Name: Um Protocolo Eficiente para Análise CUT and RUN de Células Satélites de Camundongos Isoladas por FACS (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprenda a isolar células satélite de músculo de camundongo por FACS para análise CUT&RUN. Este protocolo eficiente permite estudar regulação transcricional em células progenitoras musculares in vivo.

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Agradecemos a Anastasia Bannwarth por fornecer excelente assistência técnica. Agradecemos ao biotério do IGBMC, à cultura de células, ao Instituto Clínico de Camundongos (ICS, Illkirch, França), à imagem, à microscopia eletrônica, à citometria de fluxo e à plataforma GenomEast, membro do consórcio 'France Génomique' (ANR-10-INBS-0009).
Este trabalho do Instituto Temático Interdisciplinar IMCBio, como parte do programa ITI 2021-2028 da Universidade de Estrasburgo, CNRS e Inserm, foi apoiado pela IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) e pelo projeto SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) e EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) no âmbito do Programa Francês de Investimentos para o Futuro. Financiamento adicional foi entregue pelo INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), AFM-Téléthon programa estratégico 24376 (para D.D.), INSERM bolsa para jovens pesquisadores (para D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT, e um fundo estatal francês gerido pela ANR no âmbito do programa-quadro Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. foi apoiado pelo Programa CDFA-07-22 da Université franco-allemande e Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation, e K.G. pela Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI).

Isolamento de células satélites dos músculos dos membros de camundongos e análise de citometria de fluxo

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle%3A+a+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle: a brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
<li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+skeletal+muscle%3A+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+progenitor+cells+and+the+role+of+Pax+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes.</a> Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).</li>
<li>Tosic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lsd1+regulates+skeletal+muscle+regeneration+and+directs+the+fate+of+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 366(2018).</li>
<li>Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche+regulation+of+muscle+satellite+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).</li>
<li>Collins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+function%2C+self-renewal%2C+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li>
<li>Robinson, D. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+elongation+factor+regulates+muscle+progenitor+expansion+for+efficient+myofiber+repair+and+stem+cell+pool+repopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation.</a> Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+fixation+redefines+quiescence+and+early+activation+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells.</a> Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).</li>
<li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT%26RUN%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85(2019).</li>
<li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+CUT%26RUN+chromatin+profiling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Improved CUT&RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, (2019).</li>
<li>Gunther, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myf5-positive+satellite+cells+contribute+to+Pax7-dependent+long-term+maintenance+of+adult+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).</li>
<li>Donlin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+high-dimensional+analysis+of+cells+dissociated+from+cryopreserved+synovial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue.</a> Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139(2018).</li>
<li>Rico, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+cell+doublet+profiles%3A+Comparison+of+light+scattering+with+fluorescence+measurement+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques.</a> Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).</li>
<li>Schreiber, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+NEUROG3+occupancy+in+the+human+pancreatic+endocrine+gene+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network.</a> Molecular Metabolism. 53, 101313(2021).</li>
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<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+calling+by+Sparse+Enrichment+Analysis+for+CUT%26RUN+chromatin+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling.</a> Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42(2019).</li>
<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).</li>
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<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Atlas+2021+update%3A+a+data-mining+suite+for+exploring+epigenomic+landscapes+by+fully+integrating+ChIP-seq%2C+ATAC-seq+and+Bisulfite-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data.</a> Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).</li>
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<li>Billas, I., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+controls+of+nuclear+receptor+function+in+the+regulation+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).</li>
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<li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 6, 35(2016).</li>
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<li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+skeletal+muscle+for+flow+cytometric+characterization+of+immune+cells+in+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques.</a> Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).</li>
<li>Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+tissue+residency+of+lymphocytes+in+the+murine+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 8, 250(2017).</li>
<li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665(2019).</li>
</ol>

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

O presente estudo relata um método padronizado, confiável e de fácil execução para o isolamento e cultivo de células satélites de camundongos, bem como a avaliação da regulação transcricional pelo método CUT&RUN.
Este protocolo envolve várias etapas críticas. O primeiro é a ruptura muscular e digestão de fibras para garantir um alto número de células coletadas. Apesar do aumento da concentração enzimática, mais células vivas foram obtidas do que usando o Protocolo 1. As células satélites expre...

