Name: Visualização de Metabólitos Identificados no Metaboloma Espacial da Medicina Tradicional Chinesa Utilizando DESI-MSI (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprenda a preparar amostras de plantas para análise por DESI-MSI, superando limitações de tecidos secos. Este método preserva a integridade amostral e permite mapear metabólitos em Salvia miltiorrhiza.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais da província de Sichuan (No. 2022NSFSC0171) e pelo Programa de Talentos Xinglin da Universidade de Chengdu da TCM (No. 030058042).

1. Preparação da amostra
<ol><li>Coletar raízes e folhas limpas de uma planta de Salvia miltiorrhiza de 2 anos de idade (Figura 1A) e cortar diretamente em uma espessura transversal de aproximadamente 3-5 mm manualmente. Em seguida, cole a amostra em uma lâmina de vidro do microscópio de adesão com fita dupla face (Figura 1B). NOTA: Verifique se o tamanho da fita dupla face é maior que a amostra. Se os tecidos estiverem secos, mergulhe-os em água ou paraformaldeído a 4% durante a noite antes de fatiar.</li>
	<li>Coloque outra lâmina de vidro do microscópio acima da amostra e envolva as duas lâminas de vidro com uma película selante como um sanduíche (Figura 1C). Congelar a amostra de sanduíche a -80 °C durante, pelo menos, 4 h e, em seguida, submetê-la a um vácuo de ar durante 2 h (Figura 1D) com os seguintes parâmetros de regulação: temperatura de armadilha a -75 a -82 °C e manómetro de vácuo a 2,5 a 3,7 Pa. NOTA: Certifique-se de que as duas lâminas de vidro estejam paralelas ao envolver a película de vedação para manter a superfície da amostra intacta. Se os tecidos vegetais tiverem um alto teor de umidade, estenda o tempo de ar-vácuo para 3 h. Não exceda 5 h, caso contrário, os tecidos irão facilmente fraturar.</li>
	<li>Conservar as amostras de sanduíche a -80 °C até à análise. Levar as amostras à temperatura ambiente num exsicador para evitar a condensação na superfície da amostra. Em seguida, sujeite a amostra à aplicação matricial.</li>
</ol>2. Instalação da unidade de ionização por eletrospray de dessorção (DESI)
<ol><li>Configuração do detector de implementos e calibração de massa do instrumento no modo ESI; realizar a configuração do detector usando Leucina Encefalina (LE) em solução de água-acetonitrila (1:1 v/v) e realizar calibração de massa com formiato de sódio (NaFA) em solução de isopropanol (1:1 v/v) em água.</li>
	<li>Retire a fonte ESI e monte a unidade DESI no espectrômetro de massa. Conecte a fonte de gás N2 à unidade DESI e ajuste a pressão do gás para cerca de 0,5 MPa (Figura 2A). Não há necessidade de desabafar o instrumento na troca de fontes.</li>
	<li>Encher a seringa de 5 ml com LE e ácido fórmico em solução de água-metanol (1:9 v/v) e ligar a seringa à bomba de seringa de alto desempenho para fornecer solvente para ionização dos produtos químicos na amostra (Figura 2B).</li>
	<li>Fixar um solvente que forneça capilar à seringa e ao pulverizador DESI (Figura 2C). O capilar que fornece solvente é um capilar padrão de 75 μm de diâmetro interno e 375 μm de diâmetro externo; é bastante estreito e facilmente é bloqueado por impurezas, portanto, os solventes usados nos processos de digitalização devem ser de grau MS e filtrados antes do uso para reduzir o risco de bloqueio.</li>
	<li>Ligue a bomba da seringa e ajuste a taxa de infusão em 2 μL/min para obter um fluxo constante e pulverização do solvente (Figura 2B). Desligue a válvula de gás N2 e, após cerca de 15 s, ligue-a; Uma pequena gota de solvente será soprada para o palco, e o spray pode ser visto se o fluxo de solvente estiver em um estado constante.</li>
	<li>Ajuste a posição do pulverizador em termos do ângulo de pulverização, eixo XYZ, protrusão e altura (Figura 2D). Utilizar marcadores vermelhos e pretos como referências para otimizar o sinal de espectrometria de massa, para obter uma intensidade de sinal acima de 1 x 105 no modo de sensibilidade (Figura 2E).<ol><li>A protrusão do pulverizador é o fator mais significativo que afeta a intensidade do sinal; ajustar a saliência trocando o protetor de gás N2 com uma chave de 5 mm. A direção do spray influencia a qualidade da imagem de massa; gire o pulverizador até que o pulverizador esteja reto. Uma vez que a protrusão esteja ajustada para a melhor posição de intensidade de sinal, tente não alterá-la ao trocar de fonte.</li>
