Name: Otimizando o rendimento da tubulina do tecido cerebral suíno (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Aprenda a isolar tubulina com alta pureza a partir de tecido cerebral suíno usando centrifugação e microscopia eletrônica. Este método preserva a dinâmica natural da proteína para estudos de neurobiologia e desenvolvimento de fármacos.

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<meta charset="utf8"></head><body>Isolamento eficiente de tubulina do tecido neural

<ol><li>Verhey, K. J., Gaertig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The tubulin code.</a> Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).</li>
<li>Murphy, D. B., Hiebsch, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+microtubule+protein+from+beef+brain+and+comparison+of+the+assembly+requirements+for+neuronal+microtubules+isolated+from+beef+and+hog%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of microtubule protein from beef brain and comparison of the assembly requirements for neuronal microtubules isolated from beef and hog.</a> Anal Biochem. 96 (1), 225-235 (1979).</li>
<li>Borisy, G. G., Marcum, J. M., Olmsted, J. B., Murphy, D. B., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+and+associated+high+molecular+weight+proteins+from+porcine+brain+and+characterization+of+microtubule+assembly+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+NY+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin and associated high molecular weight proteins from porcine brain and characterization of microtubule assembly in vitro.</a> Ann NY Acad Sci. 253, 1 The Biology o 107-132 (1975).</li>
<li>Weisenberg, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+formation+in+vitro+in+solutions+containing+low+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations.</a> Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).</li>
<li>Roychowdhury, S., Gaskin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+assembly-competent+tubulin+from+brain+microtubule+protein+preparations+using+a+fast-performance+liquid+chromatography+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Separation of assembly-competent tubulin from brain microtubule protein preparations using a fast-performance liquid chromatography procedure.</a> J Neurochem. 46 (5), 1399-1405 (1986).</li>
<li>Weingarten, M. D., Suter, M. M., Littman, D. R., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+depolymerization+products+of+microtubules+from+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Properties of the depolymerization products of microtubules from mammalian brain.</a> Biochemistry. 13 (27), 5529-5537 (1974).</li>
<li>Souphron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+with+controlled+post-translational+modifications+by+polymerization-depolymerization+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles.</a> Nat Protoc. 14 (5), 1634-1660 (2019).</li>
<li>Jacobs, M., Huitorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin-associated+nucleoside+diphosphokinase%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tubulin-associated nucleoside diphosphokinase.</a> Eur J Biochem. 99 (3), 613-622 (1979).</li>
<li>Munguía, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+native+M.+vogae+and+H.+contortus+tubulin+by+TOG+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Purification of native M. vogae and H. contortus tubulin by TOG affinity chromatography.</a> Exp Parasitol. 182, 37-44 (2017).</li>
<li>Castoldi, M., Popov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+brain+tubulin+through+two+cycles+of+polymerization-depolymerization+in+a+high-molarity+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+ExpPurif%22%5BJournal%5D)">Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer.</a> Protein ExpPurif. 32 (1), 83-88 (2003).</li>
<li>Minoura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression%2C+purification%2C+and+functional+analysis+of+recombinant+human+tubulin+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer.</a> FEBS Lett. 587 (21), 3450-3455 (2013).</li>
<li>Liu, C., Yao, J., Yin, J., Xue, J., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+%CE%B1-+and+%CE%B2-tubulin+from+Echinococcus+granulosus%3A+Expression%2C+purification+and+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">Recombinant α- and β-tubulin from Echinococcus granulosus: Expression, purification and polymerization.</a> Parasite. 25, 62(2018).</li>
<li>Ti, S. -C., Wieczorek, M., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+affinity+tag-free+recombinant+tubulin+from+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of affinity tag-free recombinant tubulin from insect cells.</a> STAR protoc. 1 (1), 100011(2020).</li>
