Name: Na imagem situ da Thymus Mouse Usando 2-Photon Microscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-25T19:52:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: Aprenda a gerar quimeras neonatais e preparar tecido timico para imagem ex vivo usando microscopia de 2-fotons. Este metodo permite observar a migracao celular no timo de camundongos.

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Agradecemos a Matt Paul e Jimmy Wu para assistência técnica.

Transferência adotiva Injetar recém-nascidos com 50 100ul de medula óssea usando uma seringa de insulina 2-4 vezes durante os primeiros 3-7 dias de vida, com uma relação de doadores para hospedar-final de 1:1. Apontar para um local da injeção abaixo do esterno e costelas, mas acima do intestino e estômago. Inserir a agulha longe o suficiente para penetrar no peritônio, cuidado para não perfurar o diafragma. Não é incomum para alguns de medula óssea para ser perdido durante a injecção. Você pode reduzir a perda soltando o seu domínio sobre o cachorro como você injetar, de modo a permitir que a pele a se expandir e, em seguida, lentamente, retirar a agulha. Dissecção da Thymus Faça uma incisão através da linha média e cortar ou rasgar a pele para revelar a caixa torácica. Segure-se do esterno e cortar o peritônio e diafragma. Cortar os lados da caixa torácica para revelar a cavidade torácica. O timo fica em cima do coração. De forma a preservar a estrutura do timo, segurar o tecido circundante como você dissecar o timo. Lavar o timo com PBS para mantê-lo de secar durante a dissecção. Provocar suavemente o tecido em excesso na superfície da cápsula do timo e bisect os dois lóbulos. Preparando Tissue for Imaging Use cola de tecido veterinária para colar o timo não a uma lamela quadrados. Use uma pipetteman para colocar uma fração de um microlitro de adesivo. Espalhe a cola para o comprimento e largura aproximada do timo. Timo a constante contra as lamelas e arrastá-lo no lugar. Dois Photon Imagens O tecido é imerso em DMEM sem vermelho de fenol que é perfundido com 95% de oxigênio e dióxido de carbono de 5% e aquecido a 37 ° C. Excitação de dois fótons foi obtido utilizando um Spectra-Física Maitai a laser sintonizado com 900nm, e PCP, GFP, YFP e Texas Red emissão de luz foi separada usando um 495, 515, 560 espelhos dicróicos e coletados por meio de detectores de PMT.

<ol><li>Kyewski, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+thymic+microenvironments+defined+by+distinct+thymocyte-stromal+cell+interactions+is+developmentally+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled.</a> J Exp Med. 166, 520-538 (1987).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Migration+of+Positively+Selected+Thymocytes+Visualized+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time.</a> PLoS Biol. 3, (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Imagem de dois fótons no timo nos permite examinar em que vivem, órgãos intactos as interações e as migrações que fundamentam eventos de seleção dentro do timo.

na imagem situ da thymus mouse usando 2-photon microscopia

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Microscopia de dois fótons (TPM) nos permite imagem profundamente no timo e documentar os eventos que são importantes para o desenvolvimento timócito. Para acompanhar a migração de indivíduos em uma multidão de timócitos, geramos quimeras neonatal, onde menos de um por cento dos timócitos são derivados de um doador que é transgênico para expressar uma proteína fluorescente ubiquitously. Para gerar estas quimeras parcial hematopoéticas, os destinatários neonatal são injetados com medula óssea entre 3-7 dias de idade. Após 4-6 semanas, o rato é sacrificado e do timo é cuidadosamente dissecado e bissected preservar a arquitetura do tecido que será trabalhada. O timo é colado em uma lamela em preparação para ex vivo de imagens por TPM. Durante a gravação do timo é mantido em DMEM sem vermelho de fenol que é perfundido com 95% de oxigênio e dióxido de carbono de 5% e aquecido a 37 ° C. Usando essa abordagem, podemos estudar os eventos necessários para a geração de um repertório diversificado de células T.

Nós apresentamos o passo-a-passo para a geração de quimeras neonatal, bem como a dissecação e preparação do timo ex vivo de imagens por 2-Photon Microscopia.

Na imagem situ da Thymus Mouse Usando 2-Photon Microscopia

A microscopia de dois fótons (TPM) permite a imagem de camadas profundas do timo e a documentação de eventos importantes para o desenvolvimento dos timócitos. Para acompanhar o...