	</ol></li>
	<li>Após todas as etapas acima, a configuração está pronta para experimentos, e a configuração é normalmente estável por >3 semanas de usabilidade, observadas após a configuração inicial.</li>
</ol>3. Aquisição de imagens do DESI-MS
<ol><li>Para DESI-MSI, não realizar pré-tratamento da amostra. Para amostras que já possuem pré-tratamento, minimize ao máximo as etapas de pré-tratamento. Por exemplo, algumas amostras só podem ser feitas com mídia de montagem, portanto, remova o excesso de mídia nas lâminas, se possível.</li>
	<li>Pegue uma imagem da amostra no slide (Figura 3A). Não toque na superfície da amostra para evitar qualquer absorção de impurezas.</li>
	<li>Coloque a lâmina na posição da placa no palco DESI. O palco tem duas posições de placa, A e B; É importante lembrar a posição certa. Use slides padrão (75 mm x 25 mm) ou um slide completo, caso contrário, o slide não caberá na posição e não poderá ser mantido de forma estável. Uma lâmina completa (120 mm x 80 mm) pode acomodar até quatro lâminas e, portanto, tem uma área muito maior para experimentos.</li>
	<li>Abra o software de processamento de imagem em massa de alta definição, defina uma nova placa na guia Adquirir e selecione a posição correta da placa (A ou B) e o tipo de placa. Na página de seleção de imagem, selecione os quatro cantos do slide e, em seguida, a imagem é ajustada automaticamente para a orientação correta (Figura 3A).</li>
	<li>Definir os parâmetros MS; o tipo de experimento comumente usado é o modo DESI-MS, no qual apenas o íon pai será detectado. O instrumento pode usar apenas uma polaridade em um experimento; Portanto, selecione a polaridade como positiva ou negativa. Para obter mais informações sobre produtos químicos em pequenas quantidades, aplique o modo de sensibilidade (Figura 3B).</li>
	<li>Desenhe um retângulo para definir a área de digitalização na guia Padrão e defina o tamanho do pixel. Geralmente, para o modo DESI-MS, mantenha os tamanhos X e Y do pixel iguais. Defina a taxa de varredura para no máximo 5x o tamanho do pixel (Figura 3C).</li>
	<li>Salve o projeto e exporte uma planilha para o software de aquisição de espectrometria de massa.</li>
	<li>Abra o software de aquisição de espectrometria de massa, importe a planilha e salve-a como uma nova lista de amostras. Pressione Iniciar Executar para iniciar a verificação MSI. Várias imagens podem ser adicionadas à fila de experimentos importando mais planilhas.</li>
</ol>4. Processamento de dados DESI-MSI e visualização
<ol><li>Carregue o arquivo de dados da amostra no software de processamento de imagens em massa e defina os parâmetros para o processamento de imagens DESI (Figura 3D). Como a Leucina Encefalina foi utilizada para a massa da trava interna, e a massa da trava é o único ponto a identificar a polaridade do experimento, é de grande importância definir a massa da trava correta. Defina os seguintes valores: para o modo positivo: 556,2772; para o modo negativo: 554,2620.</li>
	<li>É possível construir uma lista de produtos químicos alvo, caso em que o resultado do processamento se concentrará nos produtos químicos na lista de alvo. Carregue o arquivo de dados processado para visualizar a imagem DESI da amostra. Clique no botão "Normalização" para normalizar os dados por cromatografia de íons totais (TIC) para obter a intensidade relativa de um produto químico específico para a referência, então diferentes amostras podem ser comparadas entre si (Figura 3E).</li>
	<li>Desenhar uma região de interesse (ROI) e copiar várias cópias na imagem de amostra; As ROIs podem ser feitas em diferentes imagens. Selecione todas as ROIs e exporte a análise multivariada (MVA) para extrair informações de SM de todas as ROIs para MVA (Figura 3F).</li>
</ol>

