Name: Trombose Arterial Induzida por Cloreto Férrico e Coleta de Amostras para Análise de Microscopia Eletrônica 3D (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 3 min 57 s
Description: Aprenda a induzir trombose arterial com cloreto férrico e coletar amostras para microscopia eletrônica 3D. Este método reprodutível permite estudar o crescimento e a arquitetura do trombo em nível celular.

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Os autores agradecem aos membros do Whiteheart Laboratory por sua cuidadosa análise deste manuscrito. O trabalho foi apoiado por subsídios do NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 e HL150818), e um Prêmio de Mérito do Departamento de Assuntos de Veteranos para S.W.W., R01 HL 155519 para B.S., e concessão do programa intramuros NIBIB para R.D.L.

Todos os experimentos aqui discutidos foram revisados e aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade de Kentucky.
NOTA: Os instrumentos cirúrgicos estão listados na Figura 1 e na Tabela de Materiais. Foram utilizados camundongos C57BL/6J, com 8-10 semanas de idade, machos/fêmeas ou cepas geneticamente manipuladas (Knockout ou Knockin).
1. Lesão da artéria carótida induzida por FeCl3
<ol><li>Indução da anestesia em camundongos<ol><li>Pese o mouse.</li>
		<li>Anestesiar o camundongo injetando 0,2 g/kg de solução de tribromoetanol por via intraperitoneal (i.p.). Certifique-se de que a solução anestésica está à temperatura ambiente (RT) antes de injetá-la. Esta dose é suficiente para sedar o rato durante cerca de 1 h.</li>
		<li>Verifique o reflexo do dedo do pé apertando o dedo do pé 5 minutos após a injeção para se certificar de que o rato está sedado. Se o mouse não estiver sedado, ele puxará o dedo do pé para longe. Se isso acontecer, aguarde 5 min e verifique novamente.</li>
		<li>Se o rato ainda não estiver completamente sediado, administrar 1/4 da dose inicial e aguardar 5 minutos.</li>
		<li>Durante todo o procedimento, monitore periodicamente o plano anestésico do mouse através de uma pinça do dedo do pé. Além disso, a frequência respiratória e a temperatura corporal também podem ser monitoradas para manter a anestesia ideal.</li>
	</ol></li>
	<li>Imobilizar o mouse<ol><li>Coloque o mouse sobre a almofada de aquecimento (37 °C) em decúbito dorsal e use fita adesiva para imobilizar as extremidades.</li>
		<li>Use um fio cirúrgico (0,1 mm) para puxar suavemente os dentes anteriores superiores do mouse para estender a região cervical/cervical. Isso é importante para melhor visualização da área cirúrgica e estabilidade da sonda Doppler. O tamanho do fio não é importante, pois é usado apenas para puxar os dentes da frente do animal para estender o pescoço.</li>
	</ol></li>
	<li>Incisão<ol><li>Borrife a área cirúrgica com etanol 70% ou limpe-a com um lenço com álcool.</li>
		<li>Usando um cotonete, aplique uma pequena quantidade de creme depilatório na área cirúrgica. Aguarde 1-2 min e, em seguida, use uma toalha de papel molhada ou lenço de papel para remover o creme. NOTA: Este passo é importante para uma área cirúrgica limpa.</li>
		<li>Com tesoura e pinça (Figura 1B11,1B13), realizar uma incisão mediana desde a mandíbula até a fúrcula esternal. Retrair a pele para melhor visualização da área (Figura 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Exposição da artéria carótida<ol><li>Com pinça cirúrgica e micropinça dissecante, disseque a fáscia superficial sobreposta e a remova com foco na exposição da artéria carótida esquerda (Figura 1B12,1B13). Certifique-se de não usar tesoura nesta fase para evitar ferir outras vasculaturas nesta área.</li>
		<li>Remova o tecido extra ao redor da artéria carótida. Evitar a dissecção excessiva do tecido circundante, uma vez que esta área abriga o nervo vago e a artéria vertebral.</li>
		<li>Separar a artéria carótida do tecido circunjacente, dissecando-a com pinça cirúrgica e de sutura (Figura 1B12,1B15,2C). Certifique-se de não estender ou puxar a artéria para evitar qualquer lesão mecânica na artéria ou na vasculatura circundante.</li>