<li>Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+with+controlled+post-translational+modifications+and+isotypes+from+limited+sources+by+polymerization-depolymerization+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22JVisExp%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin with controlled post-translational modifications and isotypes from limited sources by polymerization-depolymerization cycles.</a> JVisExp. (165), e61826(2020).</li>
<li>Sackett, D. L., Werbovetz, K. A., Morrissette, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+tubulin+from+nonneural+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolating tubulin from nonneural sources.</a> Methods Cell Biol. 95, 17-32 (2010).</li>
<li>Modig, C., Strömberg, E., Wallin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+stability+of+posttranslationally+modified+brain+microtubules+isolated+from+cold-temperate+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Different stability of posttranslationally modified brain microtubules isolated from cold-temperate fish.</a> Mol Cell Biochem. 130 (2), 137-147 (1994).</li>
<li>Fourest-Lieuvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+from+limited+volumes+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Exp+Purif%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin from limited volumes of cultured cells.</a> Protein Exp Purif. 45 (1), 183-190 (2006).</li>
<li>MacRae, T. H., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+assembly+in+vitro+of+tubulin+from+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Purification and assembly in vitro of tubulin from Trypanosoma brucei.</a> Biochem J. 265 (1), 87-93 (1990).</li>
<li>Lazar, I. GelAnalyzer 19.1. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.gelanalyzer.com">www.gelanalyzer.com</a> (2024).</li>
<li>Jansen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mapping+of+microtubule-associated+protein+2c+%28MAP2c%29+phosphorylation+and+regulatory+protein+14-3-3%CE%B6-binding+sites+reveals+key+differences+between+MAP2c+and+its+homolog+Tau%5BTitle%5D)+AND+%22JBiol+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative mapping of microtubule-associated protein 2c (MAP2c) phosphorylation and regulatory protein 14-3-3ζ-binding sites reveals key differences between MAP2c and its homolog Tau.</a> JBiol Chem. 292 (24), 3-3 (2017).</li>
<li>Melková, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+microtubule+associated+proteins+Tau+and+MAP2c%3A+Similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of microtubule associated proteins Tau and MAP2c: Similarities and differences.</a> Biomolecules. 9 (3), E105(2019).</li>
<li>Herzog, W., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+brain+microtubule-associated+proteins%3A+Isolation+of+two+different+proteins+which+stimulate+tubulin+polymerization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fractionation of brain microtubule-associated proteins: Isolation of two different proteins which stimulate tubulin polymerization in vitro.</a> Eur J Biochem. 92 (1), 1-8 (1978).</li>
<li>Castle, A. G., Crawford, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+tubulin+from+pig+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Isolation of tubulin from pig platelets.</a> FEBS Lett. 51 (1), 195-200 (1975).</li>
<li>Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+post-translational+modifications+and+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics.</a> Int J Mol Sci. 18 (10), E2207(2017).</li>
<li>Lafanechère, L., Job, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+tubulin+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">The third tubulin pool.</a> Neurochem Res. 25 (1), 11-18 (2000).</li>
<li>Arai, T., Ihara, Y., Arai, K., Kaziro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+from+bovine+brain+and+its+interaction+with+guanine+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin from bovine brain and its interaction with guanine nucleotides.</a> J Biochem. 77 (3), 647-658 (1975).</li>
<li>Mahaddalkar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+investigations+into+the+binding+mode+of+a+novel+noscapine+analogue%2C+9-%284-vinylphenyl%29+noscapine%2C+with+tubulin+by+biochemical+analyses+and+molecular+dynamic+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Struct+Dyn%22%5BJournal%5D)">Structural investigations into the binding mode of a novel noscapine analogue, 9-(4-vinylphenyl) noscapine, with tubulin by biochemical analyses and molecular dynamic simulations.</a> J Biomol Struct Dyn. 35 (11), 2475-2484 (2017).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+study+of+novel+6-Aryl-2-benzoyl-pyridines+as+tubulin+polymerization+inhibitors+with+potent+antiproliferative+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship study of novel 6-Aryl-2-benzoyl-pyridines as tubulin polymerization inhibitors with potent antiproliferative properties.</a> J Med Chem. 63 (2), 827-846 (2020).</li>
