Name: Isolamento, Cultura e Caracterização de Fibroblastos Dérmicos Primários de Tecido Queloide Humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar fibroblastos dérmicos primários de tecido queloide humano. Este protocolo otimizado fornece células viáveis e puras para pesquisa sobre formação e tratamento de queloides.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (números de concessão 81903189 e 82073418) e da Fundação de Ciência e Tecnologia de Guangzhou (número de bolsa 202102020025).

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa do Hospital de Dermatologia da Southern Medical University (2020081). O consentimento informado dos pacientes foi obtido antes da coleta de tecidos dos indivíduos.
1. Preparo
NOTA: Os seguintes procedimentos devem ser realizados em um ambiente estéril sob um armário de segurança biológica.
<ol><li>Preparar o meio de cultura completo adicionando 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de solução de penicilina-estreptomicina-anfotericina B (PSA) ao meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com alto teor de glicose.</li>
	<li>Preparar solução salina tamponada com fosfato (PBS) com PSA adicionando PSA a 1% em 1x PBS. Prepare o PBS com FBS adicionando 1% de FBS a 1x PBS.</li>
	<li>Prepare várias tesouras, pinças e bisturis esterilizados por autoclavagem.</li>
</ol>2. Obtenção de tecidos removidos
<ol><li>Obter tecidos de pacientes queloides através de cirurgia. Recolher os tecidos queloides frescos num saco de embalagem estéril ou tubo centrífugo estéril e transferi-los para um armário de segurança biológica no laboratório o mais rapidamente possível. OBS: Neste protocolo, o tamanho do tecido queloide adquirido foi de aproximadamente ~20 x 20 x 10mm3, podendo variar dependendo da cirurgia.</li>
</ol>3. Isolamento
<ol><li>Retire o tecido queloide usando uma pinça estéril e coloque-o em um tubo de centrífuga estéril de 50 mL contendo 10-25 mL de PBS com PSA 1% por 10 min. Em seguida, prepare uma placa de 6 poços e adicione 4 mL de PBS suplementado com PSA a 1% em cada poço. Retire o tecido usando uma pinça esterilizada e lave-o duas vezes com PBS suplementado com PSA a 1%. Usando pinças estéreis, transfira o tecido sequencialmente de um poço para outro.</li>
	<li>Remova as camadas adiposas e epidérmicas usando uma tesoura cirúrgica ou um bisturi cirúrgico e deixe a camada da derme intocada. Apague e disseque a camada da derme em3-5 mm 2 pedaços com tesoura, transfira essas peças usando pinça estéril para o próximo poço e lave-as em PBS com solução de PSA a 1% novamente.</li>
</ol>4. Cultura
<ol><li>Colocar os pedaços de tecido da derme em placas de Petri usando pinça esterilizada; Certifique-se de que o número de peças esteja entre 10 e 30 e que a distância entre cada peça seja de >5 mm. Coloque as placas de Petri de cabeça para baixo em uma incubadora de 5% CO2 a 37 °C por 30-60 min até que os pedaços de tecidos sequem um pouco e grude na placa de Petri. Em seguida, adicione DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de PSA e coloque cuidadosamente as placas de Petri em uma incubadora de 5% de CO2 a 37 °C. NOTA: Os fibroblastos são uma população celular morfológica e funcionalmente heterogênea. Considerando essa complexidade, as etapas de isolamento e cultura devem ser realizadas com cuidado; Selecione os pedaços de tecido dérmico queloide uniformemente e misture bem esses pedaços antes de colocá-los na placa de Petri.</li>
	<li>Após 3 dias, substituir metade do sobrenadante por um meio de cultura completo. Troque o meio de cultura a cada 2-3 dias. Observar os fibroblastos ao microscópio com aumento de 40x todos os dias. NOTA: Todas as etapas devem ser executadas com delicadeza. Não mova a placa de Petri por 2 dias após o isolamento, pois os pedaços de tecido levam tempo para aderir às placas de Petri.</li>
