Name: Quantificando os custos de aptidão em mosquitos Aedes aegypti transgênicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Aprenda a quantificar parâmetros de aptidão em mosquitos Aedes aegypti transgênicos, incluindo fecundidade, tamanho da asa e longevidade. Este método auxilia pesquisadores a avaliar o impacto de modificações genéticas em populações.

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Os autores gostariam de agradecer aos Drs. Bill Reid e Alexander Franz, da Universidade de Missouri, por seu apoio com este protocolo. Os autores também gostariam de agradecer ao Dr. Benjamin Krajacich do NIH / NIAID por seu apoio com a análise R. Este estudo foi financiado pelo NIH, número de concessão R01 AI130085 (KEO) e pela Divisão NIH / NIAID do Programa de Pesquisa Intramural AI001246 (EC).

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Os autores não têm nada a divulgar.

Os estudos de aptidão de Ae. aegypti são frequentemente realizados em laboratório para avaliar os custos de aptidão associados à carga transgênica (por exemplo, elementos de genética dirigida) ou nocautes genéticos, conforme discutido neste manuscrito; no entanto, esses estudos podem ser realizados para uma variedade de propósitos - qualquer um que vise avaliar a saúde de um grupo de Ae. aegypti, como infectado por Wolbachia 30,31</s...