<li>Yao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferulin+C+triggers+potent+PAK1+and+p21-mediated+anti-tumor+effects+in+breast+cancer+by+inhibiting+Tubulin+polymerization+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Ferulin C triggers potent PAK1 and p21-mediated anti-tumor effects in breast cancer by inhibiting Tubulin polymerization in vitro and in vivo.</a> Pharmacol Res. 152, 104605(2020).</li>
<li>Sweetnam, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+receptor+binding+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22JNat+Prod%22%5BJournal%5D)">The role of receptor binding in drug discovery.</a> JNat Prod. 56 (4), 441-455 (1993).</li>
<li>Qi, Z. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+biological+evaluation+of+1-%28benzofuran-3-yl%29-4-%283%2C4%2C5-trimethoxyphenyl%29-1H-1%2C2%2C3-triazole+derivatives+as+tubulin+polymerization+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and biological evaluation of 1-(benzofuran-3-yl)-4-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-1H-1,2,3-triazole derivatives as tubulin polymerization inhibitors.</a> Bioorg Chem. 94, 103392(2020).</li>
<li>Sáez-Calvo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triazolopyrimidines+are+microtubule-stabilizing+agents+that+bind+the+vinca+inhibitor+site+of+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Bio%22%5BJournal%5D)">Triazolopyrimidines are microtubule-stabilizing agents that bind the vinca inhibitor site of tubulin.</a> Cell Chem Bio. 24 (6), 737-750 (2017).</li>
<li>Bellocq, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+assembly-competent+tubulin+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22EurJ+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of assembly-competent tubulin from Saccharomyces cerevisiae.</a> EurJ Biochem. 210 (1), 343-349 (1992).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubos de 1,5 mL</td><td>---</td><td>---</td> <td>Material comum</td></tr><tr><td>Tubos de 10 mL</td><td>---</td><td>---</td> <td>Material comum</td></tr><tr><td>Tubos de 50 mL</td><td>---</td><td>---</td><td>Material comum</td></tr><tr><td>ATP</td><td>ROTH</td><td>HN35.2</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ROTH</td><td>A994.2</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>Homogeneizador de vidro Dounce</td><td>P-LAB</td><td>H244043</td><td>Homogeneizador</td></tr><tr><td>DTT</td><td>ROTH</td><td>6908.1</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td>Etanol de grau analítico</td></tr><tr><td></td><td>PENTA</td><td>70390-11001</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>ROTH</td><td>6967.2</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>Copos graduados</td><td>---</td><td>---</td><td>Equipamento comum</td></tr><tr><td>Cilindros graduados</td><td>---</td><td>---</td><td>Equipamento comum</td></tr><tr><td>GTP</td><td>MERCK</td><td>36051-31-7</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>PENTA</td><td>19360-11000</td><td></td></tr> de muito alta qualidade Caixa <tr><td>izonada de grau analítico para transporte</td> de <td>tecidos---</td><td>---</td><td>Equipamento comum</td></tr><tr><td>Liquidificador de cozinha</td><td>Waring</td><td>7011HB</td><td>Recipiente de vidro ou plástico</td></tr><tr><td>Nitrogênio líquido</td><td>---</td><td>---</td><td>Material comum</td></tr><tr><td>MES&nbsp;</td><td>ROTH</td><td>6066.4</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MERCK</td><td>814733&nbsp;</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>PENTA</td><td>43180-31000</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>PENTA</td><td>15650-11000</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>Optima XPN100</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>A94469</td><td>Ultracentrífuga</td></tr><tr><td>Coluna de fosfocelulose</td><td>VWR</td><td>GENO786-1291</td><td>Coluna vazia</td></tr><tr><td>Resina de fosfocelulose</td><td>Creative - Biomart, inc</td><td>Fosfato-001C</td><td>Resina de permuta iónica</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>ROTH</td><td>9156.2</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>PENTA</td><td>24970-31000</td><td>Escalas de grau analítico</td></tr><tr><td></td><td>---</td><td>--- </td><td>Equipamento comum</td></tr><tr><td>Tesoura---</td><td></td><td>---</td><td>Equipamento comum</td></tr><tr><td>Colheres&nbsp;</td><td>---</td><td>---</td><td>Plástico ou vidro</td></tr><tr><td>Rotor Ti45</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>339160</td><td>Rotor para pinças de ultracentrífuga</td></tr><tr><td>---</td><td></td><td>---</td><td>Equipamento comum</td></tr><tr><td>Ultra turrax IKA T18 basic</td><td>IKA</td><td>356 1000</td><td>Dispensador de laboratório</td></tr><tr><td>Banho-maria 37 &deg; C</td><td>---</td><td>---</td><td>Agitado</td></tr></tbody></table>

