Visualização de Metabólitos Identificados no Metaboloma Espacial da Medicina Tradicional Chinesa Utilizando DESI-MSI

Este artigo descreve principalmente um método custo-efetivo de preparação de amostras de plantas e imagens usando DESI-MSI, e pode superar as desvantagens associadas aos tecidos secos, que facilmente fraturam quando o nitrogênio sopra. A raiz foi criossecada no micrótomo criostato, enquanto a folha foi preparada por imprinting, o que requer máquina cara ou perde intensidade de sinal. Nosso método pode superar essas limitações.

Este método pode ser utilizado na metabolômica espacial de plantas como distribuição e movimentação de tóxicos em plantas sob estresse abiótico e biótico. Para começar, pegue raízes e folhas limpas de uma planta de salvia miltiorrhiza de dois anos de idade e corte diretamente em uma espessura transversal de aproximadamente três a cinco milímetros. Em seguida, cole a amostra em uma lâmina de vidro do microscópio de adesão usando fita dupla face.

Coloque outra lâmina de vidro do microscópio acima da amostra e envolva-a com uma película de vedação como um sanduíche. Em seguida, congele a amostra de sanduíche a 80 graus Celsius negativos por pelo menos quatro horas, depois submeta-a a um vácuo de ar por duas horas com a temperatura retida em 75 a 82 graus Celsius negativos e medidor de vácuo em 2,5 a 3,7 pascal. Para análise, após a remoção das amostras do armazenamento refrigerado, leve-as à temperatura ambiente em um exsicador para evitar a condensação na superfície da amostra antes de submeter a amostra à aplicação em matriz.

Implemente a configuração do detector de instrumentos e a calibração de massa em ionização por eletrospray, ou modo ESI. Realizar a montagem do detector usando leucina e cefalia em acetonitrila de água na proporção de um para um, e realizar calibração de massa com formiato de sódio e isopropanol de água na proporção de um para um. Retire a fonte ESI e monte a unidade DESI no espectrômetro de massa.

Conecte a fonte de gás nitrogênio à unidade DESI e ajuste a pressão do gás para cerca de 0,5 megapascal. Encha uma seringa de cinco mililitros com leucina e cefalia e ácido fórmico em metanol de água na proporção de um para nove e conecte a seringa à bomba de seringa de alto desempenho para fornecer solvente para ionização dos produtos químicos na amostra. Em seguida, conecte um capilar que fornece solvente à seringa e ao pulverizador DESI.

O capilar que fornece solvente é um capilar padrão de dimensões com um diâmetro interno de 75 micrômetros e diâmetro externo de 375 micrômetros. Ligue a bomba da seringa e ajuste a taxa de infusão para dois microlitros por minuto para obter um fluxo constante e pulverização do solvente. Desligue a válvula de gás nitrogênio e ligue-a após cerca de 15 segundos.

Uma pequena gota de solvente sopra para o palco e o spray pode ser visto se o fluxo de solvente estiver em um estado constante. Em seguida, ajuste a posição do pulverizador em termos do ângulo de pulverização, eixo XYZ, protrusão e altura. Use marcadores vermelhos e pretos como referências para otimizar o sinal de espectrometria de massa para obter uma intensidade de sinal de cerca de uma vez 10 a quinta no modo de sensibilidade.

Como a protrusão do pulverizador é o fator mais significativo que afeta a intensidade do sinal, ajuste a protrusão trocando o protetor de gás nitrogênio usando uma chave de cinco milímetros. A direção do spray influencia a qualidade da imagem de massa. Por isso, gire o pulverizador até que o pulverizador esteja reto.

Após todas essas etapas, a configuração está pronta para experimentos e normalmente é estável por aproximadamente três semanas de usabilidade após a configuração inicial. Para imagens de DESI-MS, nenhum pré-tratamento da amostra é necessário. No entanto, remova o excesso de mídia nos slides, se possível.

Tire uma imagem da amostra no slide. Sem tocar na superfície da amostra para evitar qualquer impureza, coloque a lâmina na posição da placa no estágio DESI, que tem duas posições de placa, A e B.Use lâminas padrão ou uma lâmina completa para se encaixar na posição. Um slide completo pode acomodar até quatro slides e, portanto, tem uma área muito maior para experimentos.

Abra o software de processamento de imagens em massa de alta definição. Defina uma nova placa na guia Adquirir e selecione a posição correta da placa, A ou B, e o tipo de placa. Na página Seleção de Imagem, selecione os quatro cantos do slide e, em seguida, a imagem será ajustada automaticamente para a orientação correta.

Para definir os parâmetros MS, selecione o tipo de experimento como modo DESI-MS que é comumente usado no qual somente o íon pai será detectado. Em seguida, selecione a polaridade como positiva ou negativa, pois o instrumento pode usar apenas uma polaridade em um experimento. Em seguida, aplique o modo de sensibilidade para obter mais informações sobre produtos químicos em pequenas quantidades.

Em seguida, desenhe um retângulo para definir a área de digitalização na guia Padrão e defina o tamanho do pixel mantendo os tamanhos X e Y do pixel iguais. Defina a taxa de digitalização para no máximo cinco vezes o tamanho do pixel. Salve o projeto e exporte uma planilha para o software de aquisição MS.

Em seguida, importe a planilha para o software de aquisição MS e salve-a como uma nova lista de exemplo. Pressione Iniciar Executar para iniciar a varredura de imagens do MS e várias imagens podem ser adicionadas à fila de experimentos importando mais planilhas. Carregue o arquivo de dados da amostra no software de processamento de imagens em massa e defina os parâmetros para o processamento de imagens DESI.

Como a leucina e a cefalia foram utilizadas para a massa de bloqueio interno, e a massa de bloqueio é o único ponto para identificar a polaridade do experimento, é crucial definir a massa de bloqueio correta. Defina 556.2772 para o modo positivo e 554.2620 para o modo negativo. Para criar uma lista de produtos químicos de destino, carregue o arquivo de dados processados para visualizar a imagem DESI da amostra.

Clique no botão Normalização para normalizar os dados por cromatografia de íons totais para obter a intensidade relativa de um produto químico específico para a referência e, em seguida, diferentes amostras podem ser comparadas entre si. Desenhe uma região de interesse, ou ROI, e copie várias cópias na imagem de exemplo. Em seguida, selecione todas as ROIs e exporte a análise multivariada para extrair informações de EM de todas as ROIs.

Imagens de espectrometria de massa das seções raiz e folha inteira mostram a distribuição espacial dos compostos selecionados. A cor de cada pixel representa a intensidade relativa da relação massa/carga e, portanto, pode ser associada à distribuição natural e à abundância do íon metabólito em toda a amostra. A distribuição dos compostos alvo, tanshinone IIA e ácido rosmarínico, é visível em diferentes áreas da raiz.

O composto tanshinol A foi detectado nas seções foliares Como protocolo visando à reprodutibilidade, o mais importante é otimizar a intensidade do sinal ajustando a posição do pulverizador em várias dimensões.