Name: Caracterização comportamental de um modelo de camundongo com síndrome de Angelman (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T12:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Aprenda a caracterização comportamental de camundongos modelo para síndrome de Angelman usando testes validados e inteligência artificial. Este método ajuda pesquisadores a estudar distúrbios neurogenéticos com alta reprodutibilidade.

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Esta pesquisa foi apoiada pela Academia Tcheca de Ciências RVO 68378050, LM2018126 Centro Tcheco de Fenogenômica fornecido por MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Atualização do Centro Tcheco de Fenogenômica: desenvolvendo para a pesquisa de tradução por MEYS e ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (CCP Infrastructure Upgrade II por MEYS e ESIF) e OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (maior qualidade e capacidade para modelos transgênicos por MEYS e FEDER). Além disso, este estudo recebeu financiamento da ONG "Association of Gene Therapy (ASGENT)", da Chéquia (https://asgent.org/) e LM2023036 Centro Checo de Fenogenómica fornecido pelo Ministério da Educação, Juventude e Desportos da República Checa.

Validando um modelo murino da síndrome de Angelman usando testes comportamentais

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Modelos de EA criados em diferentes linhagens murinas são comumente validados com testes de estado emocional, funções motoras e habilidades cognitivas de animais para facilitar a comparação com sintomas humanos31,32. Um déficit motor em modelos de EA é o achado mais consistente entre os laboratórios, seguido por um estado de emocionalidade inalterado dos mutantes e dificuldades na construção de ninhos31,32,33</...

A síndrome de Angelman (SA) é uma doença rara do neurodesenvolvimento. A origem genética mais comum da EA é uma grande deleção da região 15q11-q13 do cromossomo materno, que é encontrada em quase 74% dos pacientes1. A deleção dessa região causa a perda de UBE3A, o principal gene causador da EA que codifica uma ubiquitina ligase E3. O alelo paterno do gene UBE3A em neurônios é silenciado em um processo conhecido como imprinting. Como consequência, o imprinting paterno do gene permite apenas a expressão materna no sistema nervoso central (SNC)2. Portanto, a deleção do gene UBE3A do cromossomo materno leva ao desenvolvimento de sintomas de EA. Em humanos, a EA manifesta-se por volta dos 6 meses de idade, com retardo do desenvolvimento que persiste em todos os estágios de desenvolvimento e resulta em sintomas debilitantes graves nos indivíduos afetados 3,4. Os principais sintomas do transtorno incluem o déficit de habilidades motoras finas e grossas, incluindo marcha atáxica brusca, comprometimento grave da fala e deficiência intelectual. Aproximadamente 80% dos pacientes com EA também sofrem de distúrbios do sono e epilepsia. Até o momento, o único tratamento disponível são as drogas sintomáticas, que reduzem as crises epilépticas e melhoram a qualidade do sono1. Portanto, o desenvolvimento de modelos animais robustos com fenótipos comportamentais reprodutíveis, juntamente com análises fenotípicas refinadas, será essencial para elucidar os mecanismos fisiopatológicos do transtorno e descobrir medicamentos e tratamentos eficazes.
A complexidade da desordem humana que afeta o SNC exige que os organismos-modelo possuam genoma, fisiologia e comportamento comparáveis. Os camundongos são populares como um organismo modelo devido ao seu curto ciclo reprodutivo, tamanho pequeno e relativa facilidade de modificação do DNA. Em 1984, Paul Willner propôs três critérios de validação do modelo básico de doença: validade de construto, validade de face e preditiva, que são usados para determinar o valor do modelo5. Simplesmente, a validade de construto reflete os mecanismos biológicos responsáveis pelo desenvolvimento do transtorno, a validade de face recapitula seus sintomas e a validade preditiva descreve a resposta do modelo a drogas terapêuticas.
Para aderir aos princípios acima, escolhemos a etiologia genética mais comum, uma grande deleção do locus 15q11.2-13q materno, incluindo o gene UBE3A, para criar camundongos modelo AS. Usamos a técnica CRISPR/Cas9 para excluir uma região longa de 76.225 pb abrangendo todo o gene UBE3A, englobando tanto os elementos codificantes quanto os não codificantes do gene, em camundongos deum fundo C57BL/6N6. Em seguida, criamos os animais para obter camundongos heterozigotos UBE3A+/−. Para validação de face do modelo, foram utilizados animais de cruzamentos de fêmeas UBE3A+/− e machos selvagens para ganhar progênie UBE3A+/- (cepa denominada C57BL/6NCrl-UBE3A<em1(IMPC)Ccpcz>/Ph e posteriormente designada como UBE3A mGenedel/+) e companheiros controle. Testamos suas habilidades motoras finas e grossas, emocionalidade e afeto para recapitular os sintomas centrais da EA. Em artigo anterior, também avaliamos as funções cognitivas dos animais, uma vez que pacientes com EA também sofrem de deficiência intelectual6. No entanto, não encontramos prejuízos cognitivos em camundongos UBE3AmGenedel/+, talvez devido à pouca idade dos animais no momento do teste7. Exames posteriores dos animais mais velhos, por volta das 18 semanas de idade, revelaram um déficit na flexibilidade comportamental durante o aprendizado de reversão no paradigma de preferência de lugar. No entanto, a complexidade dos equipamentos empregados para esta análise requer um módulo metodológico separado e não está aqui incluído.
Os testes comportamentais aqui apresentados pertencem às ferramentas de fenotipagem comuns na pesquisa genética, graças ao seu alto valor preditivo e suficiente validade de construto8,9,10. Usamos esses testes para validar um modelo de EA em camundongos, recapitulando os principais sintomas da doença humana de maneira reprodutível e independente da idade. A emocionalidade do animal foi avaliada nos testes de labirinto em cruz elevado e campo aberto. Ambos os testes são baseados no conflito abordagem-evitação, em que os animais exploram um novo ambiente em busca de alimento, abrigo ou oportunidades de acasalamento, evitando simultaneamente compartimentos ansiogênicos11. Além disso, o teste de campo aberto é utilizado para testar a atividade locomotora de camundongos8. O teste de suspensão de cauda é amplamente utilizado em pesquisas de depressão para rastrear novas drogas antidepressivas ou fenótipos semelhantes aos depressivos em modelos knockout de camundongos12. Este teste avalia o desespero que os animais desenvolvem ao longo do tempo em uma situação inescapável. Aprendizado motor e características detalhadas da marcha foram determinadas no rotarod e no DigiGait, respectivamente. A resistência do animal na haste aceleradora caracteriza suas habilidades de equilíbrio e coordenação do movimento, enquanto a análise detalhada dos padrões de passos de um camundongo é uma avaliação sensível de comprometimentos neuromusculares ligados a muitos distúrbios neurogenerativos do movimento13,14,15. O teste de trituração de filhotes faz parte da metodologia padrão para detecção de comportamento impulsivo em roedores e, por utilizar o comportamento natural de construção de roedores, indica o bem-estar do animal16,17.
O tamanho dos grupos experimentais foi resultado de um compromisso em atender às exigências da regra 3R e ao uso eficiente do desempenho reprodutivo das colônias. No entanto, para a obtenção do poder estatístico, os grupos possuíam nada menos que 10 indivíduos, devido ao estabelecimento de uma quantidade suficiente de pares reprodutores. Infelizmente, o desempenho reprodutivo nem sempre resultou em um número suficiente de animais.