		<li>Colocar um pedaço de plástico sob a artéria para marcar o local da lesão (Figura 2D). Use uma folha de transparência colorida para facilitar a visualização no campo cirúrgico.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocação da sonda de fluxo<ol><li>Colocar a sonda de fluxo transônico Doppler em solução salina (NaCl 0,9% em dH2O) por cerca de 10 min antes da cirurgia. Insira a outra extremidade da sonda em um acessório no medidor de vazão para facilitar a leitura do fluxo. Conecte o medidor de vazão a um computador. OBS: Entre as cirurgias, a sonda de fluxo transônico com Doppler deve ser em soro fisiológico. Certifique-se de manter a sonda úmida e limpa durante todo o procedimento.</li>
		<li>Colocar a sonda de fluxo transônico com Doppler ultrassom ao redor da artéria a montante do plástico (Figura 2D). Certifique-se de que a região do suporte do vaso da sonda não esteja muito estendida (Figura 1C, seta vermelha). OBS: Se necessário, apoiar a sonda com compressas de gaze (Figura 1B1) para atingir uma altura adequada da sonda, facilitando a posição ideal de leitura.</li>
		<li>Se a área cirúrgica estiver seca neste ponto, adicione algumas gotas de soro fisiológico RT para manter a área úmida. Monitore a leitura da sonda de fluxo. A leitura ideal varia para cada animal e pode estar entre 0,6-1,2 mL/min. Se for menor ou não estável, altere a posição da sonda de fluxo para obter uma leitura ideal. NOTA: Certifique-se de que o pescoço do rato não está muito estendido e que a área cirúrgica está limpa.</li>
	</ol></li>
	<li>Registrar a linha de base do fluxo<ol><li>Depois de colocar a sonda, monitore o fluxo sanguíneo por 2 minutos para garantir que o fluxo seja constante. Em seguida, registre o fluxo por 2 min (Figura 3B) como linha de base. Para uma descrição detalhada do fluxômetro, consulte Subramaniam et al.17.</li>
		<li>Para registrar o fluxo sanguíneo, inicie o software WinDAQ. Clique na opção Arquivo e, em seguida, clique em Gravar. Crie uma nova pasta e arquivo e comece a gravar. Para interromper a gravação, clique em Parar na seção de arquivos. Observação : software WinDAQ está disponível gratuitamente do editor: https://www.dataq.com/products/windaq/.</li>
	</ol></li>
	<li>Lesão<ol><li>Pare a gravação do fluxo. Certifique-se de não alterar a posição da sonda para que as leituras permaneçam consistentes após a lesão.</li>
		<li>Seque bem a área com um toalha/toalha de papel. NOTA: Mesmo um pequeno volume de líquido residual pode alterar a concentração da solução de FeCl3 usada para infligir lesão vascular. Isso leva a resultados variáveis e afeta a reprodutibilidade. Quando a área está completamente seca, a sonda não é capaz de medir o fluxo.</li>
		<li>Em um barco de pesagem de plástico, coloque um papel de filtro circular (1 mm de diâmetro, cortado com um furo de orelha de 1 mm de diâmetro). Adicionar 1 μL de solução de FeCl3 a 6% (fabricada em dH2O) ao papel de filtro. NOTA: Certifique-se de adicionar a solução de FeCl3 imediatamente antes de usar o papel de filtro. Embeber o papel muito cedo pode levar à evaporação da solução de FeCl3 e alterar a gravidade da lesão.</li>
		<li>Com pinça fina, pegue o papel filtro e coloque-o na artéria a montante da sonda, na parte da artéria marcada pelo plástico (Figura 2D,E). Este plástico atua como um marcador e um espaçador. Ele marca a área lesionada e evita a diluição acidental do FeCl3, evitando o contato com a área úmida circundante. NOTA: Certifique-se de que o papel de filtro está reto, não beliscado ou dobrado de qualquer outra forma. Uma vez colocado na artéria, não altere a posição do papel de filtro; Isso altera a extensão da lesão.</li>
		<li>Depois de colocar o papel de filtro, ligue o temporizador e registre o fluxo sanguíneo. Após 3 min, retire o papel e adicione soro fisiológico no local da lesão para remover a FeCl3 e interromper o processo de lesão. Também torna a área úmida. Nessa fase, o fluxo sanguíneo deve retornar ao nível basal, conforme registrado pré-lesão.</li>
		<li>Monitore e registre o fluxo até que ele reduza para 10% da gravação original ou atinja zero. Há uma diminuição constante quando o trombo começa a se formar no local da lesão (Figura 3C). Observe quaisquer flutuações significativas no fluxo durante esse período.</li>
		<li>Para estudar a estabilidade do trombo, registre o rápido aumento do fluxo sanguíneo após cada diminuição significativa e consistente. Esses eventos são classificados como embolização por trombose instável (Figura 4D). Após a diminuição consistente do fluxo, o operador é capaz de ver a lesão na artéria ao final do experimento (Figura 2F, seta azul/oval pontilhada).</li>