	<li>Quando os fibroblastos que crescem ao redor dos pedaços de tecido atingirem aproximadamente 90% de confluência, remova os pedaços de tecido e o meio de cultura. Lave os fibroblastos com 1x PBS estéril e adicione 2 mL de solução estéril de tripsina-EDTA 1x às placas. Incubar as células por aproximadamente ~3-5 min a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO2 . Bata suavemente no prato de cultura e observe-o ao microscópio. Quando a maioria das células se desprender da placa, adicione 2 mL de meio completo para finalizar o processo de digestão.</li>
	<li>Transferir a suspensão celular para um tubo de centrífuga estéril de 15 mL e centrifugar o tubo a 300 × g por 3 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante com cuidado e ressuspenda o pellet celular em meio completo. Semeando os fibroblastos em uma placa de cultura celular de 9 cm e incubar a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO2 .</li>
</ol>5. Manutenção e preservação
<ol><li>Aproximadamente 3-4 dias depois, quando os fibroblastos tiverem crescido até 80% de confluência, repita os passos 4,2-4,4 e passe pelos fibroblastos na proporção de 1:3. Use os fibroblastos passados para experimentos posteriores. NOTA: A cultura de fibroblastos deve ser interrompida após 10 passagens, pois as células podem começar a apresentar características alteradas em relação às células originais.</li>
	<li>Criopreservar as células passadas de P1-P3 em nitrogênio líquido para uso posterior.<ol><li>Repita as etapas 4.2-4.3. Transfira a suspensão celular para um tubo centrífugo estéril de 15 mL e centrifugar o tubo por 3 min a 300 × g. Descarte o sobrenadante cuidadosamente, ressuspenda o pellet de células em 1 mL de meio de congelamento celular contendo 90% de FBS e 10% de DMSO e transfira a suspensão para criotubos celulares.</li>
		<li>Mova as células para uma caixa congelada e, em seguida, coloque a caixa congelada em um freezer de -80 °C. Após 1 dia, transferir as células para nitrogênio líquido para preservação a longo prazo.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Identificação de fibroblastos pela coloração de imunofluorescência
<ol><li>Coloque as lamínulas redondas em uma placa de 24 poços e cultive os fibroblastos passados em uma concentração de 1 × 104 células/poço. Quando os fibroblastos atingirem 60% de confluência, retirar o meio de cultura. Adicionar 1 mL de paraformaldeído a 4% para fixar os fibroblastos por 20 min à temperatura ambiente e lavar 3x com PBS por 1 min de cada vez. NOTA: Conte o número de células usando uma lâmina de hemocitômetro sob um microscópio ou um contador automático de células.</li>
	<li>Retire o PBS, incube com Triton X-100 a 0,5% por 20 min para a permeabilização das membranas celulares e, em seguida, lave 3x com PBS por 1 min de cada vez. Adicionar PBS com albumina de soro bovino a 0,5% e deixar de molho por 30 min. Em seguida, retire-o e adicione o anticorpo PDGFR-α/vimentina diluído em diluente de anticorpos a 1:1.000. Incubar durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>No dia seguinte, remova o anticorpo primário, lave as células 3x com PBS por 3 min e adicione o anticorpo secundário Alexa Fluor-555 cabra anti-coelho IgG diluído com diluente de anticorpos a 1:200 para deixar de molho por 1 h.</li>
	<li>Remova o anticorpo secundário e lave as células 3x com PBS. Retire as lamínulas redondas com pinças, coloque-as em lâminas de vidro e adicione 50 μL de 5 μg/mL de solução de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para corar os núcleos celulares. Mantenha as amostras em uma caixa escura e úmida e observe-as sob um microscópio confocal de fluorescência a laser. NOTA: Adicione um grupo de controlo negativo sem um anticorpo primário, mas com um anticorpo secundário para excluir a coloração inespecífica.</li>
</ol>7. Identificação de fibroblastos por citometria de fluxo
<ol><li>Coletar o pellet de células em um tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL e ressuspender com 50 μL de PBS contendo FBS a 1%. Incubar com anti-CD90 por 30 min no escuro e adicionar um controle de isotipo anti-IgG ao grupo controle. Em seguida, adicionar 200 μL de PBS contendo FBS a 1% e centrifugar o tubo por 10 min a 300 × g a 4 °C.</li>