Os músculos estriados esqueléticos representam, em média, 40% do peso total do corpo humano1. As fibras musculares exibem notável capacidade de regeneração após a lesão, que é descrita pela fusão de miócitos neoformados e pela geração de novas miofibras que substituem aslesadas2. Em 1961, Alexander Mauro relatou uma população de células mononucleares que denominou como células satélites3. Essas células-tronco expressam o fator de transcrição pareado caixa 7 (PAX7) e estão localizadas entre a lâmina basal e o sarcolema das fibrasmusculares4. Foi relatado que eles expressam o cluster de diferenciação 34 (CD34; um marcador hematopoiético, progenitor endotelial e de células-tronco mesenquimais), integrina alfa 7 (ITGA7; um marcador liso, cardíaco e músculo esquelético), bem como o receptor de quimiocina C-X-C tipo 4 (CXCR4; um marcador de linfócitos, hematopoiéticos e células satélites)5. Em condições basais, as células satélites residem em um microambiente particular que as mantém em estadoquiescente6. Com o dano muscular, tornam-se ativados, proliferam e sofrem miogênese7. No entanto, contribuindo apenas para uma pequena fração do número total de células musculares, suas análises genômicas são particularmente desafiadoras, especialmente em ambientes fisiológicos (<1% do total de células).
Vários métodos para isolamento de cromatina a partir de células satélites têm sido descritos, os quais envolvem imunoprecipitação da cromatina seguida de sequenciamento paralelo maciço (ChIP-seq) ou clivagem sob alvos e experimentos de tagmentação (CUT&Tag). No entanto, essas duas técnicas apresentam algumas limitações significativas que permanecem incontestadas. De fato, ChIP-seq requer uma alta quantidade de material de partida para gerar cromatina suficiente, uma grande proporção da qual é perdida durante a etapa de sonicação. CUT&Tag é mais apropriado para baixo número de células, mas gera mais locais de clivagem fora do alvo do que ChIP-seq devido à atividade de transposição Tn5. Além disso, como essa enzima tem alta afinidade por regiões de cromatina aberta, a abordagem CUT&Tag pode ser preferencialmente usada para analisar modificações de histonas ou fatores de transcrição associados a regiões ativamente transcritas do genoma, em vez de heterocromatina silenciada 8,9.
Apresenta-se aqui um protocolo detalhado que permite o isolamento de células satélites musculares de membros de camundongos por FACS para clivagem sob alvos e liberação utilizando análise de nucleases (CUT&RUN)10,11. As várias etapas envolvem a ruptura mecânica do tecido, a classificação celular e o isolamento dos núcleos. A eficiência do método, no que se refere à preparação de uma suspensão celular viável, foi demonstrada através da análise CUT&RUN para modificações de histonas covalentes e fatores de transcrição. A qualidade das células isoladas torna o método descrito particularmente atraente para a preparação de cromatina que captura fielmente o estado de ocupação genômica nativa, e é provável que seja adequado para capturar a conformação cromossômica em combinação com o sequenciamento de alto rendimento em loci específicos (4C-seq) ou em níveis genômicos amplos (Hi-C).

