In vivo Imagem do cérebro inteiro de larvas de peixe-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional
28 de abril de 2023
Apresentamos aqui um protocolo para imagens in vivo de todo o cérebro de larvas de peixes-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional. O procedimento experimental inclui preparo da amostra, aquisição e visualização das imagens.
Estamos desenvolvendo sistemas imunológicos ópticos e algoritmos computacionais para registrar e analisar a neuroatividade de todo o cérebro com alta resolução espacial e temporal. O peixe de laboratório é um animal modelo ideal para pesquisa. Graças a cada transparência óptica e à disponibilidade de diversas ferramentas genéticas A qualidade óptica da imagem pode ser degradada devido à aberração introduzida pelo gel de Agarose usado para a montagem da amostra, e os peixes podem se mover durante a gravação causando artefatos de movimento nas imagens ou impedindo a extração do sinal de precisão das imagens.
Protocolos disponíveis publicamente fornecem apenas uma breve visão geral do procedimento experimental, vivendo partes substanciais dos detalhes, como solidificação de agarose, técnicas de montagem precisas e posicionamento simples. Portanto, um protocolo eficaz e reprodutível é necessário para a aquisição de dados de imagem de alta qualidade. Com o mínimo de ruído e movimento.
Nosso protocolo fornece um procedimento experimental otimizado e reprodutível. Este protocolo permite imagens in vivo de todo o cérebro por um período prolongado e visualizações dos dados de imagem adquiridos. O fluxo de trabalho se concentrou em imagens de todo o cérebro, mas pode ser facilmente aplicado a imagens de outros órgãos de muitos de nossos peixes-zebra.
Nosso objetivo é desvendar os princípios subjacentes da computação neural. Para isso, continuaremos a trabalhar em um pipeline que envolve imagens em larga escala da atividade e estrutura neural, e análise computacional de tais para mapeamento cerebral sistemático.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para a imagem cerebral completa in vivo de larvas de peixe-zebra utilizando microscopia de fluorescência tridimensional. O modelo de peixe-zebra é amplamente utilizado devido à sua transparência óptica e acessibilidade genética para o estudo do processamento neural e da atividade neuronal. O protocolo aborda problemas comuns, como artefatos de movimento e aberrações no gel de agarose, assegurando a aquisição de dados de imagem de alta qualidade.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biofísica
- Técnicas de Imagem
Contexto
- Peixes-zebra larvais são um modelo essencial para estudos de neuroatividade devido à sua transparência.
- Desafios significativos incluem aberrações provocadas pelo gel de agarose e artefatos de movimento durante a aquisição de imagens.
- Os protocolos atuais não possuem etapas detalhadas para o posicionamento e montagem eficaz das amostras.
- A aquisição de imagens de alta resolução é fundamental para compreender o processamento neural.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo reprodutível para obtenção de imagens de alta qualidade da atividade cerebral de peixe-zebra.
- Reduzir ruídos e artefatos de movimento durante as sessões de aquisição de imagens.
- Facilitar o estudo da computação neural ao longo de períodos prolongados.
Métodos Utilizados
- A plataforma principal utilizada é a microscopia de fluorescência tridimensional.
- O modelo biológico envolve peixes-zebra larvais, preparados e imobilizados para a aquisição de imagens.
- Um fluxo de trabalho experimental otimizado é implementado para garantir artefatos mínimos.
- Os passos críticos incluem o posicionamento preciso dos peixes-zebra e os ajustes corretos dos parâmetros de imagem.
- A visualização dos dados adquiridos é realizada utilizando ferramentas de software como o napari.
Resultados Principais
- O protocolo de imagem permite a visualização abrangente de áreas cerebrais, incluindo estruturas neuronais do prosencéfalo, mesencéfalo e rombencéfalo.
- A atividade neuronal pode ser capturada por meio de imagens em série temporal, revelando insights significativos sobre as funções neurais.
- A visibilidade nítida de todas as regiões cerebrais indica a eficácia do protocolo.
Conclusões
- Este estudo demonstra uma nova abordagem de imagem que aprimora a compreensão da neuroatividade em peixe-zebra.
- O protocolo não apenas estabelece um padrão para o imageamento de peixe-zebra, mas também tem implicações para pesquisas neurais mais amplas.
- Espera-se que o desenvolvimento adicional de pipelines de imagem melhore os estudos de mapeamento cerebral e de computação neural.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem de fluorescência tridimensional do cérebro de larvas de peixe-zebra permite o mapeamento de alta resolução, in vivo, da estrutura e atividade neural, apoiando descobertas em neurociência na fase inicial. Este protocolo aborda a reprodutibilidade e a redução de artefatos, fornecendo uma base robusta para a desmistificação de mecanismos e validação de alvos em pesquisas neurobiológicas. Sua adaptabilidade e saídas quantitativas o posicionam como uma capacidade reutilizável para pipelines empresariais de P&D focados na análise de circuitos neurais e na triagem funcional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação sistemática de vias neurais e atividade celular em um modelo vertebrado.
- Apóia a desmistificação biológica ao minimizar artefatos de movimento e aberrações de imagem.
- Facilita a confiança preditiva na identificação de alvos neurais por meio de dados quantitativos de todo o cérebro.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara amostras de peixe-zebra imobilizadas e validadas para fluxos de trabalho de imagem reprodutíveis.
- Padroniza parâmetros de imagem e posicionamento das amostras para garantir a consistência do ensaio.
- Gera dados quantitativos volumétricos e em séries temporais adequados para análise e triagem posteriores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Oferece um sistema vertebrado relevante para a doença na mapeamento funcional de circuitos neurais.
- Permite a continuidade do imaging de descoberta ao desenvolvimento de modelos pré-clínicos para compostos neuroativos.
- Apoia o avanço ajustado ao risco ao fornecer saídas de imagem com alto conteúdo e reprodutíveis.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de imagem se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico, permitindo testes de hipóteses, mapeamento de vias e análise quantitativa em modelos de neurociência vertebrados.
- Biologia da Descoberta: Apoia o mapeamento orientado por hipóteses da atividade e estrutura neural com resolução celular.
- Triagem: Fornece saídas de imagem quantitativas e reprodutíveis para estudos com compostos ou perturbações genéticas.
- Análises: Oferece conjuntos de dados volumétricos e em séries temporais para análise computacional e comparação entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se ao desenvolvimento de modelos pré-clínicos ao permitir a imagem funcional em um sistema vertebrado.
- Reutilização Empresarial: O protocolo é adaptável para a obtenção de imagens de outros órgãos ou sistemas em peixes-zebra larvais, favorecendo a escalabilidade da plataforma.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos neurais.
- Valor Operacional: Aprimora a reprodutibilidade e a padronização entre experimentos de imagem.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avançar/não avançar e a eficiência do capital em portfólios de neurociência.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos neurais e ensaios funcionais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manejo, imobilização e microscopia de fluorescência de peixes-zebra.
- Exige acesso a plataformas de imagem confocal ou personalizadas de fluorescência e ferramentas computacionais de análise.
- Necessita padronização entre equipes dos parâmetros de preparação de amostras e aquisição de imagens.
- Pode ser adaptado a outros órgãos de larvas de peixe-zebra, mas pode exigir otimização do protocolo para diferentes tecidos.
- Limitações potenciais incluem artefatos de imagem provenientes do agarose e movimento caso a imobilização seja incompleta.