A sobrevivência do mais apto é a ideia darwiniana de que os indivíduos que abrigam genes mais bem adaptados ao seu ambiente passarão esses genes paraas gerações subsequentes. Isso significa que é a aptidão que determina se seus genes sobreviverão. Esse conceito de mais de 150 anos é talvez o determinante mais significativo da engenharia de um gene drive bem-sucedido em mosquitos transgênicos. Os impulsos genéticos, ou o padrão de herança super-mendeliano de um elemento genético egoísta que permite que ele se espalhe pelas populações2, estão sendo explorados para o manejo genético de pragas3. No contexto do controle vetorial, essa estratégia visa substituir os artrópodes do tipo selvagem (WT) por aqueles resistentes a patógenos (modificação populacional) ou eliminá-los todos juntos (supressão populacional)4. No entanto, os mosquitos transgênicos geralmente exibem custos de aptidão (também chamados de carga genética) em comparação com seus equivalentes WT, o que significa que o transgene será perdido em populações que podem superá-los. O acoplamento de transgenes com um sistema de gene drive é, portanto, necessário para compensar quaisquer custos de aptidão e empurrar o transgene pela população em níveis maiores do que o esperado da herança mendeliana típica4.
Estudos de laboratório em espécies de mosquitos vetores mostraram que os transgenes geralmente apresentam custos de aptidão 5,6,7. Por exemplo, Irvin et al. mediram vários parâmetros de vida em Aedes (Ae.) aegypti projetados para expressar genes de proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP) ou transposase sob promotores de actina 5C ou 3XP3 sintéticos de Drosophila, e os compararam com a cepa Orlando do tipo selvagem (o mesmo fundo genético do qual foram derivados) 5. Mais notavelmente, eles descobriram que todas as cepas transgênicas reduziram significativamente a aptidão reprodutiva5. Dependentes do transgene, alguns mosquitos Anopheles (An.) que expressam transgenes que inibiram o desenvolvimento do parasita Plasmodium também exibiram custos de aptidão6. Especificamente, An. stephensi expressando uma fosfolipase de veneno de abelha (PLA2) sob promotores constitutivos ou induzíveis por farinha de sangue colocou significativamente menos ovos em comparação com os controles6. Esses autores também descobriram que Anopheles transgênicos expressando um transgene diferente, um tetrâmero de dodecapeptídeo SM1, não exibiram custos de adaptação, levando-os a concluir que os custos de adaptação conferidos pelo transgene dependem, pelo menos provavelmente em parte, do efeito da proteína transgênica produzida6. De fato, os custos de adaptação podem ser atribuídos a produtos transgênicos, efeitos posicionais, efeitos fora do alvo, mutagênese insercional ou efeitos de endogamia em cepas criadas em laboratório7. Os impulsos genéticos devem, portanto, ser robustos o suficiente para compensar esses custos de aptidão induzidos por transgenes, ao mesmo tempo em que evitam o desenvolvimento de inserções e deleções (indels) que bloqueiam o próprio impulso.
Os custos de desenvolvimento ou aptidão reprodutiva podem ser medidos em estudos de laboratório ou gaiola7, com a ressalva de que fatores desconhecidos no campo também podem ter impacto. No entanto, estudos controlados de aptidão são um primeiro passo importante ao planejar ou avaliar liberações de mosquitos geneticamente modificados, como um programa de genética dirigida, para determinar se a linha transgênica persistirá nas gerações subsequentes. Por exemplo, Hammond et al. avaliado Um gambiae CRISPR / Cas9-drives de genes destinados a interromper os genes necessários para a fertilidade feminina8. Por meio de estudos em gaiolas mantidos por pelo menos 25 gerações, os autores descobriram que os mosquitos incorriam em alelos resistentes à genética que bloqueavam a clivagem direcionada ao CRISPR e restauravam a fertilidade feminina8. Seus esforços de modelagem sugeriram que a fertilidade em fêmeas heterozigotas para o gene drive teve os impactos mais dramáticos na fixação do gene drive em condições simuladas8. Nessa mesma linha, Ae. aegypti (cepa de olho branco de Higgs, HWE) projetado para expressar de gene drive autônomo sob diferentes promotores ou em diferentes loci intergênicos exibiu diferentes taxas de fixação de gene drive em populações simuladas9. Usando a modelagem MGDrivE10, combinada com taxas medidas de formação de indel, efeitos maternos e dados de parâmetros de vida coletados em laboratório, os autores descobriram que a aptidão do mosquito influenciou mais fortemente a persistência do gene drive em condições simuladas9. Os custos de aptidão com maior probabilidade de prejudicar a eficiência do gene drive são atribuíveis à (super) expressão somática de Cas9 ou do gene que é direcionado, particularmente em heterozigotos, em vez do próprio impulso intrínseco 11,12,13,14,15,16,17.
Dada a sua importância, a aptidão é um fator importante para a capacidade de uma linhagem transgênica persistir nas gerações subsequentes e pode ser usada como um indicador de quaisquer efeitos fisiológicos associados a um transgene. Por exemplo, efeitos fora do alvo podem estar associados a custos de condicionamento físico. Nesse caso, recomenda-se o retrocruzamento de uma linhagem transgênica por várias gerações. Além disso, cruzar a linha transgênica com uma que reflita uma população de campo também pode ser necessário para investigar o quão bem a população transgênica pode competir no mundo real. Para quantificar os custos de aptidão para que possam ser comparáveis, este manuscrito fornece protocolos simples para medir características comuns de história de vida em mosquitos Ae. aegypti, com ênfase particular nos custos de aptidão associados aos transgenes, para que tais estudos possam ser mais facilmente reproduzidos. Os protocolos incluem fecundidade, fertilidade, proporção sexual, viabilidade, tempos de desenvolvimento, contribuição masculina e longevidade adulta. A medição do comprimento e da área da asa também foi escolhida como medida de aptidão, pois se correlaciona com o comprimento do tórax18,19 e as medidas do tamanho do corpo, que estão diretamente ligadas ao tamanho do repasto sanguíneo, fecundidade e imunidade20,21. Embora existam muitas maneiras de avaliar a aptidão, esses parâmetros foram escolhidos porque refletem o sucesso reprodutivo, são simples de medir e são comumente relatados na literatura.

