428</td><td>3.500 x g por 10 min</td></tr><tr><td>Cheng Yi Frasco conta-gotas esterilizado de 10,0 mL</td><td>Cheng Yi Chemical, Taiwan</td><td>CP405141</td><td>Deve ser estéril e como recipiente de armazenamento para o produto final</td></tr><tr><td>Removedor de anel de ferrugem da córnea com rebarba de 0,5 mm</td><td>Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX</td><td>CHI-675</td><td>para desbridamento do epitélio da córnea</td></tr><tr><td>Meio essencial mínimo modificado de Dulbecco</td><td>Merck KGaA, Alemanha</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro&nbsp;</td><td>Toyo Roshi Kaisha, Ltd.</td><td>1.11</td><td></td></tr><tr><td>Tiras oftálmicas de fluoresceína sódica U.S.P</td><td>OPTITECH</td><td></td> OPTFL100 <td>coloração para defeito epitelial da córnea&nbsp;</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Firstek, Taiwan</td><td>S300S</td><td>37 &deg; C para 4 h</td></tr><tr><td>Luvas estéreis Kanam</td><td>Latex Industries, Índia</td><td>EN455</td><td>Para operação asséptica</td></tr><tr><td>Merck 0.22 &micro; Filtro m</td><td>Merck KGaA, Alemanha</td><td>PR05359</td><td>Pelo menos 2 filtros para filtração mACS</td></tr><tr><td>Nang Kuang 250 mL solução de glicerol a 10%</td><td>Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan</td><td>19496</td><td>Para oferecer efeito de estabilização de membrana adequado e pressão osmótica extracelular para células sanguíneas</td></tr><tr><td>Solução salina normal</td><td>TAIWAN BIOTECH CO., LTD.</td><td>100-120-1101</td><td></td></tr><tr><td>Punção de biópsia de pele 2mm</td><td>STIEFEL</td><td>22650</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA</td><td>SV11</td><td>microscópio para cirurgia</td></tr><tr><td>Terumo agulha de 18 G</td><td>Terumo, Taiwan</td><td>Seringa de SMACF0120-18BX</td><td>de 3,0 mL com agulha de 18 G para extrair o sobrenadante após centrifugação</td></tr><tr><td>Seringa de 20,0 mL</td><td>Terumo, Taiwan</td><td>MDSS20ES</td><td>Pode ser usado para coletar soro após a centrifugação inicial e usá-lo para centrifugação secundária.</td></tr><tr><td>Terumo 3,0 mL com agulha 23 G</td><td>Terumo, Taiwan</td><td>MDSS03S2325</td><td>seringa de 3,0 mL é usada para extrair o sobrenadante após centrifugação. Em seguida, ligue o filtro e a agulha injetável de 23 G nos frascos de colírio.</td></tr><tr><td>Tesoura de Tenotomia Westcott Medium</td><td>katena</td><td>K4-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

produção de soro autólogo condicionado modificado e avaliação ex vivo de seu potencial de cicatrização em epitélio corneano murino

Production of Modified Autologous Conditioned Serum and Ex Vivo Assessment of Its Healing Potential in Murine Corneal Epithelium

As terapias tópicas derivadas do sangue humano têm sido um benefício para os clínicos nas últimas décadas. O soro autólogo (EA) e o plasma rico em plaquetas (PRP) são enriquecidos em fatores de crescimento epiteliotrópicos essenciais na cicatrização de feridas na córnea. Ao contrário da EA, o PRP é baseado em um sistema de centrifugação diferencial, produzindo mais fatores de crescimento derivados de plaquetas. O soro condicionado autólogo (SCA) não só preserva a preparação de EA e PRP, mas também se concentra nas propriedades imunomoduladoras, que são importantes em doenças inflamatórias.
A falta de protocolos padronizados e os altos custos de preparo são limitações para a aplicação clínica das SCA. Este experimento em vídeo demonstra um procedimento operacional padrão para a preparação de colírios de soro condicionado autólogo modificado (mACS). Primeiro, o glicerol foi adicionado às seringas de heparina como estabilizador das células sanguíneas durante a incubação hipóxica. Para ativar as células sanguíneas, iniciou-se incubação de 4 h a 37 °C. Em seguida, as amostras de sangue foram centrifugadas a 3.500 × g por 10 min à temperatura ambiente. Após filtração do sobrenadante através de um filtro de 0,22 μm, os colírios mACS foram totalmente preparados.
Uma tentativa de experimentar o efeito terapêutico da mACS mostrou que ela pode ter vantagens competitivas sobre a EA convencional na cicatrização de feridas na córnea em olhos de camundongos ex vivo . A EA utilizada neste estudo foi preparada de acordo com estudos publicados e com a prática clínica em nosso hospital. Portanto, a eficácia da mACS em doenças da superfície ocular poderia ser avaliada em pesquisas futuras através de estudos in vivo em animais e ensaios clínicos.

