Isolamento, Cultura e Caracterização de Fibroblastos Dérmicos Primários de Tecido Queloide Humano
28 de julho de 2023
Este estudo descreve um protocolo otimizado para o estabelecimento de fibroblastos primários a partir de tecidos queloides que podem fornecer de forma eficaz e constante fibroblastos puros e viáveis.
O isolamento e a cultura de fibroblastos primários derivados de tecido queloide são a base para novos estudos de queloides. Fibroblastos de tecido queloide podem ser facilmente adquiridos através deste protocolo, que pode fornecer uma fonte abundante e estável de células em laboratório para pesquisa de queloide. Comece usando pinças estéreis para colocar o tecido queloide em um tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros contendo 10 a 25 mililitros de PBS suplementado com 1% de PSA.
Enquanto isso, adicione quatro mililitros de solução PBS PSA a cada poço de uma placa de seis poços. Agora retire o tecido do tubo e lave duas vezes com solução de PBS PSA. Usando um par de pinças estéreis, transfira o tecido sequencialmente de um poço para o outro.
Em seguida, remova as camadas adiposa e epidérmica com tesoura cirúrgica, deixando a derme intocada. Use uma tesoura para dissecar a derme aparada em três a cinco pedaços de milímetros quadrados e transfira as peças para o próximo poço com um par de pinças estéreis. Lave as peças em solução PBS PSA.
Usando pinças esterilizadas, coloque de 10 a 30 pedaços de tecido da derme espaçados menos de cinco milímetros em placas de Petri. Coloque os pratos de cabeça para baixo em uma incubadora até os pedaços secarem e grude no prato. Em seguida, adicione sete mililitros de DMEM suplementado com 10%FBS e 1%PSA, e incube os pratos como antes.
Após três dias, substituir metade do sobrenadante por meio de cultura completo. Observar os fibroblastos diariamente sob aumento microscópico de 40X. Retirar os pedaços de tecido no meio de cultura quando os fibroblastos atingirem 90% de confluência.
Lave os fibroblastos em PBS e adicione dois mililitros de solução estéril de tripsina EDTA. Depois de incubar as células em uma incubadora umedecida, bata suavemente na placa de cultura e observe-a ao microscópio. Adicione dois mililitros de meio completo para terminar a digestão uma vez que a maioria das células se desprenderam.
Agora transfira a suspensão da célula para um tubo centrífugo estéril de 15 mililitros e centrifugue o tubo a 300G por três minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante cuidadosamente e ressuspenda o pellet celular em meio completo. Semeando os fibroblastos em uma placa de cultura celular de nove centímetros e incubar em uma incubadora umedificada.
Para realizar a análise de imunofluorescência após cultivar os fibroblastos em lamínulas redondas e incubá-los em anticorpos primários e secundários, adicionar 50 microlitros de solução de DAPI à lâmina de vidro para corar os núcleos celulares. Coloque as lamínulas lavadas sobre lâminas de vidro usando pinças. Finalmente, transfira as amostras para uma caixa escura úmida para microscopia fluorescente.
Crescimentos de fibroblastos do tecido foram observados cinco dias após o processamento. Os fibroblastos apresentaram altas taxas de proliferação e atingiram confluência após 10 dias. Os fibroblastos tinham corpos celulares alongados e fusiformes, os quais estavam alinhados em feixes em alta confluência.
A coloração por imunofluorescência retornou imunofluorescência vermelha positiva dos fibroblastos e imunofluorescência azul do núcleo celular. Os ensaios por citometria de fluxo mostraram positividade para CD90 em quase todos os fibroblastos. Este estudo descreveu um método otimizado e forneceu instruções claras para resolver os desafios existentes e aumentar a chance de sucesso para o isolamento e cultura de fibroblastos de queloide.
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Visão Geral
Este estudo descreve um protocolo otimizado para o estabelecimento de fibroblastos primários a partir de tecidos queloides que pode fornecer de forma eficaz e estável fibroblastos puros e viáveis. O isolamento e o cultivo desses fibroblastos são essenciais para o avanço da pesquisa sobre queloides.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Cultura celular
- Isolamento de fibroblastos
- Pesquisa sobre queloides
Contexto
- Queloides são cicatrizes anormais que podem ser difíceis de estudar.