<table><tbody><tr><td>Gaiolas, ventiladas individualmente</td><td>Techniplast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DigiGait</td><td>Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA</td><td>O equipamento foi licitado, nenhum número de catálogo foi fornecido, nem pôde ser encontrado no site da empresa</td><td>Análise detalhada da marcha do mouse, hardware e software fornecidos.&nbsp;</td></tr><tr><td>FDA Nestlet squares</td><td>Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, Reino Unido</td><td>O material foi comprado do fornecedor Velaz por meio de solicitação direta por e-mail. A Velaz não fornece nenhum número de catálogo.</td><td>Nestlets de algodão para teste de construção de ninhos. Descrição do ninho: 2-3 g cada, com diâmetro em torno de 5 x 5 x 0,5 cm.</td></tr><tr><td>Ração para ratos</td><td>Altramion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotarod</td><td>TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlim, Alemanha</td><td>O equipamento foi licitado, nenhum número de catálogo foi fornecido, nem foi possível encontrar no site da empresa</td><td>Rotarod para 5 mouses, hardware e software fornecidos. Dimensões do tambor: Diâmetro: 30 mm, largura por pista: 50 mm, distância de queda 147 mm.</td></tr><tr><td>Teste de Suspensão de Cauda</td><td>Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANÇA</td><td>Referência: BIO-TST5</td><td>Equipamento totalmente automatizado para avaliação do tempo de imobilidade de 3 ratos pendurados pela cauda, hardware e software fornecidos</td></tr><tr><td>Fita médica Transpore</td><td>Medical M, Ltd.</td><td>P-AIRO1291</td><td>A fita usada para prender um animal ao anzol pela cauda.</td></tr><tr><td>Visualizador - Sistema de Rastreamento de Vídeo</td><td>Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Alemanha</td><td>Equipamentos com software foram licitados, nenhum número de catálogo foi fornecido, nem foi possível encontrar no site da empresa</td><td>Software com hardware personalizado: labirinto, base IR, câmeras sensíveis a IR. Dimensões OF feitas sob medida: 42 x 42 cm de área, parede de 49 cm de altura, área da zona central: 39 cm2. Um EPM feito sob medida foi elevado 50 cm acima do chão, com um braço aberto de 79 cm de comprimento,&nbsp; 9 cm de largura e braço fechado com 77 cm de comprimento, 7,6 cm de largura.</td></tr></tbody></table>