	<li>Retire o sobrenadante e adicione 200 μL de PBS contendo 1% de SFB. Ressuspenda e filtre a suspensão através de um filtro de células (70 mesh). Adicionar uma solução-mãe de 5 μg/mL de DAPI a 1:100 ao filtrado e, em seguida, obter os resultados por citometria de fluxo. Defina a dispersão direta (FSC) como a abscissa e a dispersão lateral (SSC) como a ordenada, e circule a população celular principal. Selecione a população celular e defina a ficoeritrina como a abscissa e a contagem como a ordenada para análise.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+Chinese+keloid+patients+identifies+novel+causative+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+Of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes.</a> Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883(2022).</li>
<li>Feng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+regulatory+factors+and+therapeutic+targets+in+keloid+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 906212(2022).</li>
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<li>Philippeos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+single-cell+transcriptional+profiling+identifies+functionally+distinct+human+dermal+fibroblast+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+sulfide+suppresses+skin+fibroblast+proliferation+via+oxidative+stress+alleviation+and+necroptosis+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition.</a> Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733(2022).</li>
<li>Zhou, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nintedanib+inhibits+keloid+fibroblast+functions+by+blocking+the+phosphorylation+of+multiple+kinases+and+enhancing+receptor+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).</li>
<li>Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+transcription+factor+3+%28ATF3%29+regulates+cell+growth%2C+apoptosis%2C+invasion+and+collagen+synthesis+in+keloid+fibroblast+through+transforming+growth+factor+beta+%28TGF-beta%29%2FSMAD+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway.</a> Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).</li>
<li>Sato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+medium+obtained+from+amnion-derived+mesenchymal+stem+cell+culture+prevents+activation+of+keloid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+explant+culture%3A+An+improved+method+for+consistently+harvesting+homogeneous+populations+of+keloid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts.</a> Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+glucose+metabolism+and+cell+function+in+keloid+fibroblasts+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia.</a> Redox Biology. 38, 101815(2021).</li>
<li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+integration+analysis+reveals+the+correlation+between+mesenchymal+stromal+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts.</a> Frontiers in Genetics. 13, 798331(2022).</li>
<li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+control+of+PDGFR%CE%B1+regulates+the+fibroblast-to-myofibroblast+transition+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Temporal control of PDGFRα regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing.</a> Cell Reports. 40 (7), 111192(2022).</li>
<li>Domdey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consecutive+dosing+of+UVB+irradiation+induces+loss+of+ABCB5+expression+and+activation+of+EMT+and+fibrosis+proteins+in+limbal+epithelial+cells+similar+to+pterygium+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium.</a> Stem Cell Research. 40, 102936(2022).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+tubular+epithelial+cell+necroptosis+promotes+tubulointerstitial+fibrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease.</a> FASEB Journal. 36 (12), e22625(2022).</li>
<li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse a declarar.