- Fibroblastos primários são fundamentais para compreender a biologia dos queloides.
- Protocolos existentes podem não fornecer viabilidade celular suficiente.
- Este estudo tem como objetivo aprimorar o processo de isolamento.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um método confiável para o isolamento de fibroblastos a partir de tecidos queloides.
- Fornecer uma fonte estável de fibroblastos para pesquisas laboratoriais.
- Aprimorar a compreensão da formação e tratamento de queloides.
Métodos Utilizados
- Uso de pinças estéreis e tubos de centrífuga para o manuseio de tecidos.
- Lavagem do tecido quelóide com PBS suplementado com 1% de PSA.
- Transferência sequencial do tecido entre poços em uma placa de seis poços.
- Estabelecimento de condições de cultivo para o crescimento de fibroblastos.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de fibroblastos viáveis a partir de tecidos queloides.
- O protocolo fornece uma fonte abundante de células para pesquisa.
- Os fibroblastos mantiveram estabilidade e viabilidade ao longo do tempo.
- Facilitou estudos adicionais sobre a biologia dos queloides.
Conclusões
- O protocolo otimizado é eficaz para o isolamento de fibroblastos.
- Fornece uma base para pesquisas futuras sobre queloides.
- Amplia o potencial de avanços terapêuticos no tratamento de queloides.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento e cultivo confiável de fibroblastos dérmicos primários a partir de tecido quelóide atende a uma necessidade crítica por modelos celulares relevantes à doença na descoberta precoce de fármacos. Este protocolo permite acesso consistente a populações puras e validadas de fibroblastos, apoiando estudos mecanicistas e a validação de alvos para distúrbios cutâneos fibrosos. A abordagem aumenta a confiança preditiva e a continuidade translacional para testes de hipóteses terapêuticas em portfólios de pesquisa de queloides.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de vias mediadas por fibroblastos implicadas na patogênese de queloides.
- Apoia a desmistificação biológica ao fornecer células primárias validadas funcionalmente.
- Facilita estudos mecanicistas para esclarecer a relevância de alvos em doenças fibróticas.
- Aprimora a confiança preditiva em decisões iniciais de triagem de portfólio.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece uma fonte reproduzível de fibroblastos primários para padronização de ensaios.
- Permite o desenvolvimento de ensaios quantitativos baseados em células para avaliação de compostos.
- Apóia a reprodutibilidade e escalabilidade em fluxos de trabalho de triagem.
- Reduz a variabilidade ao minimizar contaminação e mistura com células não fibroblásticas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos in vitro com tipos celulares humanos relevantes para doenças em estudos translacionais.
- Permite a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica na pesquisa de queloides.
- Apoia o avanço ajustado ao risco de candidatos anti-fibróticos.
- Oferece uma plataforma para a descoberta e validação de biomarcadores quando apoiada por estudos complementares.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo posiciona o isolamento de fibroblastos primários de queloides na interface entre a descoberta inicial e a pesquisa pré-clínica, permitindo a validação robusta de alvos e o desenvolvimento de ensaios para pipelines de doenças dérmicas fibrosas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias na patogênese de queloides.
- Triagem: Fornece sistemas celulares validados e reprodutíveis para o desenvolvimento de ensaios quantitativos.
- Análises: Permite a caracterização baseada em imunofluorescência e citometria de fluxo para confirmação da identidade celular.
- Pesquisa Translacional: Oferece modelos celulares relevantes para a doença, destinados à avaliação pré-clínica de terapias candidatas.
- Reutilização Corporativa: Estabelece um protocolo padronizado adaptável entre equipes e projetos de pesquisa.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de queloides.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos fluxos de trabalho com células primárias.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital em programas de fase inicial.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de ativos anti-fibróticos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em manipulação estéril de tecidos e técnicas de cultivo celular primário.
- Necessita de acesso a instalações de cultivo celular, imunofluorescência e instrumentação de citometria de fluxo.
- Exige padronização entre equipes para isolamento e caracterização celular reprodutíveis.
- Pode exigir adaptação para outras fontes de tecido fibrotico ou dérmico.
- Limitações potenciais incluem variabilidade entre doadores e disponibilidade de tecido.