<table><tbody><tr><td>Microtubo de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>2080422</td><td></td></tr><tr><td>Microtubo de 2 mL</td><td>Star Lab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 5 mL</td><td>CORNING-FALCON</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>anti-AR</td><td>abcam</td><td>ab108341</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD11b</td><td>eBioscience</td><td>25-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD31</td><td>eBioscience</td><td>12-0311-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34</td><td>eBioscience</td><td>48-0341-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td></td></tr><tr><td>anti-CXCR4</td><td>eBioscience</td><td>17-9991-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-DMD</td><td>abcam</td><td>ab15277</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3K27ac</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>Motivo Ativo anti-H3K4me2</td><td></td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>anti-ITGA7</td><td>MBL</td><td>k0046-4</td><td></td></tr><tr><td>anti-PAX7</td><td>DSHB</td><td>AB_528428</td><td></td></tr><tr><td>anti-TER119</td><td>BD Pharmingen TM</td><td>553673</td><td></td></tr><tr><td>Beads</td><td>Polysciences</td><td>86057-3</td><td>BioMag&reg; Plus Concanavalin A</td></tr><tr><td>Cell Strainer 100 &micro; m</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td></td><td></td>431752</tr><tr><td>Filtro de Células 40 &micro; m</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Células 70 &micro; m</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td></td><td></td>431751</tr><tr><td>Centrífuga 1</td><td>Eppendorf</td><td>521-0011</td><td>Centrífuga 5415 R</td></tr><tr><td>Centrífuga 2</td><td>Eppendorf</td><td>5805000010</td><td>Centrífuga 5804 R</td></tr><tr><td>Sistema de Deslizamento de Câmara&nbsp;</td><td>Sistema ThermoFischer</td><td>171080</td>;<td> me Nunc&trade; Lab-Tek&trade; Agente de limpeza de corrediças de câmara</td></tr><tr><td></td><td>Sigma&nbsp; &nbsp;</td><td>SLBQ7780V</td><td>RNaseZAPTM</td></tr><tr><td>Colagenase, tipo I&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17100017</td><td>10 mg/mL</td></tr><tr><td>Dispase&nbsp;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>7913</td><td>5 U/mL</td></tr><tr><td>DynaMag&trade;-2 Aimant</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mancha de Viabilidade Fixável</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de Fluxo</td><td>BD FACSAria&trade; Citômetro de Fluxo de Fusão</td><td>23-14816-01</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G com DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td><td></td></tr><tr><td>Navegador de genoma&nbsp;</td><td>IGV</td><td></td><td>http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td></tr> <tr><td>Glicerol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogel</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td>354277</td><td>Matriz qualificada Matrigel hESC</td></tr><tr><td>Software de processamento de imagem</td><td>Image J&reg;</td><td></td><td>V 1.8.0</td></tr><tr><td>Filme de laboratório</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>PARAFILM&reg; M</td></tr><tr><td>Liberase LT</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Galato de propil</td><td>Sequenciador Sigma-Aldrich</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Illumina Hiseq 4000</td><td>SY-401-4001</td><td></td></tr><tr><td>Banho de água agitado</td><td>Bioblock Polytest científico 20</td><td>18724</td><td></td></tr></tbody></table>

um protocolo eficiente para análise cut&amp;run de células satélites de camundongos isoladas por facs

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Análises genômicas amplas com populações de pequenas células são uma grande restrição para estudos, particularmente no campo de células-tronco. Este trabalho descreve um protocolo eficiente para o isolamento de células satélites do músculo do membro ativado por fluorescência (FACS), um tecido com alto conteúdo de proteínas estruturais. Os músculos dos membros dissecados de camundongos adultos foram mecanicamente interrompidos pela picagem em meio suplementado com dispase e colagenase tipo I. Após a digestão, o homogeneizado foi filtrado através de filtros celulares, e as células foram suspensas em tampão FACS. A viabilidade foi determinada pela coloração de viabilidade fixável, e as células satélites imunomarcadas foram isoladas por FACS. As células foram lisadas com Triton X-100 e os núcleos liberados foram ligados a esferas magnéticas de concanavalina A. Complexos núcleo/grânulo foram incubados com anticorpos contra o fator de transcrição ou modificações de histonas de interesse. Após as lavagens, os complexos núcleo/grânulo foram incubados com a proteína A-micrococcal nuclease, e a clivagem da cromatina foi iniciada com CaCl2. Após a extração do DNA, bibliotecas foram geradas e sequenciadas, e os perfis para ligação do genoma amplo ao fator de transcrição e modificações covalentes de histonas foram obtidos por análise bioinformática. Os picos obtidos para as várias marcas de histonas mostraram que os eventos de ligação foram específicos para células satélites. Além disso, a análise de motivos conhecidos revelou que o fator de transcrição estava ligado à cromatina através de seu elemento de resposta cognato. Este protocolo é, portanto, adaptado para estudar a regulação gênica em células satélites musculares de membros de camundongos adultos.