A obtenção de fibroblastos primários a partir de tecidos queloides é uma base crítica para futuras pesquisas. Até o momento, existem dois métodos para aquisição de fibroblastos primários: digestão enzimática e cultura de explantes11,12,13,14. Entretanto, ambos os métodos tradicionais apresentam limitações, como suscetibilidade à contaminação, mistura com outros tipos de células, longo período d...

O queloide, doença fibroproliferativa, manifesta-se como o crescimento contínuo de placas que frequentemente invadem a pele normal circundante sem autolimitação e causam vários graus de prurido, dor e cargas estéticas e psicológicas para os pacientes1. Os fibroblastos, células primárias envolvidas nos queloides, desempenham papel essencial na formação e desenvolvimento dessa doença por proliferação excessiva, produção redundante de matriz extracelular e desorganização de colágenos 2,3. No entanto, a patogênese subjacente permanece obscura, e um método terapêutico eficaz para queloide ainda está faltando; portanto, há uma necessidade urgente de novas pesquisas 4,5.
Como não existe um modelo animal ideal para a pesquisa de queloide in vivo6,7, a construção de um modelo in vitro por meio da aquisição de fibroblastos primários de tecidos queloides pode oferecer viabilidade e confiabilidade para a pesquisa de queloide 2,6. As células primárias são aquelas derivadas diretamente do tecido vivo, e é geralmente reconhecido que essas células podem se assemelhar mais ao estado fisiológico e ao background genético de múltiplos indivíduos em comparação com linhagens celulares 8,9. A cultura de células primárias fornece um meio poderoso para estudar o crescimento e o metabolismo das células, bem como outros fenótipos celulares.
Atualmente, existem dois métodos para aquisição de fibroblastos primários: digestão enzimática e cultura de explantes. Entretanto, vários obstáculos têm sido identificados para a obtenção de fibroblastos primários, tais como o risco de contaminação por várias bactérias ou fungos, a mistura com outros tipos de células que não são facilmente removidas, o longo período do ciclo de cultura, as subsequentes mudanças nas características celulares em relação às células originais, e assim por diante9. Portanto, o desenvolvimento de um processo viável e eficaz para a obtenção de fibroblastos primários é a base para novos estudos e aplicações. Este estudo descreve um protocolo otimizado para extração de fibroblastos primários de tecidos queloides que podem fornecer fibroblastos puros e viáveis de forma eficaz e constante.

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL</td><td>JETBIOFIL</td><td>CFT002015</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga estéril de 15 mL</td><td>JETBIOFIL</td><td>8076</td><td></td></tr><tr><td>4% poliformaldeído</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0099</td><td>Fixação celular</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga estéril de 50 mL</td><td>JETBIOFIL</td><td>8081</td><td>Coloque tecido queloide</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-555 cabra anti-coelho IgG&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>Alexa&nbsp; Flúor 555&nbsp;</td><td>segundo anticorpo para ensaio de coloração por imunofluorescência</td></tr><tr><td>Anti CD90 humano</td><td>BioLegend</td><td>B301002</td><td>Identificar a pureza dos fibroblastos</td></tr><tr><td>Diluente de anticorpos</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0262</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de segurança biológica</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 série A2</td><td>Isolamento e cultura de células</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>aladdin</td><td>B265993</td><td>Bloqueio para ensaio de coloração de imunofluorescência</td></tr><tr><td>Incubadora de dióxido de carbono</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td>Utilização para células de cultura</td></tr><tr><td>Criotubos de células</td><td>Corning</td><td>43513</td><td>Armazene as células na</td></tr><tr><td>máquina centrífuga</td> de baixa temperatura <td>Thermo Fisher</td><td>ST 16R</td><td>Descartar sobrenadante</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C1006</td><td>Corar o núcleo celular</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>MP Biomedicals</td><td>196055</td><td>Uso para preservar células</td></tr><tr><td>Meio de águia modificado de Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>Solução de meio de cultura</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>BI</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>BD</td><td>BD FACSCelesta</td><td>Observando a identidade das células</td></tr><tr><td>congeladas caixa</td><td>Thermo Scientific</td><td>&nbsp; 5100-0050</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal a laser</td><td>Nikon</td><td>AIR-HD25</td><td>Observando o ensaio de coloração de imunofluorescência</td></tr><tr><td>PDGFR-&alpha; anticorpo</td><td>CST</td><td>3174T</td><td>Primeiro anticorpo para ensaio de coloração de imunofluorescência</td></tr><tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina-Am</td><td>Solarbio</td><td>P1410</td><td>Adicione a solução do meio de cultura para evitar a contaminação da placa de</td></tr><tr><td>Petri</td><td>JETBIOFIL</td><td>7556</td><td>Fibroblastos</td></tr><tr><td>de cultura Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>Solução de meio de cultura</td></tr><tr><td>Coelho (DAIE) mAB IgG XR (R) Controle de Isotuge (PE)</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>5742S</td><td>Como controle para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Lamínula redonda</td><td>Biosharp</td><td>801007</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Solarbio</td><td>T8200</td><td>Furos na membrana celular</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Usado para células de passagem</td></tr><tr><td>Anticorpo Vimentina</td><td>Abcam</td><td>ab8978</td><td>Primeiro anticorpo para ensaio de coloração de imunofluorescência</td></tr></tbody></table>

isolamento, cultura e caracterização de fibroblastos dérmicos primários de tecido queloide humano

