Na imagem situ da Thymus Mouse Usando 2-Photon Microscopia

A imagem por dois fótons é útil para a imunologia porque nos permite acompanhar a migração de uma única célula enquanto ela encontra seu ambiente. Ao acompanhar a migração no timo, utilizando microscopia de dois fótons, podemos caracterizar o mecanismo da seleção positiva e negativa.

Olá, sou Ina Lottie do laboratório da Dra. Ellen Roby na Universidade da Califórnia em Berkeley. E sou Paul Herzmark, também do laboratório de Ellen Roby. Hoje vamos mostrar a vocês como realizamos a imagem in situ de tecido timo, e vou mostrar como podemos usar nosso microscópio de dois fótons para imagens do timo.

E mostrarei os passos que levam à imagem por dois fótons. Isso inclui os seguintes procedimentos: isolamento de células-tronco hematopoiéticas da medula óssea, transferência adotiva de células da medula óssea para neonatos, dissecção e bissecção do timo, e o preparo do tecido para imagem por microscopia de varredura a laser de dois fótons. Então, vamos começar.

Antes de prepararmos o timo para imagem, devemos primeiro transferir adotivamente células da medula óssea para um camundongo neonatal. Essas células da medula óssea foram isoladas das patas traseiras de camundongos transgênicos que expressam GFP ubiquitariamente. Esta é uma seringa de insulina com 50 microlitros de medula óssea.

Realizamos de duas a quatro injeções em hospedeiros com idade entre três e sete dias, utilizando medula óssea de um doador para cada filhote injetado. Aqui temos um filhote de cinco dias de idade; puxe a pele para trás para impedir que o filhote se mova durante a injeção e para manter a pele esticada. O alvo deve ser um local de injeção abaixo dos pulmões e da caixa torácica, mas acima do intestino e do estômago.

Enquanto você injeta, solte levemente o aperto sobre a pele para permitir que ela se expanda. Por fim, remova lentamente a seringa para limitar a quantidade de medula óssea que é perdida. Esses camundongos serão mantidos em desenvolvimento por quatro a seis semanas, e então o timo poderá ser removido para imagem.

Após quatro a seis semanas, o timo pode ser removido. Para a imagem, usarei um conjunto de pinças e tesouras grandes, bem como um conjunto de pinças e tesouras pequenas. Este espécime foi sacrificado de acordo com o nosso protocolo de uso de animais e pulverizado com etanol.

E vou usar a pinça grande para prender a pele e fazer uma incisão na linha média. Agora posso usar a tesoura para cortar ao longo da linha média ou posso rasgar a pele afastando-a do peritônio, e vou fixar a pele para expor a cavidade torácica. Vou usar o esterno como apoio enquanto corto o peritônio, adentro a cavidade torácica através do diafragma e, em seguida, corto ao longo das bordas da caixa torácica.

E você pode ver o timo situado exatamente sobre o coração. Vou colocá-los de volta. Então, aqui está o timo.

Vou evitar tocá-lo. Use a pinça menor, mas continue segurando o tecido ao redor do timo. Ok, agora vou pulverizar com um pouco de PBS e começar a remover alguns tecidos em excesso.

Então, vou usar o tecido ao redor do timo para segurá-lo. Ao limpar o timo, vou remover o tecido em excesso, cortando-o cuidadosamente. Agora, existem dois lobos no timo que também precisamos separar durante a limpeza.

Mas primeiro vou remover todos esses vasos sanguíneos extras que estão na superfície do timo. Tenho muito cuidado para não perturbar a arquitetura do timo que vamos imaginar. Por isso, estou removendo apenas o tecido que está exatamente na superfície.

Agora vou começar suavemente a separar os dois lobos. Este é o lobo ventral e o lobo dorsal que vamos separar, cortando delicadamente o tecido e puxando-os para separá-los. Não queremos que o tecido seque, então vamos borrifar um pouco de PBS sobre ele.

Agora separei os dois lobos. Este é o lobo dorsal, que possui uma forma característica de violão. E este é o lobo ventral bem aqui.

Vou remover o tecido em excesso de cada um desses lobos para que a área de imagem esteja livre de tecido adicional. Mas vou deixar apenas um pouco de tecido para podermos segurar o tímpano. Durante a aquisição de imagens, estaríamos realizando a imagem através desse tecido excedente, o que realmente não é necessário, e a qualidade da nossa imagem será melhorada com sua remoção.