		<li>O tempo de oclusão do vaso é definido como a cessação completa do fluxo sanguíneo por pelo menos 1 min. Registre o tempo em que um trombo oclusivo é formado, como mostrado pela leitura de zero ou diminuição significativa do fluxo.</li>
		<li>Finalizar o experimento aos 30 min. Se o trombo não se formar dentro de 30 minutos após o monitoramento, registre o fluxo, pare a gravação e remova a sonda.</li>
		<li>Limpe a sonda com etanol 70% e uma escova para remover qualquer tecido residual/cabelo ou detritos. Seque completamente a sonda antes de colocá-la na caixa de armazenamento. Seque completamente a sonda antes de colocá-la na caixa de armazenamento para armazenamento a longo prazo.</li>
		<li>Eutanásia do camundongo por luxação cervical. Coloque a carcaça no saco de descarte de carcaça, rotulado com o nome do laboratório e a data.</li>
	</ol></li>
</ol>
2. Coleta e preparação de amostras para estudos seriados de microscopia eletrônica de varredura facial (SBF-SEM) pós-lesão induzida por FeCl3
OBS: O protocolo de ME apresentado é apropriado para o preparo da amostra para o SBF-MEV. Esta técnica de imagem oferece uma capacidade sem precedentes de estudar a estrutura tridimensional das plaquetas em um coágulo. Com essa técnica, a amostra é visualizada como uma série de imagens sequenciais de MEV em bloco, geradas à medida que se avança pela amostra. Os pontos-chave para essa preparação são: 1) a amostra deve ser corada com metais pesados pré-embutindo; e 2) a amostra embutida em plástico deve ser aparada adequadamente para montagem dentro do MEV (ver Figura 6 para uma visão das amostras aparadas). A coloração pós-incorporação não é possível dentro da MEV. Ao coletar uma amostra de uma lesão de vaso induzida por FeCl3 para análise de EM, as seguintes alterações precisam ser feitas durante a realização da cirurgia. As modificações no protocolo cirúrgico de FeCl3 apresentadas também são aplicáveis a qualquer forma de microscopia eletrônica. As condições anestésicas e os passos para incisão e exposição da artéria carótida são os mesmos do Protocolo 1.
<ol><li>Após a exposição da artéria carótida, marcar o local da lesão circundando frouxamente a região entre dois fios cirúrgicos (tamanho: 0,1 mm) (Figura 5A,B).</li>
	<li>Colocar a sonda sob a artéria, distal ao fio inferior (Figura 5C).</li>
	<li>Inserir a peça plástica sob a artéria entre os dois fios para marcar o local da lesão da FeCl3 (Figura 5C).</li>
	<li>Realizar medições de fluxo antes de realizar a lesão para observar o fluxo basal. Essas medidas são usadas para decidir em qual estágio a amostra será coletada. OBS: Certifique-se de que o fixador (paraformaldeído a 3%/PFA + glutaraldeído a 0,1%, ambos fabricados em 1x PBS) esteja pronto e em RT. Alternativamente, a fixação com glutaraldeído a 2,5% em fundo salino também pode ser usada. CUIDADO: Tanto o paraformaldeído quanto o glutaraldeído são altamente tóxicos e irritantes. Ao manuseá-los, luvas, protetor ocular e máscaras devem ser usados para proteger da exposição. Todas as soluções fixadoras são tóxicas, e as etapas de fixação devem ser realizadas em uma capela de fumaça.</li>
	<li>Realizar a lesão colocando papel de filtro embebido em FeCl 3 na artéria (8% FeCl 3 é usado) por3 min (esse tempo também pode variar). Após 3 min, remova o papel filtro e adicione soro fisiológico no local da lesão para remover qualquer excesso de FeClresidual 3. Essa etapa é necessária para evitar a extensão variável da lesão e facilitar a contagem do fluxo pela sonda (Figura 5D).</li>
	<li>Monitore a leitura do fluxo. Quando o fluxo cair abaixo de 50% do valor inicial, remova a sonda. Seque rapidamente a área e adicione o fixador na área para fixar externamente a área da lesão.</li>
	<li>Segurar prontamente a artéria próxima à área da lesão com pinça e cortar a jusante do fio inferior e a montante do fio superior. Se necessário, peça a outra pessoa que ajude a cortar uma das extremidades. Coloque o tecido na placa de cultura de tecido plástico na mesma orientação em que foi coletado e adicione algumas gotas do fixador. NOTA: Cortar a artéria causa sangramento extenso imediato, por isso certifique-se de segurar a artéria antes de cortá-la pela primeira vez. Nesse cenário, o mouse é exanguinado. O camundongo é eutanasiado por exsanguinação e luxação cervical.</li>
