Name: Pinças magnéticas de alta velocidade para medições nanomecânicas em elementos sensíveis à força (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprenda a usar pinças magnéticas de alta velocidade para medições nanomecânicas em DNA hairpins e complexos SNARE. Este método permite estudar eventos mecanobiológicos em biomoléculas sensíveis à força em tempo real.

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Este trabalho foi apoiado pela bolsa da National Research Foundation of Korea (NRF) financiada pelo governo coreano (MSIT) (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 e NRF- 2021R1A6A1A10042944). S.-H.R. foi apoiado pela subvenção NRF (2021R1C1C2009717).

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Neste trabalho, introduzimos uma configuração de espectroscopia de força de molécula única que pode observar mudanças estruturais de biomoléculas com alta precisão espaço-temporal. A câmera CMOS de alta velocidade usada adquire 1.200 quadros s−1 com resolução de 1.280 x 1.024, permitindo o rastreamento de contas de 1,2 kHz. No entanto, a velocidade das medições é atualmente limitada pelo software de rastreamento de contas, de modo que o ROI é normalmente reduzido a áreas menores em medições de alta velocidade....

As células sentem e respondem ativamente a estímulos mecânicos. Ao fazer isso, muitas biomoléculas exibem propriedades dependentes da força que permitem mudanças estruturais dinâmicas. Exemplos bem apreciados incluem canais iônicos mecanossensíveis e elementos citoesqueléticos que fornecem às células informações mecânicas importantes de seu ambiente circundante.
Além disso, moléculas que mostram uma natureza única de suporte de força também podem ser consideradas mecanossensíveis em um sentido mais amplo. Por exemplo, a formação local e o derretimento de duplexes de ácidos nucleicos, bem como estruturas de ordem superior, como G-quadruplexes, desempenham papéis cruciais na replicação, transcrição, recombinação e, mais recentemente, edição do genoma. Além disso, algumas proteínas neuronais envolvidas nas comunicações sinápticas desempenham suas funções gerando forças físicas que excedem os níveis de interações intermoleculares típicas. Não importa qual exemplo se estude, investigar a nanomecânica das biomoléculas envolvidas com alta precisão espaço-temporal será altamente útil na revelação de mecanismos moleculares dos processos mecanobiológicosassociados1,2,3.
Métodos de espectroscopia de força de molécula única têm servido como ferramentas poderosas para examinar as propriedades mecânicas de biomoléculas 2,4,5,6. Eles podem monitorar mudanças estruturais em ácidos nucleicos e proteínas simultaneamente com a aplicação de força, examinando assim propriedades dependentes da força. Duas configurações bem conhecidas são as pinças ópticas e as pinças magnéticas (MTs), que empregam esferas do tamanho de mícrons para manipular moléculas 5,6,7,8. Nessas plataformas, o poliestireno (para pinças ópticas) ou esferas magnéticas (para MTs) são amarrados a moléculas-alvo (por exemplo, ácidos nucléicos e proteínas) por meio de "alças" moleculares, tipicamente feitas de fragmentos curtos de DNA de fita dupla (dsDNA). As contas são então movidas para exercer força e fotografadas para rastrear suas localizações que relatam mudanças estruturais nas moléculas-alvo. Pinças ópticas e magnéticas são amplamente intercambiáveis em suas aplicações, mas existem diferenças importantes em suas abordagens para controlar a força. Pinças ópticas são instrumentos de fixação intrinsecamente posicionados que aprisionam contas na posição, por causa das quais a força aplicada flutua quando uma construção alvo sofre mudanças de forma; aumento de extensão, como de desdobramento, afrouxa a amarração e reduz a tensão, e vice-versa. Embora a realimentação ativa possa ser implementada para controlar a força em pinças ópticas, as MTs, em contraste, operam naturalmente como um dispositivo de fixação de força, aproveitando as forças magnéticas estáveis e de campo distante por ímãs permanentes, que também podem resistir à perturbação ambiental.
Apesar de sua longa história e design simples, as MTs ficaram atrás das pinças ópticas em suas aplicações para medições de alta precisão, em grande parte devido aos desafios técnicos no rastreamento rápido de contas. Recentemente, entretanto, vários grupos têm liderado conjuntamente um aprimoramento multifacetado tanto do hardware quanto do software para instrumentos de MT2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Neste trabalho, apresentamos um exemplo de tal configuração rodando a 1,2 kHz e descrevemos como usá-lo para realizar medições nanomecânicas em biomoléculas sensíveis à força. Como sistemas modelo, empregamos pinos de cabelo de DNA e complexos SNARE neuronais e examinamos suas rápidas mudanças estruturais no regime de piconewton. Pinos de DNA exibem transições simples de dois estados em uma faixa de força bem definida20,21 e, portanto, servem como modelos de brinquedo para verificar o desempenho de uma pinça. À medida que as proteínas SNARE se agrupam em um complexo sensível à força que impulsiona a fusão da membrana22, elas também têm sido extensivamente estudadas por espectroscopia de força de molécula única 14,23,24,25. Abordagens padrão para analisar dados e extrair informações úteis sobre termodinâmica e cinética são apresentadas. Esperamos que este artigo possa facilitar a adoção de MTs de alta precisão em estudos mecanobiológicos e motivar os leitores a explorar seus próprios sistemas sensíveis à força de interesse.

