Na imagem situ da Thymus Mouse Usando 2-Photon Microscopia

Resumo

Nós apresentamos o passo-a-passo para a geração de quimeras neonatal, bem como a dissecação e preparação do timo ex vivo de imagens por 2-Photon Microscopia.

Resumo

Microscopia de dois fótons (TPM) nos permite imagem profundamente no timo e documentar os eventos que são importantes para o desenvolvimento timócito. Para acompanhar a migração de indivíduos em uma multidão de timócitos, geramos quimeras neonatal, onde menos de um por cento dos timócitos são derivados de um doador que é transgênico para expressar uma proteína fluorescente ubiquitously. Para gerar estas quimeras parcial hematopoéticas, os destinatários neonatal são injetados com medula óssea entre 3-7 dias de idade. Após 4-6 semanas, o rato é sacrificado e do timo é cuidadosamente dissecado e bissected preservar a arquitetura do tecido que será trabalhada. O timo é colado em uma lamela em preparação para ex vivo de imagens por TPM. Durante a gravação do timo é mantido em DMEM sem vermelho de fenol que é perfundido com 95% de oxigênio e dióxido de carbono de 5% e aquecido a 37 ° C. Usando essa abordagem, podemos estudar os eventos necessários para a geração de um repertório diversificado de células T.

Protocolo

Transferência adotiva

Injetar recém-nascidos com 50 100ul de medula óssea usando uma seringa de insulina 2-4 vezes durante os primeiros 3-7 dias de vida, com uma relação de doadores para hospedar-final de 1:1. Apontar para um local da injeção abaixo do esterno e costelas, mas acima do intestino e estômago. Inserir a agulha longe o suficiente para penetrar no peritônio, cuidado para não perfurar o diafragma. Não é incomum para alguns de medula óssea para ser perdido durante a injecção. Você pode reduzir a perda soltando o seu domínio sobre o cachorro como você injetar, de modo a permitir que a pele a se expandir e, em seguida, lentamente, retirar a agulha.

Discussão

Imagem de dois fótons no timo nos permite examinar em que vivem, órgãos intactos as interações e as migrações que fundamentam eventos de seleção dentro do timo.

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