	<li>Usando um bisturi, limpe o tecido extra ao redor da artéria. Esteja atento para registrar a orientação do fluxo sanguíneo. Para marcá-lo, corte uma extremidade horizontalmente e a outra afilando/oblíqua (Figura 5E).</li>
	<li>Manter a amostra em fixador (PFA 3% e glutaraldeído 0,1%) por 1 h no TR. Em seguida, armazenar a amostra em PFA a 1% a 4 °C até enviá-la em gelo úmido para o laboratório de processamento de amostras para análise de EM. NOTA: As amostras não devem ser congeladas. Os desafios para esse método de coleta de amostras são:<ol><li>A leitura inicial pode não ser ótima ou flutuar após a lesão. Isso pode afetar a extensão da lesão escolhida para a análise de EM. Para resolver esse problema, certifique-se de registrar a leitura da linha de base por alguns minutos, depois de tentar várias posições de colocação da sonda para decidir qual posição é a ideal.</li>
		<li>O tempo para deter a lesão adicionando fixador externo e corte real do corte arterial para análise pode adicionar variabilidade à extensão da trombose. Seja rápido durante a coleta de amostras após a fixação externa.</li>
	</ol></li>
	<li>Receber as amostras para processamento para análise de EM em PFA 1% sobre gelo úmido. Enxaguar as amostras por 3 min, em gelo, com tampão cacodilato 0,1 M para iniciar o processamento posterior.</li>
	<li>Fixar as amostras por 1 h em gelo em tampão cacodilato 0,1 M + glutaraldeído 2,5% + CaCl2 mM.</li>
	<li>Descarte o fixador e lave as amostras com tampão cacodilato de sódio 0,1 M frio contendo CaCl2 2 mM (5 x 3 min) (Figura 6A).</li>
	<li>Fixar as amostras com solução de ósmio (ferrocianeto de potássio a 3% [K 4C 6 N6Fe] + tampão cacodilato 0,3 M + CaCl 2 4 mM misturado com um volume igual de tetróxido de ósmio aquoso a 4% [OsO4; em ddH2 O]) durante 1 h nogelo.</li>
	<li>Enquanto as amostras estão fixando, fazer solução fresca de hidrato de tricloroacetaldeído (TCH) a 1% em ddH2O. Incubar a solução a 60 °C por 1 h enquanto mistura suavemente.</li>
	<li>Após a fixação, lavar as amostras com ddH2O em TR por 5 x 3 min.</li>
	<li>Incubar as amostras em solução filtrada de TCH a 1% (fabricada em ddH2O) durante 20 min em RT.</li>
	<li>Lavar as amostras com ddH2O em TR (5 x 3 min).</li>
	<li>Fixar as amostras em tetróxido de ósmio a 2% em ddH2O durante 30 min em RT.</li>
	<li>Lavar as amostras com ddH2O em RT por 5 x 3 min cada.</li>
	<li>Colocar as amostras em acetato de uranilo a 1% (aquoso) e incubar durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Lave as amostras com ddH2O em RT por 5 x 3 min cada, e processe-as com coloração de aspartato de chumbo de Walton em bloco .</li>
	<li>Em bloco Coloração de aspartato de chumbo de Walton3:<ol><li>Fazer 30 mM solução de ácido L-aspártico em ddH2O. NOTA: O ácido aspártico dissolve-se mais rapidamente se o pH for elevado para 3,8. Esta solução de estoque é estável por 1-2 meses se refrigerada.</li>
		<li>Completar solução de nitrato de chumbo 20 mM em 10 mL de estoque de ácido aspártico e ajustar o pH para 5,5 com 1 N KOH.</li>
		<li>Colocar as amostras em solução de aspartato de chumbo a 60 °C durante 30 minutos, após cinco lavagens com ddH2O à RT, cada uma durante 3 minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>Desidratar os espécimes com uma série graduada de etanol. Utilizar a desidratação química pelo protocolo de Valdivia18.<ol><li>Lavar as amostras em cada uma das seguintes soluções para desidratar progressivamente a amostra (figura 6B): Álcool etílico a 25% por 3 min Álcool etílico 50% por 3 min álcool etílico 75% por 3 min Álcool etílico 95% por 3 min Álcool etílico 100% por 10 min, e repita o passo duas vezes (total de três lavagens).</li>
	</ol></li>
	<li>Lavar as amostras em óxido de propileno (PO) a 100% durante 10 minutos e repetir o passo duas vezes (total de três lavagens).</li>
	<li>Incubar em 50%/50% PO/resina com ativador DMP 30 durante a noite em RT e incorporar em 100% Araldite 502/embed 812/DDSA com ativador DMP30 por 48 h.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse relacionados a este estudo.
Perfis ORCID: S.J.: 0000-0001-6925-2116; S.W.W.: 00000-0001-5577-0473.