Células satélites de músculos esqueléticos de camundongos foram isoladas pela combinação dos protocolos de Gunther et al.12 e Liu et al.23 (doravante Protocolo 2). Como as fibras musculares não digeridas foram observadas após a digestão quando se utilizou a concentração de colagenase e dispase proposta no Protocolo 1, a quantidade de enzimas foi aumentada para melhorar a dissociação das fibras musculares, conforme descrito nas etapas 1.2.1 e 1.2.3. Conforme indicado no Prot...

Apresenta-se aqui um eficiente protocolo para o isolamento de células satélites de músculo de membros de camundongos (FACS) adaptado ao estudo da regulação da transcrição em fibras musculares por clivagem sob alvos e liberação utilizando nuclease (CUT&RUN).

Um Protocolo Eficiente para Análise CUT&amp;RUN de Células Satélites de Camundongos Isoladas por FACS

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

Há mais de 20 anos, nosso laboratório está interessado no papel fisiopatológico dos receptores nucleares. Para decifrar sua função in vivo, projetamos modelos de camundongos que permitem o controle espacial e temporal de sua expressão. Paralelamente, desenvolvemos técnicas de ponta para investigar sua função molecular nos tecidos de camundongos.Nosso interesse científico recentemente nos levou a determinar a sinalização de receptores de secosteroides e esteroides em vários tecidos, incluindo o músculo esquelético. Recentemente, demonstramos que o receptor de andrógeno nas miofibras que diferenciam as células do músculo esquelético é fundamental em suas funções contráteis e metabólicas. Nossos resultados recentes fornecem uma compreensão mais profunda da dinâmica fisiopatológica do músculo esquelético que é crucial para desenvolver tratamentos eficazes para distúrbios associados ao músculo.Desenvolvemos este protocolo para poder realizar a análise de ciestroma em células-tronco musculares in vivo. Todos os protocolos anteriores utilizavam modais in vitro, o que dissocia completamente a investigação de todo um contexto do organismo. Além de ser de baixo custo e eficiente em termos de tempo, este protocolo fornece um ambiente experimental eficaz para estudar o recrutamento de fatores de transcrição e a paisagem da cromatina em células progenitoras do músculo esquelético.A cromatina preparada por este protocolo proporcionou a primeira análise genômica ampla do estromeu AR em células satélites, e facilitará futuros estudos sobre regulação gênica. Entre muitos, nosso objetivo futuro seria estender essas investigações para outros receptores de oxosteroides e explorar seus co-reguladores específicos nos vários tipos celulares envolvidos no processo de regeneração no músculo esquelético.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O isolamento e cultura de uma população pura de células satélites quiescentes, uma população de células estaminais musculares, é essencial para a compreensão da haste músculo biologia celular e regeneração, bem como o transplante de células estaminais para terapias em distrofia muscular e outras doenças degenerativas.

Isolamento, cultura e transplante de células musculares satélite

Cardiomiócitos individuais de camundongos selvagens e mutantes podem ser isolados do coração para estudar sua contratilidade e transientes de cálcio. Isso permite caracterizar a contribuição da disfunção celular para a disfunção cardíaca por qualquer causa.

Isolamento e Fisiológica Análise de rato Cardiomyocytes

O comportamento dos fibroblastos está subjacente a um espectro de entidades clínicas, mas permanecem mal caracterizados, em grande parte devido à sua heterogeneidade inerente. A pesquisa tradicional de fibroblastos depende da manipulação in vitro, mascarando o comportamento dos fibroblastos in vivo. Descrevemos um protocolo baseado em FACS para o isolamento de fibroblastos de pele de camundongo que não requer cultura de células.