<table><tbody><tr><td>Copos de suflê de plástico translúcido de 1 oz.</td><td>WebstaurantStore</td><td>301100PC</td><td></td></tr><tr><td>Copos de suflê de poliestireno translúcido de 2 oz.</td><td>WebstaurantStore</td><td>760P200N</td><td></td></tr><tr><td>Pipetadores de plástico de 3 mL&nbsp;</td><td>Cornin</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 50 mL</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>64 oz. copo de comida de papel poli-revestido branco duplo</td><td>WebstaurantStore</td><td>999SOUP64WB</td><td>para encolhimento de mosquitos</td></tr><tr><td>lente de 65 mm&nbsp;</td><td>Canon</td><td>MP-E 65mm f/2.8 1-5x Foto Macro</td><td>Canon Foto Macro MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; zoom=1, 200, 6.3, ISO=100; para fotografar asas ou papéis de ovo, embora outras câmeras sejam provavelmente suficientes</td></tr><tr><td>Aedes aegypti&nbsp; mosquitos</td><td>BEI</td><td>várias cepas como ovos estão disponíveis</td><td></td></tr><tr><td>Alimentadores de membrana artificiais</td><td>https://lillieglassblowers.com/</td> <td>alimentador de membrana Meduim, feito sob medida, 33mm</td><td>Chemglass também oferece, mas os tamanhos estão errados para nós. Os nossos têm cerca de 3 cm?</td></tr><tr><td>ATP</td><td>MP Biomedical</td><td>ICN15026605</td><td>Qualquer alíquotas estéreis de boa qualidade ATP, filtro de 10mM a -20</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td></td><td></td><td>para esterilização de água para incubação</td></tr><tr><td>Câmera Canon EOS 7D&nbsp;</td><td>Canon</td><td>3814B004</td><td>para fotografar asas ou papéis de ovo, embora outras câmeras provavelmente sejam suficientes</td></tr><tr><td>para sangue de ovelha desfibrinado&nbsp;</td><td>Colorado Serum Co.</td><td>60 ml, a cada 2 semanas</td><td>https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated</td></tr><tr><td>Iluminador de microscópio pescoço de ganso duplo</td><td>Dolan Jenner Fiber-Lite 180</td><td>181-1 Sistema</td><td></td></tr> de <tr><td>etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Dumont</td><td>5SF</td><td></td></tr><tr><td>Gaze</td><td></td><td>omnisorb ii</td><td>4 "esponjas não tecidas</td></tr><tr><td>lâmina</td> <td>de microscópio de vidroFisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de Vidro, 100 &vezes; 15 mm</td><td>VWR</td><td>75845-546</td><td>para anestesia/manipulação de mosquitos no gelo</td></tr><tr><td>Intestino de porco</td><td>Qualquer delicatessen</td><td></td><td>que compramos a granel, dividimos, lavamos e armazenamos em pequenas alíquotas de ~4X12" a -20 em 50 ml cônico</td></tr><tr><td>Balde</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>de gelo</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Microscópio</td><td></td> Fisher Scientific 06-666A <td></td></tr><tr><td>Leica GZ4 StereoZoom</td><td>para triagem de mosquitos transgênicos (se aplicável)</td> Pincel sintético AIT&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>tamanho 10-0</td><td>para manipulação de larvas/pupas (Amazon)</td></tr><tr><td>Mangueira de calcinha</td><td>Walmart</td><td>L'eggs Everyday</td><td>&nbsp; Meias de Nylon <forte>Plus </forte>Joelho para Mulheres Bico Transparente, 16 pares (mais cabe na caixa)</td></tr><tr><td>Lápis</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recipientes de plástico para 2&deg; armazenamento de caixas</td><td>Walmart</td><td></td><td>Sterilite 58 Qt Caixa de Armazenamento Base Transparente Tampa Branca Conjunto de 8</td></tr><tr><td>recipientes de plástico para larvas em crescimento</td><td>Walmart</td><td></td><td>Sterilite 28 Qt. Caixa de Armazenamento de Plástico, Branco, Conjunto de 10</td></tr><tr><td>Recipientes de Plástico para Chocar Larvas</td><td>Walmart</td><td></td><td>Sterilite 6 Qt. Caixa de Armazenamento Plástico, Recipientes</td></tr><tr><td>de Deli transparentes de polipropileno branco&nbsp;</td><td>Loja Webstaurant</td><td>&nbsp; 127DM12BULK</td><td>12 oz, ou 16 oz se necessário para maiores (127RD16BULK)</td></tr><tr><td>Elásticos</td><td>Office Max</td><td>&nbsp;#100736/#909606 /#3777415</td><td>12", #64 e #10</td></tr><tr><td>Tampa de borracha</td><td>VWR</td><td>217-0515</td><td>para fechamento de mosquitos</td></tr><tr><td>Fonte de açúcar, como cubos de açúcar ou passas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetramin flake food Tetramin</td><td></td><td>16106</td><td></td></tr><tr><td>tpsDig</td><td>Stony Brook Morphometrics</td><td></td><td>Um software gratuito de processamento de imagem morfométrica distribuído on-line disponível em https://www.sbmorphometrics.org/</td></tr> <tr><td>tpsUtil</td><td>Stony Brook Morphometrics</td><td></td><td>Um software gratuito de processamento de imagem morfométrica distribuído on-line disponível em https://www.sbmorphometrics.org/</td></tr> <tr><td>Tecido de organza branco 8 "&vezes; 8"</td><td>FabricWholesale.com&nbsp;</td><td>4491676</td><td>Tecido de Organza da Coleção Casa Joann da Casa Collection&nbsp;</td></tr><tr><td>Papel de filtro qualitativo Whitman Grade 1&nbsp;</td><td>Whitman</td><td>1001-824</td><td>para papéis de ovo. A cor branca facilita a visualização dos ovos pretos.</td></tr></tbody></table>

