Na imagem situ da Thymus Mouse Usando 2-Photon Microscopia

Imagem de dois fótons É útil para imunologia porque nos permite acompanhar a migração de uma única célula à medida que ela encontra seu ambiente. Seguindo a migração do site tímico. Usando microscopia de dois fótons, podemos caracterizar o mecanismo de seleção positiva e negativa.

Olá, sou Ina Lottie do laboratório da Dra. Ellen Roby na Universidade da Califórnia em Berkeley. E eu sou Paul Herzmark, também do laboratório de Ellen Robbie. Hoje vamos mostrar como fazemos imagens in situ do tecido do timo, e vou mostrar como podemos usar nosso microscópio de dois fótons para obter imagens do timo.

E eu vou te mostrar os passos que levaram à imagem de dois fótons. Isso inclui os seguintes procedimentos, isolamento de células-tronco hematopoiéticas da medula óssea, transferência adotiva de células da medula óssea para neonatos, dissecção e bissecção do timo, preparação do tecido para imagem por microscopia de varredura a laser de dois fótons. Então vamos começar.

Antes de podermos preparar o timo Para a imagem, devemos primeiro transferir adotivamente as células da medula óssea para um camundongo neonatal. Essas células da medula óssea foram isoladas das patas traseiras de camundongos transgênicos que expressam GFP de forma ubíqua. Esta é uma seringa de insulina com 50 microlitros de medula óssea.

Fazemos duas a quatro injeções em hospedeiros com três a sete dias de idade, usando medula óssea de um doador para cada filhote injetado. E aqui temos um filhote de cinco dias, aperte a pele para trás para evitar que o filhote se mova durante a injeção e para manter a pele no topo. Procure um local de injeção abaixo dos pulmões e da caixa torácica, mas acima do intestino e do estômago.

Ao injetar, afrouxe o aperto na pele para permitir que ela se expanda. Por fim, remova lentamente a seringa para limitar a quantidade de medula óssea perdida. Esses camundongos poderão se desenvolver por quatro a seis semanas e, em seguida, o timo poderá ser removido para exames de imagem.

Após quatro a seis semanas, o timo pode ser removido. Para imagens, usarei um conjunto de pinças e tesouras grandes, bem como um conjunto de pinças e tesouras pequenas. Portanto, essa massa foi sacrificada de acordo com nosso protocolo de uso animal e pulverizada com etanol.

E vou usar a pinça grande para beliscar a pele e fazer uma incisão na linha média. Agora posso usar a tesoura para cortar a linha média ou posso arrancar a pele do peritônio e vou prender a pele para expor a cavidade torácica. E vou usar o esterno para segurar enquanto corto o peritônio e entro na cavidade torácica através do diafragma e depois corto ao longo das laterais da caixa torácica.

E você pode ver o timo bem em cima do coração. Vou colocá-los de volta. Então há o timo.

Vou evitar tocá-lo. Você usa a pinça menor, ainda segura o tecido ao redor do timo. Ok, agora vou borrifá-lo com um pouco de PBS e começar a remover um pouco do excesso de tecido.

Então, vou usar o tecido ao redor do timo para segurar. Quando estou limpando o timo, vou tirar o excesso de tecido, cortando-o com cuidado. Agora, existem dois lóbulos no timo que também temos que separar enquanto o limpamos.

Mas primeiro vou remover todos esses vasos sanguíneos extras que ficam na superfície do timo. Tenho muito cuidado para não perturbar a arquitetura do timo que vamos fotografar. Então, estou apenas puxando o tecido que está bem na superfície.

Agora vou começar a separar os dois lóbulos. Este é o lobo ventral e o lobo dorsal que vamos separar e cortar suavemente o tecido, separando-os. Não queremos que o tecido seque, então vamos esguichar um pouco de PBS nele.

Agora eu separei os dois lóbulos. Portanto, este é o lobo dorsal, que tem uma forma característica de guitarra. E este é o lobo ventral bem aqui.

Vou limpar o excesso de tecido de cada um desses lobos para que a área de imagem fique livre de excesso de tecido. Mas vou deixar um pouco de tecido para segurarmos o thys. Quando estivermos fazendo imagens, faremos imagens desse excesso de tecido, o que realmente não é necessário, e isso melhorará nossa qualidade de imagem removendo-o.