otimizando o rendimento da tubulina do tecido cerebral suíno

Optimizing Tubulin Yield from Porcine Brain Tissue

Durante as etapas de separação e purificação, amostras para eletroforese de SDS-PAGE foram coletadas e posteriormente analisadas por meio da coloração de azul de Coomassie (Figura 2). 20 μL de cada amostra foram misturados com 10 μL de tampão de amostra Laemmli (188 mM Tris-HCl pH 6,8, 3% SDS (p / p), 30% glicerol (v / v), 0,01 azul de bromofenol (p / p), 15% β-mercaptoetanol) e incubado a 95 ° C por 15 min. 4 μL de cada amostra foram carregados em gel SDS de acrilamida a 12,5% e separados sob uma corrente constante de 30 mA por gel em condições redutoras e desnaturantes.
Os resultados confirmaram um aumento incremental na concentração relativa de tubulina acompanhado por uma redução nas proteínas contaminantes. Além disso, não houve perda significativa de tubulina no lisado clarificado na primeira centrifugação (etapa 3.2.7) em comparação com a omissão desta etapa (Figura 2A, B).
A concentração de proteína foi determinada por meio de três métodos independentes: ensaio de BCA, ensaio de proteína de Bradford e análise de densitometria em gel SDS-PAGE19 (Figura 3). O rendimento global de tubulina utilizando o procedimento descrito foi de 123 mg de tubulina purificada a partir de 250 g de tecido neural. Durante as medições, é necessário levar em consideração que a alta concentração de TDT no tampão de armazenamento tem um impacto significativo no ensaio de BCA. Tanto o tampão PEM quanto o tampão PBS, com a adição de DTT, aumentam a absorbância de fundo em cerca de 0,900 A595, o que reduz significativamente a capacidade do ensaio BCA (Figura 3A). O efeito negativo da TDT é detectável mesmo após diluição dez vezes maior com água pura (dados não mostrados). O ensaio de Bradford não pareceu ser afetado pelo tampão de armazenamento (Figura 3B), conforme confirmado pela análise densitométrica.
A pureza da preparação da tubulina foi verificada por análise de espectrometria de massa em duas instalações independentes (VRI Brno, República Tcheca; CEITEC MU Brno, República Tcheca) usando ionização por eletrospray e MALDI-TOF. Ambas as análises confirmaram a presença de tubulinas suínas alfa e beta em várias isoformas. A pureza geral foi superior a 97,07% (PSMs 1065), com as impurezas mais prevalentes originárias da queratina do Homo sapiens tipo II (PSMs 246, 2,24% das impurezas) que foram introduzidas provavelmente durante o isolamento da tubulina e preparação da amostra para análise MS / MS. Outras impurezas compostas por 322 PSMs e apenas albumina sérica, actina gama e tripsinogênio originárias de Sus scrofa foram identificadas com resolução de um peptídeo (0,0069%).
Em experimentos subsequentes, foi verificada a preservação da capacidade de polimerização após o congelamento instantâneo e armazenamento em nitrogênio líquido. A alíquota de 10 mg/mL foi removida do nitrogênio líquido e lentamente descongelada em gelo. Amostras de diferentes concentrações (10 mg/mL, 8 mg/mL, 6 mg/mL, 4 mg/mL e 2 mg/mL) foram preparadas diluindo as alíquotas em tampão PEM contendo DTT, ATP e GTP para o experimento de automontagem. Uma série de diluições foi incubada a 37 °C por 60 min, e a segunda foi incubada em gelo por 60 min. Ambas as séries foram centrifugadas por 60 min a 21.000 x g e a temperatura correspondente (4 °C ou 37 °C). 30 μL de sobrenadante foram removidos e usados para SDS-PAGE. O sobrenadante restante foi cuidadosamente removido com pipeta e descartado. Os pellets foram lavados brevemente adicionando 100 μM de tampão PEM, seguido de remoção imediata usando uma pipeta. Posteriormente, os pellets foram ressuspensos em 50 μL de tampão de carga SDS concentrado 1x para que a concentração relativa de pellet e sobrenadante seja preservada. 10 μL de tampão de carregamento SDS foram adicionados a cada sobrenadante. Todas as amostras foram analisadas por meio do SDS-PAGE e da coloração de Coomassie (Figura 4). O volume de cada amostra carregada no SDS-PAGE foi ajustado de acordo com a concentração inicial, de modo que a diferença de precipitação devido à concentração é mais óbvia. O teste de automontagem da tubulina em tampão PEM confirmou a capacidade de formar fibras de tubulina de maneira dependente da temperatura.