Agora temos nossos dois lobos bisseccionados prontos para serem montados sobre uma lamínula para imagem. Para preparar o timo bisseccionado para a aquisição de imagens, você precisará de adesivo tecidual veterinário e lamínulas de 18 por 18. Gosto de usar uma pipeta micrométrica para colocar uma fração de um microlitro de cola sobre a lamínula.

Então, vou colocar uma gota de cola com aproximadamente o comprimento do timo que vamos imaginar. Em seguida, gosto de espalhá-la. Se a largura for equivalente à do timo, novamente, vou colocar ambos os lobos na mesma lamínula.

Então, vou colocar outro bem aqui. Vou pegar o lobo do tecido excedente e simplesmente colocá-lo sobre a lamínula, arrastando-o para a área onde está a cola. Farei o mesmo com o outro lobo, novamente apoiando a mão na lamínula onde não há cola, para estabilizá-la, e depois colocando a outra glândula tímica sobre a lamínula.

Agora que fixamos ambas as glândulas tímicas à lamínula, vamos entregá-la a Paul para a obtenção de imagens. Obrigado, Ina. Vamos pegar esta amostra e colocá-la no meio DME que utilizaremos para imagiá-la.

Então, esta é a nossa configuração de microscopia de dois fótons. A microscopia de dois fótons é muito eficaz para imagens de células imunes porque permite observar profundamente o timo e ver as células fluorescentes se movimentando. Ela utiliza um laser infravermelho pulsado para induzir a fluorescência das células.

E temos em nosso microscópio do tipo cinto abdominal quatro câmeras diferentes, que nos permitem visualizar simultaneamente quatro cores distintas, e utilizamos uma lente objetiva especial, com ampliação de 20x. Trata-se de uma lente especial que mergulha no meio DME no qual submergimos o timo, o que lhe confere uma abertura numérica de 0,95, o que é muito bom e tornará nossas células muito brilhantes. Para manter o tecido saudável, borbulhamos 95% de oxigênio e 5% de CO2 através do meio DMEM.

A partir daí, é bombeado para a câmara de perfusão, onde é aquecido a 37 graus, e é nesse local que os lobos do timo são submersos. Com este sistema, podemos manter as células no timo saudáveis por quatro horas de imageamento. Então, mostrei a você como configurar o imageamento para o microscópio de dois fótons.

Agora vamos analisar alguns dos nossos resultados neste filme que está em loop. É possível observar o timo que imageamos em quatro cores diferentes aqui. O vermelho representa os vasos sanguíneos do timo e o amarelo representa as células dendríticas do hospedeiro que expressam a proteína fluorescente amarela sob o controle de um promotor específico de células dendríticas.

Os timócitos azuis e verdes que você vê aqui são de dois doadores diferentes que utilizamos para criar uma quimera neonatal por meio de uma técnica de transferência adotiva que Ena mostrou a você anteriormente. As células verdes são timócitos que expressam a proteína verde fluorescente, e as células azuis são timócitos do doador que expressava a proteína azul fluorescente. Este é o mesmo vídeo em loop que mostrei antes, mas quero mostrar a você a tridimensionalidade dos conjuntos de dados que coletamos para gerar esses vídeos.

Concentramos-nos em um plano e capturamos uma imagem, depois focamos um pouco mais profundamente e capturamos outra imagem, e um pouco mais abaixo, outra imagem. Em seguida, para este filme, avançamos cerca de 60 mícrons, e repetimos esse volume de imagens aproximadamente a cada 30 segundos para obter o volume em movimento. Esse filme foi registrado ao longo de cerca de 20 minutos.

Assim, podemos rastrear as células através de três dimensões ao longo do tempo. Acabamos de mostrar como imageamos o timo utilizando microscopia de dois fótons. Os aspectos mais importantes deste procedimento são: primeiro, injetar os neonatos com medula óssea de doadores.

Dois, dissecar e bi, dissecar o timo sem danificar sua estrutura. Três, fixar firmemente o timo a um lamínula para quatro, obtenção de imagens usando um microscópio de dois fótons. A aquisição de imagens no timo pode responder a muitas perguntas sobre o desenvolvimento dos timócitos e a geração de um repertório diversificado de linfócitos T.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.