A aplicação tópica de FeCl3 na vasculatura para induzir trombose é uma técnica amplamente utilizada e tem sido fundamental no estabelecimento de papéis para vários receptores plaquetários, vias de sinalização de ligantes e seus inibidores20,21,22,23. O mecanismo pelo qual a FeCl3 causa trombose é multifacetado; Anteriormente, o desnudamento endotelial era considerado causa...

A trombose é a formação de um coágulo sanguíneo que bloqueia parcial ou completamente um vaso sanguíneo, impedindo o fluxo natural do sangue. Isso leva a eventos cardiovasculares graves e fatais, como doença cardíaca isquêmica e acidentes vasculares cerebrais. As doenças cardiovasculares são a principal causa de morbidade e mortalidade, sendo responsáveis por uma em cada quatro mortes nomundo1,2,3. Embora a trombose se manifeste como um mau funcionamento do sistema vascular, pode ser resultado de uma infecção microbiana ou viral subjacente, distúrbio imunológico, malignidade ou condição metabólica. O fluxo sanguíneo é mantido pela complexa interação entre diversos componentes do sistema vascular, incluindo células endoteliais, hemácias/leucócitos, plaquetas e fatores de coagulação4. Na lesão vascular, as plaquetas interagem com proteínas adesivas na matriz subendotelial e liberam seu conteúdo granular, que recruta mais plaquetas5. Concomitantemente, a cascata de coagulação é ativada, levando à formação e deposição de fibrina. Em última análise, forma-se um coágulo contendo plaquetas e hemácias aprisionadas dentro de uma tela de fibrina6. Embora drogas antiplaquetárias e anticoagulantes estejam disponíveis para modular a trombose, o sangramento espúrio continua sendo uma grande preocupação com essas terapias, exigindo ajuste fino das dosagens e combinações dessas drogas. Assim, ainda é urgente a descoberta de novas drogas antitrombóticas7.
A trombose é estudada usando vários métodos para infligir lesão vascular: mecânica (ligadura do vaso), térmica (lesão a laser) e lesão química (aplicação de FeCl3/Rosa Bengala). A natureza da trombose varia dependendo da localização (arterial vs. venosa), método ou extensão da lesão. Dentre todos esses tipos, a lesão vascular induzida por FeCl3 é o método mais utilizado. Tem sido empregada em camundongos, ratos, coelhos, cobaias e cães 8,9,10,11,12. O método é relativamente simples, fácil de usar e, se os principais parâmetros forem padronizados, é sensível e reprodutível em vários sistemas vasculares (por exemplo, artérias [carótida e femoral], veias [jugular] e arteríolas [cremaster e mesentérica]) (Tabela Suplementar 1).
Este modelo também pode ser usado para aprofundar nossa compreensão da mecânica e morfologia da formação de coágulos. Esta técnica oferece exclusivamente a vantagem de parar a trombose em vários pontos de fluxo, para estudar os estágios intermediários do processo antes que ele se torne oclusivo. Avanços recentes na pesquisa da trombose têm utilizado esse modelo para focar a atenção em métodos não farmacológicos detrombólise13 ou na liberação não invasiva de agentes antitrombóticos e/ou fibrinolíticos14,15. Vários grupos têm demonstrado que, quando as membranas plaquetárias são revestidas com essas terapêuticas, os fármacos podem ser ativados por estimulação térmica para atingir coágulos16. As técnicas aqui descritas podem ser úteis para estudos como a validação de seus achados em nível plaquetário único. Neste manuscrito, o Protocolo 1 descreve o procedimento básico de lesão vascular mediada por FeCl3, enquanto o Protocolo 2 descreve o método de coleta e correção da amostra de lesão vascular para posterior análise por microscopia eletrônica.