<ol><li>Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%3A+a+review+of+emerging+advancements+and+future+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights.</a> Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).</li>
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<li>Robinson, S., Warburton, K., Seymour, M., Clench, M., Thomas-Oates, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+water-soluble+carbohydrates+in+wheat+stems+using+imaging+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Localization of water-soluble carbohydrates in wheat stems using imaging matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry.</a> New Phytologist. 173 (2), 438-444 (2007).</li>
<li>Yoshimura, Y., Zaima, N., Moriyama, T., Kawamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+localization+patterns+of+anthocyanin+species+in+the+pericarp+of+black+rice+revealed+by+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Different localization patterns of anthocyanin species in the pericarp of black rice revealed by imaging mass spectrometry.</a> PLoS One. 7 (2), 31285(2012).</li>
<li>Jun, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-spatial+and+high-mass+resolution+imaging+of+surface+metabolites+of+Arabidopsis+thaliana+by+laser+desorption-ionization+mass+spectrometry+using+colloidal+silver%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-spatial and high-mass resolution imaging of surface metabolites of Arabidopsis thaliana by laser desorption-ionization mass spectrometry using colloidal silver.</a> Analytical Chemistry. 82 (8), 3255-3265 (2010).</li>
<li>Shroff, R., Vergara, F., Muck, A., Svatos, A., Gershenzon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonuniform+distribution+of+glucosinolates+in+Arabidopsis+thaliana+leaves+has+important+consequences+for+plant+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nonuniform distribution of glucosinolates in Arabidopsis thaliana leaves has important consequences for plant defense.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences. 105 (16), 6196-6201 (2008).</li>
<li>Vrkoslav, V., Muck, A., Cvacka, J., Svatos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+imaging+of+neutral+cuticular+lipids+in+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">MALDI imaging of neutral cuticular lipids in insects and plants.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 220-231 (2010).</li>
<li>Sarsby, J., Towers, M. W., Stain, C., Cramer, R., Koroleva, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+of+glucosinolates+in+Arabidopsis+flowers+and+siliques%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging of glucosinolates in Arabidopsis flowers and siliques.</a> Phytochemistry. 77, 110-118 (2012).</li>
<li>Peukert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+analysis+of+small+molecules+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometric+imaging+%28MALDI-MSI%29%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved analysis of small molecules by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging (MALDI-MSI).</a> New Phytologist. 193 (3), 806-815 (2012).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogation+of+spatial+metabolome+of+Ginkgo+biloba+with+high-resolution+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+and+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Interrogation of spatial metabolome of Ginkgo biloba with high-resolution matrix-assisted laser desorption/ionization and laser desorption/ionization mass spectrometry imaging.</a> Plant, Cell & Environment. 41 (11), 2693-2703 (2018).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+dynamic+changes+of+chemical+constituents+in+raw+and+processed+Fuzi+with+different+steaming+time+points+using+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry+imaging+combined+with+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Unveiling dynamic changes of chemical constituents in raw and processed Fuzi with different steaming time points using desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging combined with metabolomics.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 842890(2022).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O surgimento da tecnologia MS abriu uma nova visão na pesquisa de produtos naturais em nível molecular durante os últimos anos24. O instrumento MS, com sua alta sensibilidade e alto rendimento, permite a análise direcionada e não direcionada de metabólitos em produtos naturais, mesmo com traços de concentração25. Portanto, a EM é atualmente amplamente utilizada no campo da química da medicina tradicional chinesa (MTC). A pesquisa qualitativa e quantitativa sobre a composiçã...