pinças magnéticas de alta velocidade para medições nanomecânicas em elementos sensíveis à força

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Pinças magnéticas de molécula única (MTs) têm servido como ferramentas poderosas para interrogar com força biomoléculas, como ácidos nucléicos e proteínas, e, portanto, estão prontas para serem úteis no campo da mecanobiologia. Uma vez que o método geralmente se baseia no rastreamento baseado em imagens de esferas magnéticas, o limite de velocidade no registro e análise de imagens, bem como as flutuações térmicas das contas, há muito tempo dificultam sua aplicação na observação de pequenas e rápidas mudanças estruturais em moléculas-alvo. Este artigo descreve métodos detalhados para a construção e operação de uma configuração MT de alta resolução que pode resolver a dinâmica de nanoescala e milissegundos de biomoléculas e seus complexos. Como exemplos de aplicação, experimentos com pinos de cabelo de DNA e complexos SNARE (máquinas de fusão por membrana) são demonstrados, com foco em como seus estados transitórios e transições podem ser detectados na presença de forças em escala de piconewton. Esperamos que as MTs de alta velocidade continuem a permitir medições nanomecânicas de alta precisão em moléculas que detectam, transmitem e geram forças nas células e, assim, aprofundam nossa compreensão em nível molecular da mecanobiologia.

Calibração da força Os resultados dos dois métodos de medição de força (variância do deslocamento lateral das contas e análise do espectro de potência) diferiram em 0-2 pN (Figura 2G). De acordo com os resultados da Figura 2F, podemos alcançar de forma confiável até 30 pN com ímãs regulares de neodímio.
Transições de dois estados de um hairpin de DNA de 8 pb Primeiramente, investigamos a nanomec...

Aqui, descrevemos uma configuração de pinça magnética de alta velocidade que realiza medições nanomecânicas em biomoléculas sensíveis à força na taxa máxima de 1,2 kHz. Apresentamos sua aplicação a pinos de DNA e complexos SNARE como sistemas modelo, mas também será aplicável a outras moléculas envolvidas em eventos mecanobiológicos.

Pinças magnéticas de alta velocidade para medições nanomecânicas em elementos sensíveis à força

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

As biomoléculas sofrem pequenas e rápidas mudanças estruturais, muitas vezes em resposta à força. Pinças magnéticas de alta resolução podem explorar essas dinâmicas sob forças fisiologicamente relevantes. Como o método faz medições em nanoescala com precisão de milissegundos, é possível monitorar mudanças sutis em ácidos nucléicos e proteínas em tempo real.Mau funcionamento no primeiro rolamento e proteínas mecanossensíveis podem potencialmente levar a distúrbios cardiovasculares e musculoesqueléticos. Pinças magnéticas podem fornecer informações sobre os mecanismos de funcionamento dessas proteínas. O conjunto deve estar devidamente alinhado e calibrado para obter boas resoluções.Além disso, deve-se ter cuidado durante a preparação e identificação de construtos moleculares para medições. Comece configurando um microscópio invertido em uma mesa óptica antivibração. Em seguida, instale uma câmera CMOS de alta velocidade e um frame grabber.Monte verticalmente um estágio linear motorizado com mais de 20 milímetros de comprimento de curso em um estágio XY manual para construir um estágio de translação para manipulação de ímãs em 3D. Em seguida, instale um motor de passo rotativo e um s

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Neste artigo, descrevem a utilização de uma pinça magnéticos para estudar o efeito da força sobre a proteólise enzimática no nível única molécula de uma maneira altamente paralelizável.