Isolamento de fibroblastos de murino Dérmica por FACS

Modelos murinos permitem estudar os principais mecanismos da arritmogênese. Para isso, cardiomiócitos de alta qualidade são necessários para a realização de medidas de patch-clamp. Aqui, é descrito um método para isolar miócitos murinos atriais e ventriculares via perfusão retrógrada de Langendorff baseada em enzimas, que permite medidas simultâneas de transientes de cálcio e corrente de cálcio tipo L.

Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

O método aqui apresentado resume protocolos otimizados para avaliação de bioenergésicos celulares em haste hematopoiéticas não aderentes e células progenitoras primitivas (HSPCs) utilizando o analisador de fluxo extracelular para medir a taxa de acidificação extracelular (ECAR) e a taxa de consumo de oxigênio (OCR) dos HSPCs em tempo real.

Avaliação de Bioenergésicos Celulares em Tronco Hematopoiético de Camundongos e Células Progenitoras Primitivas usando o Analisador de Fluxo Extracelular

CUT&amp;RUN e suas variantes podem ser usadas para determinar a ocupação de proteínas na cromatina. Este protocolo descreve como determinar a localização da proteína na cromatina usando uliCUT&amp;RUN unicelular.

Localização de fator unicelular em Chromatina usando decote de entrada ultra-baixa sob alvos e liberação usando nuclease

A identificação precisa de células progenitoras fibro-adipogênicas (FAPs) e células-tronco musculares (MuSCs) é fundamental para estudar sua função biológica em condições fisiológicas e patológicas. Este protocolo fornece diretrizes para o isolamento, purificação e cultura de FAPs e MuSCs de músculos de camundongos adultos.

FACS-isolamento e Cultura de Progenitores Fibro-Adipogênicos e Células-Tronco Musculares de Músculo Esquelético não perturbado e lesionado

Pesquisadores novos no campo epigenético encontrarão no CUT&amp;Tag uma alternativa significativamente mais fácil aos ensaios ChIP. A CUT&amp;Tag beneficiou tremendamente os estudos epigenéticos em populações de células raras e primárias, gerando dados de alta qualidade a partir de muito poucas células. Este protocolo descreve a realização de ensaios H3K4me1 CUT&amp;Tag em mioblastos de camundongos isolados de músculos posteriores de camundongos.

Usando o ensaio de clivagem sob alvos e marcação (CUT&#38;Tag) na pesquisa de mioblastos de camundongos

Este protocolo descreve um ensaio extracromossômico de junção final não homóloga (NHEJ) e um ensaio de recombinação homóloga (HR) para quantificar a eficiência de NHEJ e HR em células HEK-293T.

Análise da Eficiência de Junção de Extremidade Não Homóloga e Recombinação Homóloga em Células HEK-293T Usando Sistemas Reporter Baseados em GFP

Para obter perícitos corticais cerebrais de camundongo que atendam às demandas do scRNA-seq, apresentamos um protocolo FACS criticamente otimizado baseado na seleção CD13⁺/CD31⁻. Nossos principais aprimoramentos melhoram significativamente a viabilidade celular e a integridade do RNA, permitindo um perfil transcriptômico confiável.

Isolamento de Perícitos de Tecido Cortical de Camundongos Usando FACS para Sequenciamento de Células Únicas

Esse protocolo fornece um método padronizado para isolar e enriquecer mioblastos primários do músculo esquelético de camundongos adultos e neonatos por meio de dissociação tecidual, filtração sequencial, pré-placagem e condições definidas de cultura, possibilitando o estabelecimento e manutenção de culturas de mioblastas derivadas de células satélite para aplicações experimentais posteriores.

Isolamento de Células Satélites do Músculo Esquelético para Estudos de Miogênese In Vitro

Aprenda a isolar células satélite de músculo de camundongo por FACS para análise CUT&RUN. Este protocolo eficiente permite estudar regulação transcricional em células progenitoras musculares in vivo.

Um Protocolo Eficiente para Análise CUT&RUN de Células Satélites de Camundongos Isoladas por FACS

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