A Figura 1 e a Figura 2 mostram os materiais necessários para o experimento, e a Figura 3 mostra as etapas sequenciais e os produtos intermediários bem-sucedidos durante a preparação do mACS. Primeiro, 0,5 mL de solução de glicerol a 10% foi adicionado a cada tubo de ensaio estéril de 10 mL (Figura 3A). Em seguida, 60-70 mL de sangue venoso foram obtidos do paciente, e 10 mL de sangue foram injetados em...

Este artigo descreve um protocolo para simplificar o processo e tornar a preparação de soro condicionado autólogo (SCA) menos dispendiosa. Não são necessárias seringas especiais ou contas de vidro revestidas de superfície. Além disso, a SCA modificada (mACS) apresenta vantagens competitivas sobre o soro autólogo convencional na cicatrização de feridas corneanas de olhos murinos ex vivo.

Produção de Soro Autólogo Condicionado Modificado e Avaliação Ex Vivo de seu Potencial de Cicatrização em Epitélio Corneano Murino

Human blood-derived topical therapies have been a boon to clinicians in recent decades. Autologous serum (AS) and platelet-rich plasma (PRP) are enriched ...

Este processo apresenta um produto derivado do sangue inovador chamado mACS, que não requer nenhum processamento técnico complexo. Também acelera a cicatrização de feridas em maior extensão do que o soro autólogo convencional. Além de proporcionar um processo de preparo padronizado, essa técnica também pode reduzir o custo dos colírios de soro, melhorando o acesso do paciente a uma opção de tratamento mais acessível.Essa técnica pode ser aplicada em campos que necessitam promover a regeneração, o reparo e a anti-inflamação de feridas ou tecidos. Esta técnica será uma grande vantagem para feridas de difícil cicatrização e doenças inflamatórias crônicas, como doenças graves da superfície ocular. Para começar, injete 10 mililitros do sangue venoso humano previamente colhido em cada um dos seis tubos de vacutainer.Coloque os tubos em uma incubadora a 37 graus Celsius por quatro horas e, em seguida, centrifugue os tubos a 3.500 G por 10 minutos à temperatura ambiente. Decap os tubos depois de colocá-los no rack. Depois de colocar luvas estéreis, use uma seringa de três mililitros equipada com uma agulha calibre 18 para retirar o mACS de cada tubo.Puxe a agulha e conecte um filtro de 0,22 micrômetro. Conecte a agulha de coleta de sangue de calibre 23 e 1,5 polegada com a seringa original de três mililitros à saída do filtro. Empurre a agulha suavemente através do filtro para os frascos de colírios estéreis preparados para uso imediato, armazene os colírios a quatro graus Celsius.No modelo de cicatrização de superfície ex-vivo, os indivíduos tratados com o colírio mACS apresentaram cicatrização corneana superior àquelas tratadas com as gotas de soro autólogo. Em 16 horas, as feridas corneanas de todos os grupos cicatrizaram mais lentamente do que a tratada com 0,5%mACS. A córnea murina dos grupos DMEM e o soro autólogo em 24 horas demonstraram cicatrização comparável com a mACSS em 32 horas, exceto para o grupo de solução salina normal.Todos os outros grupos apresentaram recuperação próxima da totalidade. O passo mais importante é seguir procedimentos assépticos durante o processo. Os produtos séricos são ricos em nutrientes, portanto, o uso de produtos contaminados na córnea pode causar úlceras graves na córnea.Este produto pode ser usado para avaliar a cicatrização de feridas e a melhora dos sintomas de doenças da superfície ocular. A análise do componente de citocinas e a realização de ensaios clínicos randomizados e controlados maiores de mACS são essenciais para futuras pesquisas.

production-modified-autologous-conditioned-serum-ex-vivo-assessment

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Relatamos uma técnica para a fabricação de microbolsas dentro membranas electrospun para estudar o comportamento das células. Especificamente, descreve-se uma combinação de microstereolithography e de electrospinning para a produção de PLGA (poli (láctido-co-glicólido)) dispositivos de biomateriais córnea equipados com microestruturas.

Combinação de Microstereolithography e Electrospinning Produzir Membranas Equipado com nichos para a Regeneração da córnea

Um exemplo de terapia genética adenoviral nas córneas cultivadas de órgãos diabéticos humanos é apresentado para a normalização da cicatrização tardia de feridas e expressão de marcadores de células-tronco epiteliais marcadamente reduzida nessas córneas. Também descreve a otimização desse processo em culturas epiteliais límbicas enriquecidas com células-tronco.