A visualização da distribuição de metabólitos tornou-se um tópico crucial na ciência vegetal, especialmente na medicina tradicional chinesa, pois revela o processo de formação de metabólitos específicos dentro da planta. Com referência à medicina tradicional chinesa (MTC), fornece informações sobre os componentes ativos e orienta a aplicação de partes de plantas em aplicações farmacêuticas. Normalmente, a visualização dos metabólitos é obtida por hibridização in situ, microscopia de fluorescência ou imunohistoquímica, porém o número de compostos detectados por esses experimentos transmite informações químicas limitadas. Combinada com a coloração tecidual, a imagem por espectrometria de massa (MSI) pode fornecer uma grande quantidade de dados e fornecer informações de distribuição espacial de compostos por meio da varredura e análise de cortes de tecidono nível 1 da mícron. O MSI usa analitos para dessorção e ionização da superfície da amostra, seguido de análise de massa dos íons de fase vapor resultantes e aplicação de software de imagem para integrar as informações e plotar uma imagem bidimensional registrando uma abundância específica de íons. Essa tecnologia pode determinar moléculas exógenas e endógenas por meio da detecção da distribuição característica de fármacos e seus metabólitos induzidos em tecidos e órgãos-alvo 2,3,4,5.
Várias modalidades de imagem da EM foram desenvolvidas nas últimas décadas; os mais proeminentes entre eles são o MSI BASEADO EM IONIZAÇÃO POR ELETROSPRAY DE DESSORÇÃO (DESI-MSI), dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI) e espectrometria de massa de íons secundários (SIMS)6. O DESI-MSI é frequentemente utilizado em pesquisas biológicas devido à sua operação atmosférica, alto rendimento e maior precisão7. O MALDI tem sido aplicado para identificar um fragmento de transtirretina como potencial biomarcador nefrotóxico para gentamicina e para analisar a distribuição do metabólito neurotóxico 1-metil-4-fenilpiridínio após o manejo de 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina em cérebros de camundongos 8,9. MALDI e DESI têm sido usados para determinar a composição de estruturas cristalinas induzidas por drogas no rim de coelhos dosados; Essas estruturas são compostas principalmente por metabólitos formados devido à desmetilação e/ou oxidação do fármaco10. Adicionalmente, o MSI tem sido aplicado na localização da distribuição metabólica da toxicidade de drogas em órgãos-alvo. No entanto, as células do tecido vegetal variam e são diferentes dos animais e requerem procedimentos especiais de seccionamento.
Em plantas, utilizando imagens MALDI, até o momento, foi analisada a distribuição de diferentes compostos em caule de trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), sementes de arroz (Oryza sativa), flores e raízes de Arabidopsis thaliana e sementes de cevada (Hordeum vulgare)11,12,13,14,15,16,17,18 . Estudos recentes relatam que o DESI-MSI está emergindo na análise de metabólitos de drogas e produtos naturais, especialmente em MTCs como Ginkgo biloba, Fuzi e Artemisia annua L 19,20,21. Nesses estudos, os protocolos para a preparação de amostras de material vegetal diferem e alguns requerem equipamentos mais complexos, como um micrótomo de congelamento. O DESI-MSI tem requisitos rigorosos para a planicidade superficial da amostra detectada. Ao analisar o órgão ou tecido de um animal, a amostra geralmente é feita por criossecção22. No entanto, o procedimento para criosseccionamento é complicado e mais caro, e o método de temperatura de corte ótima (OCT) comumente usado com adesivo tem um forte sinal durante a obtenção de imagens. Além disso, os tecidos medicinais da MTC variam; por exemplo, a raiz de Salvia miltiorrhiza, conhecida como Danshen em chinês, é usada medicinalmente, enquanto em Zisu (Perilla frutescens), a folha é usada23,24. Portanto, é necessário melhorar os procedimentos de preparação da amostra para promover a utilização do DESI na análise de metabólitos para MTC.
Como uma erva perene e uma MTC comumente usada, S. miltiorrhiza foi inicialmente registrada na monografia de medicina mais antiga, Shennong's Classic of Materia Medica (conhecido como Shennong Bencao Jing em chinês). Neste estudo, otimizamos os procedimentos de corte e imagem DESI e desenvolvemos um método mais custo-efetivo para identificar a distribuição e categorizar os compostos nos tecidos de S. miltiorrhiza. Este método também pode superar as desvantagens associadas aos tecidos secos - que geralmente fraturam facilmente sob o golpe de nitrogênio - e promover o desenvolvimento da MTC. O estudo promoverá a padronização da MTC/medicina étnica para tecnologias relacionadas à pesquisa.

