Geração de camundongos knockout específicos para gordura marrom usando um sistema combinado de RNA guia único Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e vírus adenoassociado
24 de março de 2023
Neste protocolo, descrevemos os procedimentos técnicos para gerar camundongos knockout específicos para tecido adiposo marrom (BAT) utilizando um sistema combinado de RNA guia único (sgRNA) Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e vírus adenoassociado (AAV). As etapas descritas incluem o planejamento dos sgRNAs, a preparação das partículas de AAV-sgRNA e a microinjeção de AAV nos lóbulos BAT.
Este protocolo gera camundongos knockout fat-specific marrom usando um sistema de RNA guia único Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e adenoassociado. Inclui uma técnica cirúrgica para administrar com segurança o AAV na gordura marrom. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode gerar rapidamente knockouts tecido-específicos sem a necessidade de criar camundongos seletivamente.
A abordagem para fazer knockout ou knockdowns específicos do tecido pode ser adaptada a outros tecidos se o procedimento cirúrgico para injetar AAV for modificado com base no órgão-alvo. Para começar, administrar o analgésico por via subcutânea no camundongo UCP1 Cre Cas9 anestesiado para minimizar e prevenir a dor e o sofrimento pós-operatórios. Em seguida, raspar o pelo em sua área interescapular com um barbeador e esterilizar a área cirúrgica com pelo menos três rodadas alternadas de um esfoliante à base de iodo ou clorexidina, seguido de etanol a 70%.
Usando um bisturi, faça uma incisão de dois centímetros na pele acima do tecido adiposo marrom entre as escápulas para expor a gordura interescapular. Após fazer uma única incisão, cortar os tecidos adiposos na borda entre a região distal dos tecidos adiposos e os músculos. Em seguida, usando a tesoura cirúrgica na mão dominante, descasque os tecidos gordurosos bruscamente e verticalmente para expor o tecido adiposo marrom enquanto belisca os tecidos adiposos, incluindo o tecido adiposo marrom, com a mão não dominante.
Use a veia de Sulzer como um ponto de referência para indicar a localização precisa do tecido adiposo marrom. Em seguida, para cada camundongo, injete 20 microlitros de vírus adenoassociado ou AAV lentamente em cada lóbulo dos dois tecidos adiposos marrons usando uma agulha afiada de calibre 32 conectada a uma seringa Hamilton de 100 microlitros. Confirme se a injeção bem-sucedida não tiver vazamentos do local injetado durante a administração de AAV.
Depois de garantir a homeostase, coloque os tecidos adiposos expostos de volta em sua posição normal para suturar a borda dos tecidos adiposos e do músculo usando um fio monofilamentar absorvível 5-0. Finalmente, suture a pele aberta com fios trançados não tingidos VICRYL 5-0. A localização precisa do tecido adiposo marrom não pode ser identificada sem expô-lo, no entanto, danos de exposição excessiva ao tecido.
As possíveis falhas que podem ter levado a injeções malsucedidas incluíram a injeção da solução de AAV na região incorreta, penetração da agulha através do tecido e balonamento tecidual devido a um volume excessivo da solução de AAV. A entrega precisa do RNA guia único do AAV para o tecido adiposo marrom foi crucial para o sucesso do protocolo. A chave para o sucesso durante a exposição do tecido adiposo marrom é a técnica cirúrgica de tesoura, incluindo a direção e profundidade da tesoura e a localização da seringa de Hamilton.
Esta técnica tem um nocaute tecido-específico gerador de carga animais para entender os reguladores moleculares do metabolismo energético relacionado à gordura marrom.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para gerar camundongos com eliminação específica do tecido adiposo marrom (BAT) utilizando uma combinação das técnicas Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e RNA guia único de vírus adeno-associado (AAV). Ao utilizar esses métodos, os pesquisadores podem criar rapidamente eliminações específicas de tecidos sem a necessidade de cruzamento seletivo.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Genética
- Biologia celular
- Biologia molecular
Contexto
- O tecido adiposo marrom é essencial para o metabolismo energético.
- A criação de modelos com genes desativados de forma específica em tecidos auxilia na compreensão dos processos biológicos.
- Este método pode potencialmente ser adaptado para outros tecidos.
Métodos Utilizados
- Aplicação das abordagens Cre-LoxP e CRISPR-Cas9.
- Modelo de camundongo utilizado: camundongos UCP1 Cre Cas9.
- Administração de AAV-sgRNA por microinjeção cirúrgica.
Resultados Principais
- Alcance bem-sucedido e eliminação do tecido adiposo marrom.
- Efetividade comprovada do AAV na edição gênica específica de tecidos.
- Técnicas cirúrgicas fundamentais validadas para entrega com precisão.
Conclusões
- O estudo demonstra uma técnica rápida para gerar modelos de knockouts relevantes para o metabolismo da gordura marrom.
- Amplia a compreensão dos reguladores moleculares no metabolismo energético.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Geração rápida de camundongos com derrube específico do tecido adiposo marrom (BAT, na sigla em inglês) utilizando tecnologias combinadas de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e AAV-sgRNA permite acelerar a genômica funcional na pesquisa metabólica. Esta abordagem simplifica a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas para genes implicados na regulação energética, reduzindo os tempos de ciclo em comparação com a criação tradicional. O método apóia decisões de portfólio ao fornecer informações específicas de tecido essenciais para a descoberta inicial e a continuidade translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta da função gênica em BAT, proporcionando clareza mecanicista.
- Contribui para a desmistificação biológica ao isolar os efeitos gênicos em um tecido relevante para a doença.
- Facilita a confiança preditiva na seleção de alvos para distúrbios metabólicos.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Fornece modelos de knock-out validados para triagem fenotípica posterior.
- Padroniza os backgrounds genéticos para leituras quantitativas reprodutíveis.
- Acelera o desenvolvimento de ensaios ao contornar ciclos demorados de cruzamento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos pré-clínicos com mecanismos de doenças metabólicas humanas por meio de edição gênica específica para o tecido adiposo marrom (BAT).
- Permite avanço ajustado ao risco ao esclarecer a contribuição do gene no metabolismo energético.
- Apoia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica na pesquisa metabólica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se nas fases iniciais de descoberta e validação de alvos, proporcionando uma ponte para o desenvolvimento de modelos pré-clínicos em portfólios de pesquisa metabólica e endócrina.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias na regulação energética mediada pelo tecido adiposo marrom (BAT).
- Triagem: Fornece modelos reprodutíveis de genes nulos para ensaios fenotípicos quantitativos.
- Análises: Permite a medição de efeitos específicos de genes sobre parâmetros metabólicos in vivo.
- Pesquisa Translacional: Facilita o alinhamento de modelos pré-clínicos com a biologia do tecido adiposo marrom humano.
- Reutilização Empresarial: Protocolo adaptável para outros tecidos mediante modificação da entrega de AAV, ampliando sua utilidade em pesquisa e desenvolvimento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Otimiza a geração de modelos com procedimentos padronizados e reprodutíveis.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais rápidas de avançar/não avançar e alocação eficiente de recursos com menor investimento.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos metabólicos e endócrinos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microinjeção cirúrgica e localização anatômica do TAP.
- Necessita acesso à infraestrutura de produção de AAV e engenharia genética com CRISPR-Cas9.
- Exige padronização rigorosa entre equipes para reprodutibilidade.
- Adaptação do protocolo necessária para direcionar outros tecidos ou órgãos.
- O sucesso depende da entrega precisa de AAV e da minimização de danos teciduais.
