Geração de Organoides Hepáticos Endodérmicos Funcionais

Nossa pesquisa visa desenvolver modelos hepáticos in vitro relevantes para humanos para testes de eficácia e segurança de medicamentos, imitando de perto tecidos hepáticos saudáveis e doentes em estudos pré-clínicos. Reproduzir a complexidade total do fígado, alcançar funcionalidade de longo prazo, padronizar protocolos e dimensionar a produção de organoides para aplicações de alto rendimento continuam sendo um grande desafio experimental na pesquisa de organoides. Recentemente, modelamos a fibrose hepática a partir de organoides hepáticos saudáveis e estabelecemos modelos de doenças hepáticas raras, incluindo citrulinemia e deficiência de piruvato carboxilase, de células derivadas de pacientes. Ao contrário de outros métodos, nosso protocolo eHEPO fornece organoides hepáticos funcionais rapidamente e em escala, suportando funcionalidade de longo prazo e vários ensaios de uma população inicial consistente.

[Narrador] Para começar, adicione 6 mililitros de DMEM/F-12 frio em um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione imediatamente 80 microlitros de matriz de membrana basal FOD ou BMM ao tubo e misture bem. Cubra uma placa de poço tratada com cultura de tecidos com a solução BMM e dispense a solução para cobrir a superfície da placa do poço. Incubar a placa numa incubadora a 37° Celsius durante pelo menos uma hora. Pegue uma célula-tronco pluripotente induzível ou placa IPSC e aspire o meio específico para IPSC. Enxágue a placa com DMEM / F-12 ou DPBS e adicione 1 mililitro da enzima específica a um poço de uma placa de 6 poços. Após incubação por um minuto, aspirar a enzima e incubar a placa a 37° Celsius por cinco a sete minutos. Em seguida, adicione 1 mililitro de meio IPSC pré-aquecido à placa e bata suavemente na lateral para separar os agregados de colônias indiferenciadas da superfície da placa. Misture suavemente a suspensão com uma pipeta sorológica de 5 mililitros e, em seguida, semeie a suspensão celular na densidade desejada no poço revestido com BMM. Incubar as células a 37° Celsius por três a cinco dias para atingir uma confluência de 70%. Substitua o meio IPSC pelo meio endoderme antes de iniciar a diferenciação. As células ganham uma forma pontiaguda após a diferenciação, indicando a interação célula-célula. Enxágue as células endodérmicas com PBS. Adicione 300 microlitros de tripsina. E incube as células por cinco minutos na incubadora. Adicione 3 mililitros de DMEM/F-12 frio às células e pipete com pontas de filtro de 1.000 microlitros para gerar células individuais. Recolher a suspensão de células num tubo cónico de 15 mililitros e centrifugar as células a 300 x g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Depois de descartar o sobrenadante, lave o pellet com 10 mililitros de tampão FACS. Para fazer uma suspensão de célula única, filtre as células com um filtro de malha de 100 micrômetros e, em seguida, com um filtro de malha de 40 micrômetros antes de centrifugar a suspensão celular por cinco minutos. Ressuspenda 15 milhões de células com 105 microlitros de tampão FACS e adicione 45 microlitros de FcR e 15 microlitros de EpCAM à suspensão. Incube as células por 10 minutos a 4° Celsius, protegendo o tubo da luz. Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão FACS para lavar a suspensão da célula. Depois de centrifugar as células, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão FACS e adicione 0,5 micromolar por mililitro DAPI à suspensão celular para quantificar as células mortas. Após a triagem das células, centrifugar as células a 300 x g durante cinco minutos. Remova o sobrenadante. E ressuspender 3.000 a 5.000 células em 20 microlitros de BMM. Semeie as células adicionando uma gota de BMM ao centro de cada placa de 48 poços e incube as células por dois minutos a 37 ° Celsius até que o BMM esteja solidificado. Cubra a gota com o meio de expansão. Para dividir a gota organoide, descarte o meio organoide e adicione 500 microlitros de Ad-DMEM/F-12 frio ao poço. Use pontas de filtro de 1.000 microlitros para pipetar vigorosamente as gotículas de BMM. Colete no máximo 10 gotículas de BMM em tubos cônicos de 15 mililitros e adicione 5 mililitros de Ad-DMEM/F-12 frio. Coloque o tubo no gelo por três a cinco minutos. Centrifugar as células a 200 x g durante cinco minutos a 4° Celsius e rejeitar o sobrenadante até restar 1 mililitro do sobrenadante. Pipetar vigorosamente o pellet celular 30 a 40 vezes utilizando pontas de filtro de 200 microlitros. Após dissociação mecânica, adicione 5 mililitros de Ad-DMEM/F-12 frio antes de centrifugar as células por cinco minutos. Descarte o sobrenadante. E coloque a suspensão no gelo. Semeie uma gota de BMM de 50 microlitros. E adicione 25 nanogramas por mililitro BMP7 ao meio de expansão. Após três dias de cultura, substituir o meio pelo meio de diferenciação e cultivar as células durante, pelo menos, 14 dias. Uma análise de imunomarcação foi realizada para validar se os organoides originários das células EpCAM+ estão comprometidos com a linhagem hepática. A presença de células CK19+ e HNF4ɑ+ indica que células progenitoras de hepatoblastos e ducto biliar estão presentes nos organoides. Além disso, organoides que expressam marcadores de tecido epitelial, como células E-CAD+ e células epiteliais cúbicas ou poliédricas que expressam ZO-1, indicam a presença de junções apertadas entre as células. A imuno-histoquímica revelou que as células E-CAD+ apresentaram uma estrutura epitelóide poligonal, refletindo um fenótipo semelhante ao hepatócito. As imagens de microscopia eletrônica de transmissão de eHEPOs são mostradas aqui. Os círculos brancos indicam os complexos juncionais intercelulares. As setas pretas mostram a diferenciação da superfície apical. E a seta vermelha mostra uma seção transversal de microvilosidades. A análise de qPCR mostrou que os organoides ganharam marcadores de hepatócitos maduros, como ALB, A1AT, CYP3A4 e CYP3A7. A área corada de rosa na coloração PAS indica a capacidade de armazenamento de glicogênio dos organoides. Além disso, nossa análise mostrou a capacidade dos organoides de secretar ALB nos meios de cultura, eliminar amônia dos meios de cultura, atividade da enzima CYP3A4 e capacidade de transporte de ácidos biliares.