<table><tbody><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher</td><td>CAS:67-63-0</td><td>HPLC grau</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Número-75-05-8</td><td>LC-MS grau</td></tr><tr><td>Adesão Lâminas de microscópio</td><td>Citotest scientific</td><td>80312-3161</td><td>lâminas de vidro para microscópio&nbsp; podem aderir à amostra&nbsp;</td></tr><tr><td>Bomba de vácuo seca refrigerada a ar</td><td>EYELA</td><td>FDU-2110</td><td>Equipamento de vácuo a ar a -80&deg; C</td></tr><tr><td>Ácido Fórmico</td><td>ACS</td><td>F1089 | 64-18-6</td><td>LC-MS grau</td></tr><tr><td>LE (Leucina Encefalina)</td><td>Waters</td><td>186006013-1</td><td>LC-MS grau</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Number-67-56-1</td><td>LC-MS grau</td></tr><tr><td>Parafilm&nbsp;</td><td>Bemis Company</td><td>sc-200288</td><td>Filme de Vedação de Laboratório</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-aldrich</td><td>V900894</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de Massa Q-Tof de grau Reagente com fonte DESI</td><td>Waters</td><td>Synapt XS</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização de metabólitos identificados no metaboloma espacial da medicina tradicional chinesa utilizando desi-msi

Visualization of Metabolites Identified in the Spatial Metabolome of Traditional Chinese Medicine Using DESI-MSI

O uso medicinal da medicina tradicional chinesa deve-se principalmente aos seus metabólitos secundários. A visualização da distribuição desses metabólitos tornou-se um tópico crucial na ciência vegetal. A espectrometria de massa pode extrair grandes volumes de dados e fornecer informações de distribuição espacial sobre eles por meio da análise de fatias de tecido. Com a vantagem de alto rendimento e maior precisão, a imagem por espectrometria de massa por ionização por eletrospray de dessorção (DESI-MSI) é frequentemente usada em pesquisas biológicas e no estudo da medicina tradicional chinesa. No entanto, os procedimentos utilizados nesta pesquisa são complicados e pouco acessíveis. Neste estudo, otimizamos os procedimentos de corte e imagem DESI e desenvolvemos um método mais custo-efetivo para identificar a distribuição de metabólitos e categorizar esses compostos em tecidos vegetais, com foco especial na medicina tradicional chinesa. O estudo promoverá a utilização do DESI na análise de metabólitos e padronização da medicina tradicional chinesa/medicina étnica para tecnologias relacionadas à pesquisa.

Este protocolo pode levar à identificação e distribuição de compostos em amostras de plantas. Na imagem MS de um m/z específico, a cor de cada pixel representa a intensidade relativa do m/z, portanto, pode ser associada à distribuição natural e à abundância do íon metabólito ao longo da amostra. Quanto maior a abundância do produto químico na posição de coleta, mais brilhante é a cor. A barra na figura (Figura 4A-D) mostra o gradiente das cores. Aqui, seleci...