Adenoviral terapia genética para Diabetic Ceratopatia: Efeitos sobre a cicatrização de feridas e Stem Cell marcador expressão em humanos Corneas Organ-cultivadas e células epiteliais Limbal

A cultura primária de células endoteliais da córnea de bovino foi utilizada para investigar o mecanismo de transição endotelial-mesenquimais da córnea. Além disso, um modelo criolesão endotélio corneano de rato foi utilizado para demonstrar transição endotelial-mesenquimais da córnea in vivo.

In vitro e in vivo em modelos para o Estudo de Transição da córnea endotelial-mesenquimal

Um protocolo para uma ex modelo de cultura da córnea órgão vivo, útil para estudos de cicatrização de feridas é descrita. Este sistema de modelo pode ser usado para avaliar os efeitos de agentes para promover a cicatrização regenerativa ou toxicidade de drogas em ambiente 3D multicelular organizada.

Ex Vivo modelo de cultura órgão da córnea para cicatrização de feridas estudos

Aqui, apresentamos um protocolo para desprender as células endoteliais da córnea (CEC) da membrana de Descemet (DM) usando um laser de neodímio:YAG (Nd:YAG) como um modelo de doença ex vivo para ceratopatia bânouca (BK).

Desenvolvimento de um modelo experimental não invasivo, assistido a laser de perda de células endoteliais córneas

Este protocolo descreve os passos críticos necessários para estabelecer e cultivar culturas de células endoteliais da córnea a partir de explantas de tecido humano ou ovino. Também é apresentado um método para subculindo células endoteliais córneas em biomateriais membranrosas.

Crescimento de Camadas de Células Endoteliais De Córnea Humana e Ovelha em Membranas Biomateriais

Aqui, modelos animais baseados em camundongos e coelhos são desenvolvidos para lesão mecânica e química do epitélio corneano para triagem de novas terapêuticas e do mecanismo subjacente.

Modelos Animais Ex Vivo e In Vivo para Lesões Mecânicas e Químicas do Epitélio da Córnea

Descemet's Stripping Only é um procedimento experimental em que pacientes com gutae córnea central resultante da Distrofia Corneal Endotelial De Fuchs têm a membrana de Descemet despojada para células periféricas para regenerar a camada endotelial. Apresentamos nova metodologia simulando DSO em córneas humanas distróficas ex vivo com cura acelerada estimulada pelo eFGF1 (NM141).

Um modelo de cultura de órgãos córneas humanas de descascamento de descemet apenas com cura acelerada estimulada pelo fator de crescimento do fibroblasto projetado 1

Desenvolvemos um modelo de rato de inflamação grave da córnea por meio de curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea. O estudo avaliou os padrões de inflamação da córnea, proliferação epitelial e alterações nas células-tronco límbicas sob condições inflamatórias.

Estabelecendo um modelo de inflamação grave da córnea em ratos com base na curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea

A cultura de órgãos ex vivo da córnea suína e a cicatrização de feridas epiteliais fornecem um meio econômico, ético, reprodutível e quantitativo para testar a toxicidade ocular de produtos químicos. Eles também ajudam a elucidar os mecanismos subjacentes à regulação da epitelização e reparo tecidual e na avaliação terapêutica para o tratamento de ceratopatia diabética e cicatrização retardada de feridas.

Avaliação da toxicidade terapêutica e química usando córneas suínas cultivadas em órgãos e cicatrização de feridas epiteliais

Um protocolo reprodutível é apresentado para a preparação, enriquecimento e aplicação de um hidrogel in situ de luz azul e reticulável gelatina–riboflavina para reparo de feridas estromais corneanas em coelhos, incluindo etapas procedimentais para manuseio cirúrgico, tarsórrafia parcial e cuidados pós-operatórios.

Fabricação e Aplicação Cirúrgica de Hidrogéis Enriquecidos de Gelatina–Riboflavina com Foto-Cruzamento para Reparo de Feridas Corneanas em Coelhos

Aprenda a preparar soro autólogo condicionado modificado para cicatrização de feridas em modelo ex vivo de epitélio corneano murino. Este método simplificado reduz custos e acelera a regeneração tecidual.

Produção de Soro Autólogo Condicionado Modificado e Avaliação Ex Vivo de seu Potencial de Cicatrização em Epitélio Corneano Murino (Vídeo) | JoVE Journal

Produção de Soro Autólogo Condicionado Modificado e Avaliação Ex Vivo de seu Potencial de Cicatrização em Epitélio Corneano Murino

Explorar mais vídeos