Multiplexados molécula única Força Medidas proteólise, usando uma pinça magnética

Medimos a libertação da tensão num axónio que foi parcialmente lesionada com um dissecador de laser através da medição simultânea de espectroscopia de força realizado em uma sonda opticamente preso aderida à membrana do axónio. O protocolo experimental desenvolvido avalia a aderência do axónio para o substrato de cultura.

Medição da tensão Lançamento Durante Laser Induced Axon lesão axonal Avaliar Adesão ao substrato em piconewton e resolução de milissegundos

Pinças magnéticas, uma poderosa molécula única técnica de manipulação, pode ser adaptado para as medições diretas da torção (usando uma configuração chamada livremente em órbita pinças magnéticas) e torque (usando uma configuração chamada pinças de torque magnético) em macromoléculas biológicas. Orientações para a realização de tais medidas são dadas, incluindo aplicações para o estudo do DNA e filamentos nucleo-proteínas associadas.

Pinças magnéticas para a Medição do Twist and Torque

Uma plataforma de único-molécula magnética pinças para manipular G-quadruplexes é relatada, o que permite o estudo da estabilidade de G4 e regulamento por várias proteínas.

Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética

Aqui, apresentamos um protocolo para investigar as propriedades mecânicas intracelulares de células isoladas de zebrafish em bidimensionais com medição direta de força por uma armadilha óptica.

Medições de força direta de mecânica subcelular em confinamento usando pinças ópticas

A microscopia de força magnética (MFM) emprega uma sonda de microscopia de força atômica magnetizada verticalmente para medir a topografia da amostra e a força do campo magnético local com resolução em nanoescala. A otimização da resolução espacial e da sensibilidade do MFM requer o equilíbrio entre a diminuição da altura de elevação e o aumento da amplitude de acionamento (oscilação) e se beneficia da operação em um porta-luvas de atmosfera inerte.

Otimizando a resolução e a sensibilidade da microscopia de força magnética para visualizar domínios magnéticos em nanoescala

Este protocolo demonstra o uso de pinças magnéticas de molécula única para estudar as interações entre proteínas teloméricas de ligação ao DNA (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] e TRF2) e telômeros longos extraídos de células humanas. Ele descreve as etapas preparatórias para telômeros e fatores de ligação de repetição teloméricos, a execução de experimentos de molécula única e os métodos de coleta e análise de dados.

Analisando interações proteína-DNA telomérico usando pinças magnéticas de molécula única

flexibilidade conformacional desempenha um papel crucial na função da proteína. Aqui, nós descrevemos o uso de espectrometria de massa por ionização por electropulverização resolvida no tempo acoplado a troca de hidrogénio-deutério para sondar as rápidas mudanças estruturais que conduzem a função de proteínas ordenadas e desordenadas.

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Aqui descrevemos um protocolo simples para produzir rapidamente centenas de ágar de mídia de crescimento nematoide, placas de cultura de 96 poços, com números consistentes de Caenorhhabditis elegans por bem. Estas culturas são úteis para a seleção fenotípica de organismos toda. Nós focamos usando essas culturas para produtos químicos de tela para efeitos de pro-longevidade.

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Aqui nós apresentamos um protocolo de toda a célula eletroquímicos experimentos para estudar a contribuição do transporte de protões para a taxa de transporte de elétrons extracelular através do membrana externa citocromos complexos em Shewanella oneidensis MR-1.

Eletroquímico deteção de deutério cinética efeito isotópico no transporte de elétrons extracelular em Shewanella oneidensis MR-1

Aprenda a usar pinças magnéticas de alta velocidade para medições nanomecânicas em DNA hairpins e complexos SNARE. Este método permite estudar eventos mecanobiológicos em biomoléculas sensíveis à força em tempo real.

Pinças magnéticas de alta velocidade para medições nanomecânicas em elementos sensíveis à força

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