Neste estudo, uma série de métodos são apresentados para preparar amostras de DESI-MSI de plantas, e um procedimento de instalação de montagem de DESI, aquisição de dados MSI e processamento é descrito em detalhes. Este protocolo pode ser aplicado em diversas condições para aquisição de informações do metaboloma espacial em plantas.

Visualização de Metabólitos Identificados no Metaboloma Espacial da Medicina Tradicional Chinesa Utilizando DESI-MSI

The medicinal use of traditional Chinese medicine is mainly due to its secondary metabolites. Visualization of the distribution of these metabolites has ...

Este artigo descreve principalmente um método custo-efetivo de preparação de amostras de plantas e imagens usando DESI-MSI, e pode superar as desvantagens associadas aos tecidos secos, que facilmente fraturam quando o nitrogênio sopra. A raiz foi criossecada no micrótomo criostato, enquanto a folha foi preparada por imprinting, o que requer máquina cara ou perde intensidade de sinal. Nosso método pode superar essas limitações.Este método pode ser utilizado na metabolômica espacial de plantas como distribuição e movimentação de tóxicos em plantas sob estresse abiótico e biótico. Para começar, pegue raízes e folhas limpas de uma planta de salvia miltiorrhiza de dois anos de idade e corte diretamente em uma espessura transversal de aproximadamente três a cinco milímetros. Em seguida, cole a amostra em uma lâmina de vidro do microscópio de adesão usando fita dupla face.Coloque outra lâmina de vidro do microscópio acima da amostra e envolva-a com uma película de vedação como um sanduíche. Em seguida, congele a amostra de sanduíche a 80 graus Celsius negativos por pelo menos quatro horas, depois submeta-a a um vácuo de ar por duas horas com a temperatura retida em 75 a 82 graus Celsius negativos e medidor de vácuo em 2,5 a 3,7 pascal. Para análise, após a remoção das amostras do armazenamento refrigerado, leve-as à temperatura ambiente em um exsicador para evitar a condensação na superfície da amostra antes de submeter a amostra à aplicação em matriz.Implemente a configuração do detector de instrumentos e a calibração de massa em ionização por eletrospray, ou modo ESI. Realizar a montagem do detector usando leucina e cefalia em acetonitrila de água na proporção de um para um, e realizar calibração de massa com formiato de sódio e isopropanol de água na proporção de um para um. Retire a fonte ESI e monte a unidade DESI no espectrômetro de massa.Conecte a fonte de gás nitrogênio à unidade DESI e ajuste a pressão do gás para cerca de 0,5 megapascal. Encha uma seringa de cinco mililitros com leucina e cefalia e ácido fórmico em metanol de água na proporção de um para nove e conecte a seringa à bomba de seringa de alto desempenho para fornecer solvente para ionização dos produtos químicos na amostra. Em seguida, conecte um capilar que fornece solvente à seringa e ao pulverizador DESI.O capilar que fornece solvente é um capilar padrão de dimensões com um diâmetro interno de 75 micrômetros e diâmetro externo de 375 micrômetros. Ligue a bomba da seringa e ajuste a taxa de infusão para dois microlitros por minuto para obter um fluxo constante e pulverização do solvente. Desligue a válvula de gás nitrogênio e ligue-a após cerca de 15 segundos.Uma pequena gota de solvente sopra para o palco e o spray pode ser visto se o fluxo de solvente estiver em um estado constante. Em seguida, ajuste a posição do pulverizador em termos do ângulo de pulverização, eixo XYZ, protrusão e altura. Use marcadores vermelhos e pretos como referências para otimizar o sinal de espectrometria de massa para obter uma intensidade de sinal de cerca de uma vez 10 a quinta no modo de sensibilidade.Como a protrusão do pulverizador é o fator mais significativo que afeta a intensidade do sinal, ajuste a protrusão trocando o protetor de gás nitrogênio usando uma chave de cinco milímetros. A direção do spray influencia a qualidade da imagem de massa. Por isso, gire o pulverizador até que o pulverizador