caracterização comportamental de um modelo de camundongo com síndrome de angelman

Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model

Este manuscrito descreve uma bateria de testes comportamentais disponíveis para caracterizar fenótipos semelhantes à síndrome de Angelman (SA) em um modelo murino estabelecido de EA. Usamos o paradigma de aprendizado de rotarod, análise detalhada da marcha e teste de construção de ninhos para detectar e caracterizar deficiências motoras em animais. Testamos a emocionalidade dos animais em campo aberto e testes de labirinto em cruz elevados, bem como o efeito no teste de suspensão de cauda. Quando camundongos SA são testados no teste de campo aberto, os resultados devem ser interpretados com cuidado, uma vez que disfunções motoras influenciam o comportamento de camundongos no labirinto e alteram os escores de atividade.
A reprodutibilidade e eficácia dos testes comportamentais apresentados já foi validada em várias linhagens independentes de camundongos Uba3a com diferentes variantes knockout, estabelecendo este conjunto de testes como uma excelente ferramenta de validação em pesquisas de EA. Modelos com validade de construto e de face relevantes justificarão novas investigações para elucidar a fisiopatologia da doença e propiciar o desenvolvimento de tratamentos causais.

Testes de labirinto em cruz elevado e em campo aberto Os testes de EPM e FO utilizam a tendência natural dos roedores em explorar novos ambientes18,19. A exploração é regida por um conflito de abordagem-evitação, onde os roedores escolhem entre a exploração de um novo ambiente e evitar possíveis perigos. Os animais exploram lugares desconhecidos em busca de abrigo, contato social ou forrageamento. No entanto, novos locais podem envolver fatore...

Este manuscrito apresenta um conjunto de testes comportamentais altamente reprodutíveis para validar um modelo de camundongo com síndrome de Angelman.

Caracterização comportamental de um modelo de camundongo com síndrome de Angelman

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of ...

Nosso objetivo é elucidar os papéis fisiológicos de genes utilizando camundongos como modelo experimental. Também nos concentramos no desenvolvimento de modelos de camundongos de doenças específicas que os cientistas podem usar para investigar a causa da doença e desenvolver tratamentos eficazes. Um exemplo dessa atividade é o modelo de camundongo da síndrome de Angelman.Indiscutivelmente, a nova tecnologia mais promissora com potencial é a integração de inteligência artificial baseada em técnicas de aprendizado profundo em pesquisas com animais. Esta abordagem pode ser usada para monitorar o comportamento animal na gaiola doméstica diretamente, sem a necessidade de o experimentador perturbar os animais. O maior desafio nos estudos comportamentais atualmente é a reprodutibilidade.Portanto, introduzimos uma bateria de testes que validam a síndrome de Angelman do modelo de uma forma que não depende da idade ou da espécie do modelo. Usamos testes comportamentais estabelecidos para validar nosso modelo de EA. No entanto, com a nova abordagem para o desenvolvimento do modelo muito semelhante à condição humana com uma grande deleção.Usando a tecnologia CRISPR, excluímos todo o gene UBE3A do genoma do camundongo. Ao contrário de outros modelos onde a exclusão é limitada a 3KB. Estamos trabalhando no desenvolvimento de uma terapia genética que possa restaurar um sintoma em um modelo de camundongo.

behavioral-characterization-of-an-angelman-syndrome-mouse-model

Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Inchworming é um movimento de escavação síncrona altamente repetitivo exibido pelo BTBR T + ITPR 3TF / J (BTBR) camundongos quando colocado em uma gaiola de testes com roupa de cama de serragem suficiente. O procedimento é uma modificação do protocolo de interacção social, juvenil e é utilizado aqui para avaliar estereotipias motoras repetitivas relevantes para Transtorno do espectro do autismo.