<table><tbody><tr><td>0,9% de solução salina</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP358-212</td><td>NaCl usado para fazer uma solução de solução salina a 0,9%&nbsp;</td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson e Companhia&nbsp;</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>190 Prova de Etanol&nbsp;</td><td>KOPTEC</td><td>V1101&nbsp;</td><td>Usado para fazer uma solução de etanol a 70% para preparar o camundongo para a cirurgia&nbsp;</td></tr><tr><td>2,2,2 Tribromoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48402</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de Seda Trançada Preta de 25 Jardas (5-0)</td><td>DEKNATEL</td><td>136082-1204</td><td></td></tr><tr><td>Agulha 26G x 3/8&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson e Companhia&nbsp;</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>2-metil-2-butanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>240486</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência de 7,5 mL, graduada para 3 mL</td><td>Globe Scientific Inc.</td><td>135010</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de Preparação de Álcool (70% Álcool Isopropílico)</td><td>Medline</td><td>MDS090735</td><td></td></tr><tr><td>Araldite GY 502&nbsp;</td><td>Serviços de microscopia eletrônica&nbsp;</td><td>10900</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Células 35mm X 10mm&nbsp;</td><td>Corning Incorporated&nbsp;</td><td></td><td></td>430165</tr><tr><td>Balança Compacta&nbsp;</td><td>Ciência de Ward&nbsp;</td><td>470314-390</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Dissecação, 12,5 cm de comprimento</td><td>Instrumento de Precisão Mundial</td><td>15922-G</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30 ativador&nbsp;</td><td>Serviços de microscopia eletrônica&nbsp;</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>Dodenil Succínico Anidrido / DDSA Serviços de</td><td>Microscopia Eletrônica&nbsp;</td><td>13700</td><td></td></tr><tr><td>Sacos de cocô para cães/saco de descarte de carcaça de animal</td><td>Crown Products&nbsp;</td><td>PP-RB-200</td><td></td></tr><tr><td>Doppler FlowProbe</td><td>Transonic Systems Inc.</td><td>MA0.5PSB</td><td></td></tr><tr><td>EMBED 812 resina&nbsp;</td><td>Serviços de microscopia eletrônica&nbsp;</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Álcool Etílico, anidro 200 provas&nbsp;</td><td>Serviços de microscopia eletrônica&nbsp;</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de Curativo para Olhos, 4" Curvada Completa, Padrão, Pontas de 0.8mm de Largura</td><td>Integra Miltex</td><td>18-784</td><td></td></tr><tr><td>Papel de Filtro&nbsp;</td><td>VWR</td><td>28310-106</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Fina - Ferramentas de</td><td>Ciência Fina Afiadas e Sem Corte&nbsp;</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Punções de Orelha com Alça de Dedo&nbsp;</td><td>Ferramentas de Belas Ciências&nbsp;</td><td>24212-01</td><td></td></tr><tr><td>Esponjas de Gaze 2" x 2" - 12 Camadas&nbsp;</td><td>Dukal Corporation</td><td>2128</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído (solução a 10%)Serviços de</td> <td>microscopia eletrônica&nbsp;</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Integra Miltex Lâmina Cirúrgica de Aço Carbono #10</td><td>Integra&reg; Miltex&reg;</td><td>4110</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Ferro (III)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>157740-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de Faca Miltex&reg; Aço Inoxidável Extra Fino Tamanho 3</td><td>Integra Lifesciences&nbsp;</td><td>157510</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-aspártico</td><td>Sigma&nbsp; Fisher</td><td> A93100</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-aspártico</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP374-100</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de Chumbo&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Microscópio L-62</td><td></td></tr><tr><td>LEICA S8AP0</td><td></td><td>LEICA Não está mais disponível</td><td>Não está mais disponível na empresa Suporte para</td></tr><tr><td>Microscópio LEICA S8AP0</td><td>LEICA</td><td>10447255</td><td>Não está mais disponível na empresa</td></tr><tr><td>Limpadores de lenços de papel leves&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82003-822</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Micro Dissecante; 1x2 Dentes, Curva Completa; Largura da Ponta de 0,8 mm; Comprimento de 4"</td><td>Roboz Surgical Instrument Company</td><td>RS-5157</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de Ósmio 4% solução aquosa&nbsp;</td><td>Serviços de microscopia eletrônica&nbsp;</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (solução a 16%)</td><td>Serviços de microscopia eletrônica&nbsp;</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Ferricianeto de potássio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de propileno, reagente ACS&nbsp;</td><td>Serviços de microscopia eletrônica&nbsp;</td><td>Pipeta Clássica Rainin 20401</td><td></td></tr><tr><td>PR-10 Medidor de</td> Vazão <td>Rainin</td><td>17008649</td><td></td></tr><tr><td>Research&nbsp;</td><td>Sistemas Transônicos Inc.</td><td>T402B01481</td><td>Modelo: T402</td></tr><tr><td>Fita Invisível Mágica Escocesa, 3/4" x 1000",</td><td>Scotch Transparente&nbsp;</td><td></td><td></td>305289</tr><tr><td>Almofada Aquecida para Pequenos Animais</td><td>K& H Fabricação Inc.</td><td>Modelo: HM10</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Cacodilato de Sódio 0.2M, pH7.4</td><td>Serviços de Microscopia Eletrônica&nbsp;</td><td>11623</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores Estéreis com Ponta de Algodão&nbsp;</td><td>Produtos Médicos Puritanos</td><td>25-806 1WC</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador Steromaster&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-562-21</td><td>Não está mais disponível na empresa</td></tr><tr><td>Surgical Dumont #7 Forceps&nbsp;</td><td>Ferramentas de Belas Ciências&nbsp;</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>Tiocarbohidrazida (TCH)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>88535</td><td></td></tr><tr><td>Recargas de Ponta de Pipeta de Baixa Retenção Universal (0.1-10 &micro; L)</td><td>VWR</td><td>76323-394</td><td></td></tr><tr>Serviços de microscopia eletrônica<td>de acetato de uranila</td><td>&nbsp;</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Veet Gel Creme Removedor de Pelos</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>3116875</td><td></td></tr><tr><td>Branco Antiestático Hexagonal Pesagem Barcos, Médio, 64 x 15 x 19 mm</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Software S38975</td><td></td></tr><tr><td>WinDAQ/100 para Windows</td><td>DATAQ Instruments, Inc.</td><td>Versão 3.38</td><td>Disponível gratuitamente para download. https://www.dataq.com/products/windaq/</td></tr> <tr><td>ZEISS AxioCam Icc 1</td><td>ZEISS</td><td>57615</td><td></td></tr></tbody></table>