quantificando os custos de aptidão em mosquitos aedes aegypti transgênicos

Quantifying Fitness Costs in Transgenic Aedes aegypti Mosquitoes

Os mosquitos transgênicos geralmente apresentam custos de condicionamento físico em comparação com seus equivalentes do tipo selvagem. Nesse sentido, os estudos de custo de aptidão envolvem a coleta de dados de parâmetros de vida de mosquitos geneticamente modificados e a comparação com mosquitos sem transgenes do mesmo fundo genético. Este manuscrito ilustra como medir características comuns da história de vida no mosquito Aedes aegypti, incluindo fecundidade, tamanho e forma das asas, fertilidade, proporção sexual, viabilidade, tempos de desenvolvimento, contribuição masculina e longevidade adulta. Esses parâmetros foram escolhidos por refletirem o sucesso reprodutivo, serem simples de mensurar e serem comumente relatados na literatura. Os resultados representativos quantificam os custos de aptidão associados a um nocaute genético ou a uma única inserção de um elemento de condução genética. Padronizar como os dados dos parâmetros de vida são coletados é importante porque esses dados podem ser usados para comparar a saúde dos mosquitos transgênicos gerados em estudos ou para modelar a taxa de fixação do transgene em uma população simulada de mosquitos do tipo selvagem. Embora este protocolo seja específico para Aedes aegypti transgênico, o protocolo também pode ser usado para outras espécies de mosquitos ou outras condições experimentais de tratamento, com a ressalva de que certos contextos biológicos podem exigir adaptações especiais.

Seguindo o protocolo acima, a aptidão de duas linhagens de mosquitos foi avaliada: (1) knock out mediado por CRISPR/Cas9 da proteína salivar D7L1 (AAEL006424) de Ae. aegypti e (2) linhagens de Ae. aegypti expressando unidades gênicas autônomas mediadas por CRISPR/Cas99. No caso do primeiro, uma linha de knock-out D7L1 homozigótica foi estabelecida explorando a via de junção final não homóloga (NHEJ) para gerar a interrupção após microinjetar embriões com sgRNAs específicos para o...

O presente protocolo descreve como medir dados de parâmetros de vida comuns em mosquitos Aedes aegypti , incluindo fecundidade, tamanho da asa, fertilidade, proporção sexual, viabilidade, tempos de desenvolvimento, contribuição masculina e longevidade adulta. Essas medições podem ser usadas para avaliar a aptidão de mosquitos transgênicos.

Quantificando os custos de aptidão em mosquitos Aedes aegypti transgênicos

Transgenic mosquitoes often display fitness costs compared to their wild-type counterparts. In this regard, fitness cost studies involve collecting life ...

Este protocolo demonstra medidas padrão, refletindo a aptidão, em mosquitos aedes aegypti, esses parâmetros de aptidão foram escolhidos porque refletem o sucesso reprodutivo, são simples de medir e são comumente relatados na literatura. Para começar, coloque papéis de ovo em água estéril durante a noite no setor para chocar mosquitos transgênicos e selvagens. Permita que as larvas se alimentem ad libitum, fornecendo várias gotas de chorume de ração para peixes moídos.Para garantir que os adultos sejam virgens, separe as pupas por sexo assim que emergirem, mova a pupa para uma lâmina de microscópio de vidro e remova o excesso de água com tecido para imobilizar a pupa. Sob um estereoscópio com ampliação de duas a quatro vezes, usando um pincel de ponta fina, posicione a pupa voltada para cima. Em seguida, analise visualmente a cauda em busca de diferenças na forma do lobo genital.Coloque as pupas masculinas e femininas em copos de água separados em contenção adequada. Para cruzar o gene drive do tipo selvagem ou transgênico um ou o gene drive dois machos em massa com fêmeas do tipo selvagem virgem, adicione mosquitos anestesiados em proporções de cinco machos para uma fêmea em caixas

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste protocolo combinamos RNAi mediada silenciamento de genes com...