O ensaio de montagem da tubulina20,21 acionado por MAP2c verificando a capacidade da tubulina de interagir com outras proteínas foi realizado22. As diluições seriadas de MAP2c foram preparadas onde 100 μL de alíquotas de tubulina de 1 mg/mL foram misturadas com MAP2c até a concentração final variando de 0 μM a 8 μM. Todas as amostras foram preparadas em gelo diluindo em tampão PEM recém-preparado com 1 mM de DTT e 1 mM de GTP. A tubulina foi incubada por 15 min a 37 °C com diferentes concentrações de MAP2c, e centrifugada por 60 min a 21.000 x g e 37 °C. A lavagem final do pellet foi realizada duas vezes com 100 μL de tampão PEM. O experimento confirmou a capacidade da tubulina preparada de sofrer polimerização acionada por MAP2c, pois apenas a amostra sem MAP2c não formou um pellet (Figura 5).
A microscopia eletrônica de transmissão foi usada para confirmar a presença de filamentos de tubulina a partir de experimentos de copolimerização. Suspensões de tubulina purificada precipitadas com MAP2c foram preparadas para microscopia eletrônica de transmissão usando coloração negativa. As amostras foram adsorvidas em grades de cobre revestidas com Formvar e estabilizadas com carbono. As grades foram então coradas negativamente com 2% NH4MoO4 e examinadas sob um microscópio eletrônico com ampliação de 18.000x e uma tensão de aceleração de 80 kV. A presença de microtúbulos homogêneos com estrutura filamentosa clara e tamanho adequado mostrou a capacidade de formar microtúbulos em conformação nativa (Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig01.jpg"> Figura 1: Um diagrama esquemático de separação e purificação da tubulina. O número entre parênteses refere-se à etapa do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig02.jpg"> Figura 2: Separação e purificação da tubulina. (A) A análise SDS-PAGE de amostras coletadas durante a separação da tubulina utilizando polimerização acionada por temperatura (3 μL por linha). A diminuição das impurezas com um aumento estável na abundância relativa de tubulina (aproximadamente 50 kDa) é visível. Os números acima de cada linha correspondem ao número da etapa no protocolo. (B) A análise SDS-PAGE de frações obtidas após cromatografia de proteínas em resina de fosfocelulose (4 μL por linha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig03.jpg"> Figura 3: Concentração de proteína. A série de diluições de albumina sérica bovina de até 1 mg/mL em tampão PEM ou PBS foi comparada com séries de diluição BSA contendo 0,1 ATP, 1 mM GTP, 1 mM DTT separadamente ou em combinação (0,1 mM ATP, 1 mM GTP e 1 mM DTT) no tampão PEM ou PBS. (A) Quando o ensaio BCA foi usado, houve uma mudança significativa no fundo das amostras contendo DTT (símbolos sólidos). (B) Este efeito não foi detectado quando as concentrações foram medidas no ensaio de Bradford. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig04.jpg"> Figura 4: Ensaio de automontagem da tubulina. A análise SDS-PAGE do ensaio de automontagem confirmou a capacidade da tubulina armazenada incubada a (A) 4 °C ou (B) 37 °C para polimerizar de maneira dependente da temperatura em um amplo espectro de concentrações. (P - pellet, S - sobrenadante; a respectiva concentração de tubulina é indicada acima de cada par de linhas; a quantidade de cada amostra carregada foi de 10 μg). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig05.jpg"> Figura 5: Ensaio de co-sedimentação de tubulina. A análise SDS-PAGE da montagem da tubulina assistida por MAP2c confirmou a capacidade da tubulina armazenada de sofrer polimerização impulsionada pela interação com a proteína associada aos microtúbulos de maneira dependente da concentração. A concentração molar de MAP2c é indicada acima de cada linha. (P - pellet, S - sobrenadante). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig06.jpg"> Figura 6: Microscopia eletrônica de transmissão. As microfotografias TEM mostraram que a tubulina se reúne (A) em microtúbulos de diâmetro apropriado (B) consistindo de filamentos de tubulina homogêneos decorados com proteínas MAP2c. A barra corresponde a 1000 nm (A) e 200 nm (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Otimizando o rendimento da tubulina do tecido cerebral suíno