esteja reto.Após todas essas etapas, a configuração está pronta para experimentos e normalmente é estável por aproximadamente três semanas de usabilidade após a configuração inicial. Para imagens de DESI-MS, nenhum pré-tratamento da amostra é necessário. No entanto, remova o excesso de mídia nos slides, se possível.Tire uma imagem da amostra no slide. Sem tocar na superfície da amostra para evitar qualquer impureza, coloque a lâmina na posição da placa no estágio DESI, que tem duas posições de placa, A e B.Use lâminas padrão ou uma lâmina completa para se encaixar na posição. Um slide completo pode acomodar até quatro slides e, portanto, tem uma área muito maior para experimentos.Abra o software de processamento de imagens em massa de alta definição. Defina uma nova placa na guia Adquirir e selecione a posição correta da placa, A ou B, e o tipo de placa. Na página Seleção de Imagem, selecione os quatro cantos do slide e, em seguida, a imagem será ajustada automaticamente para a orientação correta.Para definir os parâmetros MS, selecione o tipo de experimento como modo DESI-MS que é comumente usado no qual somente o íon pai será detectado. Em seguida, selecione a polaridade como positiva ou negativa, pois o instrumento pode usar apenas uma polaridade em um experimento. Em seguida, aplique o modo de sensibilidade para obter mais informações sobre produtos químicos em pequenas quantidades.Em seguida, desenhe um retângulo para definir a área de digitalização na guia Padrão e defina o tamanho do pixel mantendo os tamanhos X e Y do pixel iguais. Defina a taxa de digitalização para no máximo cinco vezes o tamanho do pixel. Salve o projeto e exporte uma planilha para o software de aquisição MS.Em seguida, importe a planilha para o software de aquisição MS e salve-a como uma nova lista de exemplo. Pressione Iniciar Executar para iniciar a varredura de imagens do MS e várias imagens podem ser adicionadas à fila de experimentos importando mais planilhas. Carregue o arquivo de dados da amostra no software de processamento de imagens em massa e defina os parâmetros para o processamento de imagens DESI.Como a leucina e a cefalia foram utilizadas para a massa de bloqueio interno, e a massa de bloqueio é o único ponto para identificar a polaridade do experimento, é crucial definir a massa de bloqueio correta. Defina 556.2772 para o modo positivo e 554.2620 para o modo negativo. Para criar uma lista de produtos químicos de destino, carregue o arquivo de dados processados para visualizar a imagem DESI da amostra.Clique no botão Normalização para normalizar os dados por cromatografia de íons totais para obter a intensidade relativa de um produto químico específico para a referência e, em seguida, diferentes amostras podem ser comparadas entre si. Desenhe uma região de interesse, ou ROI, e copie várias cópias na imagem de exemplo. Em seguida, selecione todas as ROIs e exporte a análise multivariada para extrair informações de EM de todas as ROIs.Imagens de espectrometria de massa das seções raiz e folha inteira mostram a distribuição espacial dos compostos selecionados. A cor de cada pixel representa a intensidade relativa da relação massa/carga e, portanto, pode ser associada à distribuição natural e à abundância do íon metabólito em toda a amostra. A distribuição dos compostos alvo, tanshinone IIA e ácido rosmarínico, é visível em diferentes áreas da raiz.O composto tanshinol A foi detectado nas seções foliares Como protocolo visando à reprodutibilidade, o mais importante é otimizar a intensidade do sinal ajustando a posição do pulverizador em várias dimensões.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Imagiologia por espectrometria de massa (MSI) é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para descobrir e identificar várias espécies químicas em tecidos intactos, preservando os compostos em seus ambientes nativos, que pode fornecer novos insights sobre processos biológicos. Aqui um método MSI desenvolvido para a análise de moléculas pequenas é descrito.