RNAi mediada knockdown do gene e<em&gt; In Vivo</em&gt; Ensaio diurese no Feminino Adulto<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Os mosquitos

Para alcançar a supressão populacional do Aedes aegypti usando o sistema RIDL® (Liberação de Insetos portadores de uma Letal Dominante), um grande número de mosquitos machos precisa ser liberado. Isso requer o uso de técnicas de criação em massa e tecnologia para fornecer sistemas confiáveis para obter o número máximo de mosquitos machos de alta qualidade.

Produção em massa de Aedes aegypti geneticamente modificado para lançamentos de campo no Brasil

A gordura corporal é o órgão central metabólico em insetos. Apresentamos um sistema de cultura de órgãos vivos que permite ao usuário estudar as respostas do tecido isolado gordura corporal a vários estímulos.

Sistema de cultura de órgão de gordura corporal em Aedes Aegypti, um vetor de vírus Zika

Os mosquitos Aedes aegypti infectados com Wolbachia estão sendo liberados em populações naturais para suprimir a transmissão de arbovírus. Descrevemos métodos para traseira Ae. aegypti com Wolbachia infecções no laboratório para experiências e lançamento de campo, tomando as precauções para minimizar a seleção e adaptação de laboratório.

Manter o Aedes aegypti , mosquitos infectados com Wolbachia

Descrito é um método de economia de tempo e espaço para contar ovos e determinar as taxas de escotilha de mosquitos individuais usando 24 placas de cultura de tecido de poço, o que pode aumentar substancialmente a escala e a velocidade dos ensaios de fecundidade e fertilidade.

Ensaio melhorado de fecundidade e fertilidade para a Aedes aegypti usando 24 placas de cultura de tecido poço (placas EAgaL)

O objetivo deste protocolo é entregar refeições de sangue derivadas de animais e artificiais aos mosquitos Aedes aegypti através de um alimentador de membrana artificial e quantificar precisamente o volume de refeições ingeridas.

Alimentação e quantificação de sangue derivados de animais e refeições artificiais em mosquitos Aedes aegypti

A técnica de insetos estéreis (SIT) é usada para controlar populações específicas de mosquitos clinicamente importantes que podem ser resistentes a controles químicos. Aqui, descrevemos um método de criação em massa e preparação de mosquitos machos estéreis para liberação em um programa operacional de SIT visando o mosquito Aedes aegypti .

Preparando mosquitos Aedes aegypti machos irradiados e marcados para liberação em um Programa Operacional de Técnica de Insetos Estéreis

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar a competitividade do Aedes aegypti masculino utilizando corante fluorescente como marcador. Mosquitos fêmeas são expostos a machos marcados e não marcados para cópula. Após o acasalamento, seus espermatozoides são examinados sob um microscópio de fluorescência para determinar seu parceiro de acasalamento.

Usando o Corante Fluorescente, Rhodamine B, para estudar competitividade do acasalamento em mosquitos Aedes aegypti masculinos

Os protocolos aqui relatados ilustram três maneiras alternativas de avaliar o desempenho de mosquitos geneticamente modificados destinados ao controle de vetores em pequenos ensaios de gaiolas em laboratório. Cada protocolo é adaptado à modificação específica que a cepa de mosquito carrega (unidade genética ou unidade não genética) e os tipos de parâmetros medidos.

Ensaios laboratoriais de pequenas gaiolas de mosquitos anofelina geneticamente modificados

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para edição do genoma por meio de microinjeção embrionária no mosquito A. aegypti usando a tecnologia CRISPR-Cas9.

Edição do genoma no mosquito da febre amarela Aedes aegypti usando CRISPR-Cas9

Aprenda a quantificar parâmetros de aptidão em mosquitos Aedes aegypti transgênicos, incluindo fecundidade, tamanho da asa e longevidade. Este método auxilia pesquisadores a avaliar o impacto de modificações genéticas em populações.

Quantificando os custos de aptidão em mosquitos Aedes aegypti transgênicos

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