Neural tissue from any source is an excellent material for tubulin isolation, as the dendrites and axons of neurons are rich in microtubules. Here, we ...

optimizing-tubulin-yield-from-porcine-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

O vídeo demonstra o isolamento de células mononucleares do sangue periférico que se infiltram em tumores a partir de um cérebro de camundongo usando dissociação mecânica e digestão enzimática. Isso é seguido pela centrifugação do gradiente de densidade para coletar as células imunes para análise posterior.

Isolando células imunes infiltrantes de tumor de um cérebro murino

Este vídeo demonstra o isolamento dos capilares de cérebros suínos frescos. O processo envolve a remoção das meninges, isolando a substância cinzenta do tecido cerebral, homogeneizando e filtrando a substância cinzenta para isolar os capilares e, finalmente, usando a digestão enzimática para purificar ainda mais os capilares.

Purificando capilares de um cérebro suíno

Este vídeo demonstra o processo de isolamento de microvasos cerebrais de ratos sacrificados. Inclui a dissecção do cérebro, limpeza do tecido e digestão mecânica, seguida de centrifugação repetida para isolar a fração pura dos microvasos.

Um método para o isolamento de unidades neurovasculares do cérebro de ratos

Embora a estrutura do ribossomo tenha sido extensivamente caracterizada, a organização dos polissomos ainda é pouco estudada. Para superar essa falta de conhecimento, apresentamos aqui um protocolo de preparação detalhado para imagens precisas de polissomos de mamíferos por microscopia de força atômica (AFM) em ar e líquido.

Olhando para Cérebro polissomos com Microscopia de Força Atômica

O objectivo do protocolo é apresentar um processo otimizado para o estabelecimento de um modelo barreira hemato - encefálica (BBB) em vitro baseado em células endoteliais cerebrais primários de suínos (pBECs). O modelo mostra grande reprodutibilidade, alta tensão e é apropriado para estudos de transporte e o tráfico intracelular de fármacos.

Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

Este protocolo é projetado para quantificar eficientemente a atividade do sistema de ubiquitina-proteasome (UPS) em diferentes compartimentos celulares do cérebro de roedores. Os usuários podem examinar o funcionamento da UPS em frações nucleares, citoplasmáticas e sinápticas no mesmo animal, reduzindo a quantidade de tempo e o número de animais necessários para realizar essas análises complexas.

Quantificando a ubiquitina subcelular-atividade de proteasome no cérebro de roedores

Apresentamos um protocolo para a extração de pericitos cerebrais murina. Baseado em uma extração pericyte orientada para enriquecimento livre de antibióticos, este protocolo é uma ferramenta valiosa para estudos in vitro que fornecem alta pureza e alto rendimento, diminuindo assim o número de animais experimentais usados.

Um método de alta saída para isolar pericites cerebrais do rato

Este protocolo descreve a purificação de tubulinas a partir de fontes de pequena/média escala, como células cultivadas ou cérebros de camundongos únicos, usando ciclos de polimerização e despomerização. A tubulina purificada é enriquecida em isótipos específicos ou tem modificações pós-transacionais específicas e pode ser usada em ensaios de reconstituição in vitro para estudar dinâmicas e interações de microtúbulos.

Purificação de Tubulin com Modificações Pós-Translacionais Controladas e Isótipos de Fontes Limitadas por Ciclos de Polimerização-Despolimerização

Relatamos um ensaio simples, eficiente e de alta produtividade baseado em espectroscopia de fluorescência para a quantificação de filamentos de actina em amostras biológicas ex vivo de tecidos cerebrais de roedores e seres humanos.

Um ensaio baseado em espectroscopia de fluorescência com eficiência temporal para avaliar o status de polimerização de actina em roedores e tecidos cerebrais humanos

Os microtúbulos, que são polímeros da tubulina, desempenham um papel crucial como componente do citoesqueleto em células eucarióticas e são conhecidos por sua instabilidade dinâmica. Este estudo desenvolveu um método de fracionamento de microtúbulos para separá-los em microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e tubulina livre para avaliar a estabilidade de microtúbulos em vários tecidos de camundongos.

Técnica quantitativa de fracionamento de microtúbulos para separar microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e tubulina livre em tecidos de camundongos

Relatamos uma técnica que permite imagens ao vivo da dinâmica dos microtúbulos em células de glioblastoma (GBM) invadindo um tecido cerebral de vertebrados. O acoplamento da injeção ortotópica de células GBM marcadas fluorescentemente em um cérebro transparente de peixe-zebra com imagens intravitais de alta resolução permite a medição da dinâmica do citoesqueleto durante a invasão do câncer in situ .

Imagem ao vivo da dinâmica dos microtúbulos em células de glioblastoma invadindo o cérebro do peixe-zebra

Aprenda a isolar tubulina com alta pureza a partir de tecido cerebral suíno usando centrifugação e microscopia eletrônica. Este método preserva a dinâmica natural da proteína para estudos de neurobiologia e desenvolvimento de fármacos.

Otimizando o rendimento da tubulina do tecido cerebral suíno

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