Então, agora temos nossos dois lóbulos divididos em duas partes que estão prontos para serem montados em uma lamínula para geração de imagens. Para preparar o timo dividido para imagens, você precisará de um pouco de adesivo de tecido veterinário e lamínulas de 18 por 18. Eu gosto de usar um petman de cachimbo para colocar uma fração de microlitro de cola na lamínula.

Então, vou colocar uma gota de cola que tem aproximadamente o comprimento do timo que vamos fotografar. E então eu gosto de espalhar por aí. Então, se for a largura do timo, novamente, vou colocar os dois lóbulos na mesma lamínula.

Então, vou colocar outro aqui. Então, vou pegar o lóbulo do excesso de tecido e colocá-lo na lamínula e arrastá-lo para a área onde está a cola. Vou fazer o mesmo com o outro lóbulo, novamente, tocando contra a lamínula onde não há cola para firmar minha mão e, em seguida, colocando o outro globo tímico na lamínula.

Agora que anexamos os dois globos tímicos à lamínula, vamos passá-la para Paul para obter imagens. Obrigado Ina. Vamos pegar essa amostra e colocá-la no meio DME que usaremos para criar imagens.

Portanto, esta é a nossa configuração de microscópio de dois fótons. A microscopia de dois fótons é muito boa para obter imagens de células imunes porque você pode olhar profundamente no timo e ver as células fluorescentes se movendo. Ele usa um laser infravermelho de pulso para fazer as células fluorescerem.

E temos em nosso microscópio de cinto doméstico quatro câmeras diferentes que nos permitem visualizar simultaneamente quatro cores diferentes e usa uma lente objetiva especial, que é uma ampliação de 20x. E é uma lente especial que mergulha no meio DME em que submergimos o timo, e que permite que ele tenha um 0,95 na, o que é muito bom, tornará nossas células muito brilhantes. Para manter o tecido saudável, borbulhamos 95% de oxigênio e 5% de CO2 através do meio DMEM.

De lá, é bombeado para a câmara de perfusão, onde é aquecido a 37 graus, e é aí que os lobos do timo ficam submersos. Com este sistema, podemos manter as células do timo saudáveis por quatro horas de imagem. Então eu mostrei como configurar a imagem para o microscópio de dois fótons.

Agora vamos dar uma olhada em alguns dos nossos resultados neste filme que está em loop. Você pode ver o timo que fotografamos em quatro cores diferentes aqui. Os vermelhos são os vasos sanguíneos do timo e os amarelos são células dendríticas do hospedeiro que expressam a proteína fluorescente amarela sob o controle de um promotor específico de células dendríticas.

Os timócitos azuis e verdes que você vê aqui são de dois doadores diferentes que usamos para fazer uma quimera neonatal usando uma técnica de transferência adotiva que Ena mostrou anteriormente. As células verdes são timócitos que expressam proteína fluorescente verde, e as células azuis são timócitos do donut que expressava a proteína fluorescente ciano. Este é o mesmo filme em loop que mostrei antes, mas quero mostrar a tridimensionalidade dos conjuntos de dados que coletamos para obter esses filmes.

Nós nos concentramos em um avião e tiramos uma imagem e depois focamos um pouco mais fundo e tiramos outra imagem e um pouco mais fundo em outra imagem. E então, para este filme, descemos cerca de 60 mícrons e repetimos esse volume de imagens uma vez a cada 30 segundos para obter o volume em movimento. E este filme foi feito em cerca de 20 minutos.

Assim, podemos rastrear as células através de três dimensões ao longo do tempo. Acabamos de mostrar como visualizamos o timo usando duas microscopias fotográficas. Os aspectos mais importantes deste procedimento são um, injetar nos recém-nascidos medula óssea de doadores.

Dois, dissecando e bi, dissecando o timo sem danificar sua estrutura. Três, prendendo firmemente o timo a uma lamínula quatro imagens usando um microscópio de dois fótons. A imagem no timo pode responder a muitas perguntas sobre o desenvolvimento dos timócitos e a geração de um repertório diversificado de células T.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.