trombose arterial induzida por cloreto férrico e coleta de amostras para análise de microscopia eletrônica 3d

Ferric Chloride-Induced Arterial Thrombosis and Sample Collection for 3D Electron Microscopy Analysis

As doenças cardiovasculares são uma das principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. A trombose aberrante é uma característica comum de condições sistêmicas, como diabetes e obesidade, e de doenças inflamatórias crônicas, como aterosclerose, câncer e doenças autoimunes. Na lesão vascular, geralmente o sistema de coagulação, as plaquetas e o endotélio atuam de forma orquestrada para evitar o sangramento, formando um coágulo no local da lesão. Anormalidades nesse processo levam a sangramento excessivo ou trombose descontrolada/atividade antitrombótica insuficiente, o que se traduz em oclusão do vaso e suas sequelas. O modelo de lesão carotídea induzida por FeCl3 é uma ferramenta valiosa para investigar como a trombose se inicia e progride in vivo. Esse modelo envolve dano endotelial/desnudamento e subsequente formação de coágulos no local lesado. Ele fornece um ensaio quantitativo altamente sensível para monitorar o dano vascular e a formação de coágulos em resposta a diferentes graus de dano vascular. Uma vez otimizada, esta técnica padrão pode ser usada para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à trombose, bem como as alterações ultraestruturais nas plaquetas em um trombo crescente. Este ensaio também é útil para estudar a eficácia de agentes antitrombóticos e antiplaquetários. Este artigo explica como iniciar e monitorar a trombose arterial induzida por FeCl3 e como coletar amostras para análise por microscopia eletrônica.

Os dados são geralmente apresentados como tempo para a oclusão, ou tempo necessário para formar um trombo totalmente oclusivo. Esses dados podem ser plotados como uma curva de sobrevida de Kaplan-Meier (Figura 4A)19, um gráfico de pontos com barras mostrando o fluxo sanguíneo terminal no momento da cessação do fluxo sanguíneo ou do término de um experimento (Figura 4B), ou como um gráfico de linhas (Figura 4C).</stron...

O presente protocolo descreve como usar uma lesão mediada por FeCl3 para induzir trombose arterial e como coletar e preparar amostras de lesão arterial em vários estágios da trombose para análise por microscopia eletrônica.

Trombose Arterial Induzida por Cloreto Férrico e Coleta de Amostras para Análise de Microscopia Eletrônica 3D

Cardiovascular diseases are a leading cause of mortality and morbidity worldwide. Aberrant thrombosis is a common feature of systemic conditions like ...

Com esse método, pode-se determinar quais componentes das plaquetas e do sistema hemostático são importantes para a trombose. Além disso, esse método pode determinar como o crescimento e a arquitetura do trombo são afetados em nível celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite uma maneira reprodutível de estudar vários estágios da trombose em nível estrutural.Uma pessoa nova nesta técnica deve evitar o manuseio excessivo do tecido na área cirúrgica. Isso pode levar a sangramento e pode complicar demais a identificação da artéria carótida. Comece a marcar o local da lesão após expor a artéria carótida, circundando vagamente a região entre dois fios cirúrgicos de tamanho 0,1 milímetro.Coloque a sonda sob a artéria distal do fio inferior. Insira a peça plástica sob a artéria entre os dois fios para marcar o local da lesão de cloreto de ferro. Realizar medições de fluxo antes de realizar a lesão para observar o fluxo basal.Realizar a lesão colocando papel de filtro embebido em cloreto de ferro na artéria por três minutos. Remova o papel de filtro após três minutos para evitar a extensão variável da lesão e facilitar a contagem de fluxo pela sonda. Adicione soro fisiológico no local da lesão para remover qualquer excesso de cloreto de ferro residual.Monitore a leitura do fluxo. Quando o fluxo cair abaixo de 50% do valor inicial, remova o teste. Seque rapidamente a área e adicione o fixador para fixar a área da lesão externamente.Em seguida, segure prontamente a artéria próxima à área da lesão com pinças. Corte a jusante da rosca inferior e a montante da linha superior. Coloque o tecido na placa de cultura de tecido plástico na mesma orientação em que foi coletado e adicione algumas gotas do fixador.Usando um bisturi, limpe o tecido extra ao redor da artéria. Certifique-se de registrar a orientação do fluxo sanguíneo cortando uma extremidade horizontalmente e a outra afunilando ou oblíqua. Colocar a amostra no fixador durante uma hora à temperatura ambiente e, em seguida, armazenar a amostra em paraformaldeído a 1% a 4 graus Celsius até a enviar para gelo húmido para análise por microscopia electrónica.Os dados foram plotados como uma curva de sobrevida de Kaplan-Meier, um gráfico de pontos com barras mostrando o fluxo sanguíneo terminal no momento da cessação do fluxo sanguíneo ou do término de um experimento, ou como um gráfico de linhas. O fluxo sanguíneo aumentou subitamente em alguns casos após uma diminuição gradual por alguns minutos, indicando excreção parcial do trombo em crescimento, e foi considerado um evento de embolização. A morfologia do trombo oclusivo também foi estudada por este método.A pronta coleta da amostra durante o processo de trombose é o passo mais importante, uma vez que a demora nesse processo pode levar a interpretações errôneas de nossa análise estrutural.

ferric-chloride-induced-arterial-thrombosis-sample-collection-for-3d

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JoVE Journal

Medicine

Medicina

O modelo de trombose induzida por FeCl3 em camundongos é descrito aqui. Um método para monitorar o crescimento do trombo por observação de microscopia intravital em um vaso mesentérico e por medição do fluxo sanguíneo na artéria carótida é apresentado.