Inchworming: A Novel Motor Estereotipia no BTBR<em&gt; T<sup&gt; +</sup&gt; Itpr3<sup&gt; Tf</sup</em&gt; / J Rato modelo de autismo

Aqui apresentamos um protocolo para induzir anorexia baseada em atividade (ABA) em camundongos adolescentes fêmeas. ABA é uma condição de hiperatividade evocada pela imposição de restrição alimentar a roedores com acesso a uma roda de corrida. Esse fenômeno está sendo usado como modelo para estudar a neurobiologia subjacente da anorexia nervosa.

Usando a Anorexia Rodent modelo baseado em atividades para estudar a base neurobiológica da Anorexia Nervosa

Ratinhos alojados individualmente com uma roda de execução enquanto dado acesso limitado ao alimento desenvolvem reduções no consumo de alimentos e aumentam a atividade na roda de execução. Este fenômeno experimental é chamado anorexia baseado na atividade. Este paradigma fornece uma ferramenta experimental para estudar a neurobiologia e comportamentos subjacentes aspectos da anorexia nervosa.

Avaliar a Anorexia baseado na atividade em ratos

A análise de pegada é uma alternativa de baixo custo para programas digitalizados de análise da marcha para pesquisadores que quantifiquem anormalidades de movimento em camundongos. Devido à sua velocidade, simplicidade e potencial longitudinal, é ideal para a fenotipagem comportamental de modelos de mouse.

Análise de marcha de baixo custo para fenotipagem comportamental de modelos de camundongo de doença neuromuscular

O Transtorno do Espectro do Autismo (TEA) está associado ao comportamento social e comunicativo prejudicado e ao surgimento de comportamento repetitivo. Para estudar a inter-relação entre genes de TEA e déficits comportamentais no modelo de Drosophila , cinco paradigmas comportamentais são descritos neste artigo para testar o espaçamento social, agressão, namoro, aliciamento e comportamento de habituação.

Paradigmas para Avaliação Comportamental no Modelo de Drosophila de Transtorno do Espectro do Autismo

Modelos de roedores são ferramentas valiosas para estudar comportamentos centrais relacionados ao transtorno do espectro do autismo (TEA). Neste artigo, expomos dois testes comportamentais para modelar as principais características do TEA em camundongos: auto-limpeza, que avalia o comportamento repetitivo, e o teste de interação social de três câmaras, que documenta deficiências sociais.

Estratégias para avaliar comportamentos semelhantes aos autistas em camundongos

Demonstramos a utilidade do comportamento de construção de ninhos em ratos de laboratório como um indicador de bem-estar. A pontuação do ninho é uma técnica sensível que é alterada pela temperatura, doença e agressão. O tempo para integrar no teste de ninho (TINT) é uma avaliação simples do lado da gaiola que pode detectar a dor pós-operatória.

Construção de ninhos como indicador de saúde e bem-estar em ratos de laboratório

Monitorização prolongada e abrangente de ratos em um ambiente de home-gaiola proporciona uma compreensão mais profunda do comportamento aberrante em modelos murinos de doenças do cérebro. Este artigo descreve a Estação Behavioral Integrado (INBEST) como o componente-chave da análise comportamental contemporânea.

Behavioral Fenotipagem de modelos de doenças Murino com a Estação Integrada Comportamental (INBEST)

Os modelos de camundongos tornaram-se cada vez mais populares em estudos de neurociência comportamental.  À medida que os modelos avançam, é importante desenvolver medidas comportamentais sensíveis específicas para o mouse.  Este protocolo descreve a Tarefa de Alcance da Matriz de Massa, que é uma tarefa motora habilidosa para uso em modelos de AVC em camundongos.

Compensatória Limb Uso e Avaliação Comportamental de Habilidade Aprendizagem Motora Após Lesão Sensorimotor Cortex em um modelo do rato de Acidente Vascular Cerebral Isquêmico

Controlo do motor e desempenho da balança são conhecidos por se deteriorar com a idade. Este artigo apresenta uma série de testes comportamentais não invasivos padrão com a adição de um estímulo rotativo simples de desafiar o sistema e mostrar vestibulares mudanças no desempenho do equilíbrio em um modelo murino de envelhecimento.

Avaliação Comportamental do Envelhecimento Rato Sistema Vestibular

Aprenda a caracterização comportamental de camundongos modelo para síndrome de Angelman usando testes validados e inteligência artificial. Este método ajuda pesquisadores a estudar distúrbios neurogenéticos com alta reprodutibilidade.

Caracterização comportamental de um modelo de camundongo com síndrome de Angelman

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