MALDI por espectrometria de massa de imagens de Investigação de metabólitos em<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Os nódulos radiculares

Uma fonte de imagem de espectrometria de massa (MSI) operada à pressão atmosférica foi desenvolvida acoplando dessorção a laser de infravermelho médio e pós-ionização por eletrospray. A matriz de gelo exógena foi usada como matriz de absorção de energia para facilitar a dessorção ressonante do material relacionado ao tecido. Este manuscrito fornece um protocolo passo a passo para a realização de IR-MALDESI MSI de camundongos neonatais de corpo inteiro.

Whole-body Espectrometria de Massa de imagem por infravermelhos matriz assistida por laser de Dessorção Ionização por Electrospray (IR-MALDESI)

O objetivo deste protocolo é fornecer orientação detalhada sobre a preparação da amostra ao planejar experimentos usando MALDI MSI para maximizar a detecção metabólica e molecular em amostras biológicas.

Preparação de amostras para perfil metabólico usando imagem de espectrometria de massa MALDI

Construímos um fluxo de trabalho metabolômico não-acompanhado que integrou XY-Meta e metaX juntos. Neste protocolo, exibimos como usar o XY-Meta para gerar uma biblioteca espectral chamariz a partir da referência de espectro de acesso aberto e, em seguida, executamos o controle FDR e usamos o metaX para quantificar os metabólitos depois de identificar o espectro metabolômico.

Um fluxo de trabalho integrado de identificação e quantificação no metabolome não-alvo baseado em controle FDR

Aqui, descrevemos um protocolo geral e um projeto que podem ser aplicados para identificar quantidades residuais e constituintes menores nas formulações complexas de produtos naturais (matrizes) na medicina tibetana.

Identificação Padronizada da Estrutura Composta na Medicina Tibetana Usando Espectrometria de Massa com Armadilha de Íons e Análise de Fragmentação em Múltiplos Estágios

Descrevemos um protocolo geral que integra análise de espectrometria de massa de alta resolução e docking molecular na pesquisa da medicina tradicional chinesa.

Espectrometria de massa em tandem de alta resolução para estudar constituintes químicos de Gynura bicolor DC

Este protocolo descreve a imagem por espectrometria de massa de célula única de células OVCAR-8 usando ionização por eletrospray por dessorção acoplada a espectrômetros de massa Orbitrap para análise metabolômica de alta resolução espacial.

Imagem por Espectrometria de Massa de Célula Única usando Ionização por Eletrospray por Dessorção Acoplada a Espectrômetros de Massa Orbitrap

Aqui, testamos a dissolução de grânulos de Rhodiola (RG) in vitro, desenhamos curvas de dissolução de salidrósido, ácido gálico e galato de etila em água ultrapura e ajustamos as curvas a diferentes modelos matemáticos. Este protocolo fornece informações e orientações para estudos de bioequivalência in vivo e de correlação in vivo-in vitro do GP.

Uma determinação de dissolução in vitro de componentes multiíndices em grânulos de Rhodiola da medicina tibetana

Um enema é um tipo de terapia da medicina tradicional chinesa (MTC) usada para tratar pancreatite aguda grave (PAS). A terapia envolve a instilação de um líquido TCM no reto e cólon através do ânus para manter o líquido no intestino, absorvendo através da mucosa intestinal. Este estudo tem como objetivo padronizar o procedimento do enema para pacientes com PAS.

Enema de Medicina Tradicional Chinesa para Pacientes com Pancreatite Aguda Grave

O presente protocolo descreve uma estratégia integrada para explorar os principais alvos e mecanismos de Fructus Phyllanthi contra hiperlipidemia baseada na predição de farmacologia de rede e verificação metabolômica.

Predição de Farmacologia de Rede e Validação Metabolômica do Mecanismo de Fructus Phyllanthi contra Hiperlipidemia

Aprenda a preparar amostras de plantas para análise por DESI-MSI, superando limitações de tecidos secos. Este método preserva a integridade amostral e permite mapear metabólitos em Salvia miltiorrhiza.

Visualização de Metabólitos Identificados no Metaboloma Espacial da Medicina Tradicional Chinesa Utilizando DESI-MSI

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