Férrico Thrombosis Modelo rato na artéria carótida e Mesentery Vessel induzida por Chloride

Nossos objetivos foram para projetar, fabricar e testar stents ferromagnéticos para a captura de células endoteliais. Dez stents foram testados quanto à fractura e mais 10 stents foram testados para o magnetismo retida. Finalmente, 10 stents foram testados in vitro e 8 mais stents foram implantados em 4 porcos para mostrar a captura e retenção celular.

Ferromagnético Bare Metal Stent para captura de células endoteliais e Retenção

Este protocolo descreve a aplicação de tomografia combinada fluorescente no infravermelho próximo (NIRF) e imagiologia de micro-computadorizada (microCT) para visualizar tromboêmbolos cerebral. Esta técnica permite a quantificação da carga de trombo e evolução. A técnica de imagem NIRF visualiza fluorescente etiquetado trombo no cérebro extirpado, enquanto que a técnica microCT visualiza trombo no interior de animais vivos usando ouro-nanopartículas.

Combinada Near-infrared imagens fluorescentes e tomografia Micro-computado para Diretamente Visualizando Cerebral tromboêmbolos

Nós relatamos um procedimento refinada do cloreto férrico (FeCl3) modelos de trombose induzidas na carótida e mesentérica artéria, bem como veia, caracterizado de forma eficiente através de microscopia intravital para monitorar tempo para oclusiva formação de trombos.

Férricos induzida pelo cloreto modelos murinos Trombose

Aqui, apresentamos as modificações necessárias para um bem caracterizado e comumente usado pequenos induzida por cloreto férrico (FeCl3) artéria carótida lesão modelo animal para uso em um modelo de grandes animais de lesão vascular. O modelo resultante pode ser utilizado para avaliação experimental pré-clínicos profilática e trombolítica intervenções farmacológicas e mecânica.

Trombose da artéria carótida canino induzida por cloreto férrico: Um modelo Animal grande de lesão Vascular

Aqui apresentados são dois métodos que podem ser usados individualmente ou em combinação para analisar o efeito da beta-amiloide na estrutura do coágulo de fibrina. Incluído é um protocolo para criar um em vitro coágulo de fibrina, seguido pelo coágulo turbidez e microscopia eletrônica métodos.

Análise de β-amiloide-induzida de anormalidades na estrutura do coágulo de fibrina por espectroscopia e microscopia eletrônica

Este estudo descreve um método rápido e eficaz para a análise de componentes celulares de coágulos sanguíneos cerebrais através da dissolução de coágulos, coloração celular e exame de sangue de rotina.

Uma abordagem abrangente para analisar os componentes celulares de coágulos sanguíneos cerebrais

Um procedimento de punção para formação de trombo hemostático é apresentado aqui. Os trombos formados são grandes e têm centenas de mícrons de diâmetro. Portanto, as abordagens de imagem de volume são apropriadas. Sugerimos microscopia eletrônica de transmissão de área ampla montada como uma abordagem de alta resolução disponível para muitos e detalhamos um protocolo preparativo.

Hemostasia de Ferida por Punção e Preparação de Amostras para Análise de Microscopia Eletrônica de Área Larga Montada

Este estudo apresenta um protocolo para estabelecer um modelo reprodutível e minimamente invasivo em rato da trombose do seio sagital superior induzida por cloreto férrico, utilizando um método de sutura de seda em combinação com imagem de contraste de manchas a laser e ultrassom de alta resolução para avaliação.

Estabelecimento de uma trombose do seio sagital superior induzida por cloreto férrico modificado

Descrevemos procedimentos para quantificar e caracterizar lesões ateroscleróticas em modelos de camundongos usando secção de precisão do seio aórtico e da aorta ascendente combinada com análise histoquímica e imuno-histoquímica.

Análise quantitativa e caracterização das lesões ateroscleróticas no seio aórtico murino

Aprenda a induzir trombose arterial com cloreto férrico e coletar amostras para microscopia eletrônica 3D. Este método reprodutível permite estudar o crescimento e a arquitetura do trombo em nível celular.

Trombose Arterial Induzida por Cloreto Férrico e Coleta de Amostras para Análise de Microscopia Eletrônica 3D

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