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

Os fibroblastos, o principal tipo celular no tecido queloide, desempenham um papel essencial na formação e desenvolvimento dos queloides. O isolamento e a cultura de fibroblastos primários derivados de tecido queloide são a base para novos estudos da função biológica e dos mecanismos moleculares dos queloides, bem como novas estratégias terapêuticas para o seu tratamento. O método tradicional de obtenção de fibroblastos primários apresenta limitações, como mau estado celular, mistura com outros tipos de células e suscetibilidade à contaminação. Este trabalho descreve um protocolo otimizado e facilmente reprodutível que poderia reduzir a ocorrência de possíveis problemas na obtenção de fibroblastos. Neste protocolo, os fibroblastos podem ser observados 5 dias após o isolamento e atingem quase 80% de confluência após 10 dias de cultura. Em seguida, os fibroblastos são passados e verificados usando PDGFRα e anticorpos vimentina para ensaios de imunofluorescência e CD90 para citometria de fluxo. Em conclusão, fibroblastos de tecido queloide podem ser facilmente adquiridos através deste protocolo, o que pode fornecer uma fonte abundante e estável de células em laboratório para pesquisa de queloide.

A linha do tempo do protocolo está resumida na Figura 1A. Algumas imagens representativas do processo de isolamento são mostradas na Figura 2; a epiderme e as camadas adiposas foram cuidadosamente removidas, e a camada da derme foi separada em pequenos fragmentos de 3-4 mm2, que foram inoculados nas placas de Petri.
Como mostrado na Figura 3A, vários crescimentos de fibroblastos dos pedaços...

Este estudo descreve um protocolo otimizado para o estabelecimento de fibroblastos primários a partir de tecidos queloides que podem fornecer de forma eficaz e constante fibroblastos puros e viáveis.

Isolamento, Cultura e Caracterização de Fibroblastos Dérmicos Primários de Tecido Queloide Humano

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

O isolamento e a cultura de fibroblastos primários derivados de tecido queloide são a base para novos estudos de queloides. Fibroblastos de tecido queloide podem ser facilmente adquiridos através deste protocolo, que pode fornecer uma fonte abundante e estável de células em laboratório para pesquisa de queloide. Comece usando pinças estéreis para colocar o tecido queloide em um tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros contendo 10 a 25 mililitros de PBS suplementado com 1% de PSA.Enquanto isso, adicione quatro mililitros de solução PBS PSA a cada poço de uma placa de seis poços. Agora retire o tecido do tubo e lave duas vezes com solução de PBS PSA. Usando um par de pinças estéreis, transfira o tecido sequencialmente de um poço para o outro.Em seguida, remova as camadas adiposa e epidérmica com tesoura cirúrgica, deixando a derme intocada. Use uma tesoura para dissecar a derme aparada em três a cinco pedaços de milímetros quadrados e transfira as peças para o próximo poço com um par de pinças estéreis. Lave as peças em solução PBS PSA.Usando pinças esterilizadas, coloque de 10 a 30 pedaços de tecido da derme espaçados menos de cinco milímetros em placas de Petri. Coloque os prato

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Uma maneira rápida e robusta de isolar células-tronco adultas viável epiteliais da pele humana é descrito. O método utiliza a digestão enzimática da matriz de colágeno da pele, seguido por arrancar dos folículos pilosos e isolamento de células em suspensão simples ou fragmentos de tecido para cultura de células.

Isolamento e Cultura de Células-Tronco Adultas epitelial da pele humana

O protocolo de cultura de explantes de fibroblastos de soco biópsias da pele humana é uma forma tecnicamente robusta e simples para derivar células da pele dentro de 4-8 semanas para o banco de cerca de 15-20 milhões de células em um número baixo passagem.