A imagem por dois fótons é útil para a imunologia porque nos permite acompanhar a migração de uma única célula enquanto ela encontra seu ambiente. Ao acompanhar a migração no timo, utilizando microscopia de dois fótons, podemos caracterizar o mecanismo da seleção positiva e negativa.Olá, sou Ina Lottie do laboratório da Dra. Ellen Roby na Universidade da Califórnia em Berkeley. E sou Paul Herzmark, também do laboratório de Ellen Roby. Hoje vamos mostrar a vocês como realizamos a imagem in situ de tecido timo, e vou mostrar como podemos usar nosso microscópio de dois fótons para imagens do timo.E mostrarei os passos que levam à imagem por dois fótons. Isso inclui os seguintes procedimentos: isolamento de células-tronco hematopoiéticas da medula óssea, transferência adotiva de células da medula óssea para neonatos, dissecção e bissecção do timo, e o preparo do tecido para imagem por microscopia de varredura a laser de dois fótons. Então, vamos começar.Antes de prepararmos o timo para imagem, devemos primeiro transferir adotivamente células da medula óssea para um camundongo neonatal. Essas células da medula óssea foram isoladas das patas traseiras de camundongos transgênicos que expr

in-situ-imaging-of-the-mouse-thymus-using-2-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Dois fótons de imagem revelou motilidade linfócitos e interações celulares dentro do nó de linfa em condições basais e durante uma resposta imune 1. Aqui, demonstramos transferência adotiva de células T, o isolamento dos gânglios linfáticos, e motilidade de imagens de células CD4 + T no linfonodo explantado.

Dissecção e 2-Photon Imagens de linfonodos periféricos em ratos

Nós descrevemos um método para visualizar repetidamente microglia murino e monócitos...

A Técnica de Janela crânio-fino para Crônica de dois fótons In vivo Imaging da Microglia murino em Modelos de Neuroinflammation

Nós desenvolvemos novas ferramentas de laboratório e protocolos para aquisição de imagens intravital do timo. Nossa técnica deve ajudar na identificação de "nichos" dentro do timo, onde o desenvolvimento de células T ocorre.

Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia

A imagem de lapso de tempo no animal vivo fornece informações valiosas sobre a reorganização estrutural no cérebro intacto. Aqui, apresentamos uma preparação de crânio afinado que permite imagens transcranianas de estruturas sinápticas marcadas com fluorescência no córtex de camundongo vivo por microscopia de dois fótons.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

O objetivo do protocolo é mostrar longitudinal intravital acompanhamento em tempo real de timócitos por laser, microscopia em implantes do timo na câmara anterior do olho do rato. A transparência da córnea e vascularização do enxerto permitem gravar continuamente recrutamento de células progenitoras e egresso de células T maduro.

No Vivo controle de timócitos na Câmara Anterior do olho a Laser, microscopia eletrônica de varredura em tempo real

Neste estudo, apresentamos um protocolo para executar dois fotões intravital imagem e célula interação análise na mucosa traqueal murino após infecção com vírus da gripe. O presente protocolo será relevante para pesquisadores estudando a dinâmica de células imunes durante infecções respiratórias.

Interação de célula de imagem latente na Mucosa traqueal durante a infecção de vírus de Influenza usando microscopia Intravital dois fotões

As alterações morfológicas ocorrem em células de fibroblastos imunes responsivos após a ativação e promovem alterações no recrutamento celular. Utilizando a imagem latente do Photon 2 conjuntamente com uma proteína fibroblástica-específica geneticamente projetada 1 (FSP1)-CRE; tdtomato floxed-parar-floxed (TB/TB) linha do mouse e verde cDNAs Tagged lipopolissacarídeo-FITC, podemos ilustrar a captação altamente específica de lipopolissacaríno em fibroblastos dérmicos e alterações morfológicas in...

In vivo duas cores 2-Photon Imaging de células de repórter geneticamente marcadas na pele

O presente protocolo descreve um procedimento de radiologia intervencionista estabelecido para injeção intratímica em camundongos para evitar o risco de cirurgia aberta e melhorar a precisão das injeções percutâneas cegas.

Uma técnica minimamente invasiva, precisa e eficiente para injeção intratímica em camundongos

Aqui, apresentamos um protocolo para obter imagens intravitais do pulmão esquerdo de camundongo transplantado usando microscopia de dois fótons. Isso representa uma ferramenta valiosa para estudar a dinâmica e as interações celulares em tempo real após o transplante de pulmão murino.

Microscopia intravital de dois fótons do pulmão de camundongo transplantado

Este protocolo contém uma descrição detalhada de uma abordagem passo a passo para um modelo de camundongo crônico de janela craniana e embolia microvascular, otimizado para imagens in vivo por microscopia de dois fótons usando microsferas fluorescentes de poliestireno.

Modelo de camundongo com embolia microvascular para microscopia in vivo de dois fótons usando microesferas fluorescentes de poliestireno

Este estudo apresenta uma abordagem in vivo de imagem de dois fótons para visualizar as estruturas dos terminais axônicos de mecanorreceptores de baixo limiar (LTMR) na pele da pata dianteira de camundongos. Utilizando imagens repetidas e de alta resolução de axônios individuais, esse método oferece uma nova plataforma para estudar a estrutura e a função do circuito sensorial cutâneo durante o desenvolvimento e em adultos.

Imagem Intravital de Dois Fótons da Morfologia do Axônio Sensorial de Toque em Pele de Camundongos

Aprenda a gerar quimeras neonatais e preparar tecido timico para imagem ex vivo usando microscopia de 2-fotons. Este metodo permite observar a migracao celular no timo de camundongos.

Na imagem situ da Thymus Mouse Usando 2-Photon Microscopia

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