Pele da biópsia Explant Cultura para Derivação de primárias fibroblastos humanos

Este vídeo demonstra um protocolo para isolar e cultivar células de Schwann de tecidos dérmicos humanos. A derme humana contém vários tipos de células, incluindo fibroblastos e células de Schwann. Após o isolamento, as células são tratadas com um agente antimitótico para eliminar os fibroblastos em proliferação, resultando em uma cultura pura de células de Schwann.

Isolamento e cultura de células primárias de Schwann de uma derme humana

Apresentamos um método para isolar as células multipotentes ingênuos precursoras da pele derivada (SKP) de culturas de fibroblastos humanos primários. Mostra-se que estas SKPs derivados a partir de culturas de fibroblastos de células estaminais partilham propriedades semelhantes às derivadas directamente a partir de biópsias de pele humana. Estas células expressam o marcador da crista neural, nestina, para além dos marcadores, tais como OCT4 multipotentes e Nanog.

Naïve Adult Stem Cells isolamento de culturas primárias de fibroblastos humanos

O comportamento dos fibroblastos está subjacente a um espectro de entidades clínicas, mas permanecem mal caracterizados, em grande parte devido à sua heterogeneidade inerente. A pesquisa tradicional de fibroblastos depende da manipulação in vitro, mascarando o comportamento dos fibroblastos in vivo. Descrevemos um protocolo baseado em FACS para o isolamento de fibroblastos de pele de camundongo que não requer cultura de células.

Isolamento de fibroblastos de murino Dérmica por FACS

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar eficientemente queratinócitos humanos primários de tecidos de pele de adultos. Este método simplifica o procedimento convencional usando o Y-27632 de inibidor ROCK no meio de inoculação espontaneamente separar células epidérmicas de células dérmicas.

Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos

Este manuscrito descreve um protocolo FACS-baseado para a isolação de fibroblasto Papillary e reticular da pele humana. Contorna a cultura in vitro que era inevitável com o protocolo comumente usado da isolação através das culturas do explante. Os subconjuntos emanando do fibroblasto são funcionalmente distintos e indicam a expressão e a localização diferenciais do gene dentro da derma.

Isolamento de fibroblastos papilares e reticular da pele humana por triagem celular ativada por fluorescência

A reprogramação celular requer a introdução de genes-chave, que regulam e mantêm o estado celular pluripotente. O protocolo descrito permite a formação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) colônias de fibroblastos dérmicos humanos sem métodos virais/integradores, mas usando RNAs não modificados (NM-RNAs) combinados com fatores de evasão imunológica reduzindo os mecanismos de defesa celular.

Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura dos queratinócitos orais derivados do paladar do rato adulto. Um método de avaliação utilizando imunostaining também é relatado.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos Orais Primários do Paladar do Rato Adulto

Este artigo descreve um método baseado em cultura explant para o isolamento e cultivo de células musculares humanas aórticas humanas primárias e específicas do paciente e fibroblastos dérmicos. Além disso, é apresentado um novo método para medir a contração celular e a análise subsequente, que pode ser usado para estudar diferenças específicas do paciente nessas células.

Isolamento de células musculares lisas aórticas específicas do paciente primário e medidas de contração em tempo real semiquantitativas in vitro

O estudo da cicatrização de feridas associadas à lesão musculoesquelético muitas vezes requer a avaliação de interações in vitro entre células schwann (SCs), queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo descreve o isolamento, acultura e a caracterização dessas células primárias do prepúcio humano.

Isolamento, cultura e caracterização de células primárias de schwann, queratinócitos e fibroblastos de Foreskin Humano

Aprenda a isolar e cultivar fibroblastos dérmicos primários de tecido queloide humano. Este protocolo otimizado fornece células viáveis e puras para pesquisa sobre formação e tratamento de queloides.

Isolamento, Cultura e Caracterização de Fibroblastos Dérmicos Primários de Tecido Queloide Humano

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