Name: Alinhamento de Fibrogramas de Tomografia de Coerência Óptica com Luz Visível com Imagens Confocais da Mesma Retina de Camundongo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Aprenda a alinhar imagens de tomografia de coerência óptica com luz visível e confocal de retina de camundongo. Este método valida a morfologia dos feixes de axônios de células ganglionares retinianas in vivo.

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Este estudo é apoiado pela Fundação de Pesquisa em Glaucoma Shaffer Grant, 4-CA Cavalier Collaborative Award, R01EY029121, R01EY035088 e Knights Templar Eye Foundation.

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Virgínia e estão em conformidade com a diretriz sobre Uso de Animais do National Institute of Health (NIH). Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.
1. Imagem in vivo vis-OCT
<ol><li>O sistema vis-OCT<ol><li>Imagine os olhos dos ratos usando um pequeno sistema de animais vis-OCT que usa uma fonte de luz supercontínua, que fornece iluminação de luz visível entre 480 nm e 650 nm. Certifique-se de que a potência incidente na córnea é de 1 mW e use uma taxa de linha A de 25 kHz e um tempo de integração de 39,3 μs por linha A.</li>
		<li>Certifique-se de que a faixa de detecção espectral do espectrômetro esteja entre 508 nm e 613 nm, o que fornece uma resolução axial de 1,3 μm na retina. O volume total de imagem é de aproximadamente 700 μm (x) x 700 μm (y) x 1.500 μm (z). A resolução lateral está entre 4,5 μm no centro do campo de visão e 8,7 μm a 350 μm do centro11,13.</li>
	</ol></li>
	<li>Anestesia em camundongos<ol><li>Anestesiar camundongos de fundo C57BL/6 e ambos os sexos com uma injeção intraperitoneal de coquetel de Cetamina (114 mg/kg) e Xilazina (17 mg/kg) e dilatar suas pupilas usando gotas de tropicamida a 1%. Confirmar anestesia adequada por perda do reflexo pedal após um pinçamento firme dos dedos.</li>
		<li>Durante a geração de imagens, mantenha o mouse aquecido usando uma lâmpada de calor infravermelha. Após cada aquisição das imagens, aplicar lágrimas artificiais para evitar a desidratação da córnea.</li>
	</ol></li>
	<li>Posicionamento do mouse para obtenção de imagens<ol><li>Coloque o rato anestesiado no suporte do animal e mantenha o rato na posição com a ajuda de duas Velcro correias. NOTA: O suporte do animal permite o movimento em três dimensões (ajuste vertical, ajuste horizontal fino, bem como ajustes de passo e guiada) para colocar o laser no olho do mouse.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajuste dos parâmetros de imagem<ol><li>Ligue o computador e abra o software referenciado, que ligará o laser automaticamente.</li>
		<li>Ajuste o suporte do animal até que o laser esteja estável e centralizado no olho do rato. Visualize a parte posterior do olho através de uma visualização En Face na interface do software, o campo de visão (FOV) do plexo vascular superficial e um B-scan, a secção transversal da retina dentro do FOV.</li>
		<li>Adquira um volume vis-OCT clicando no botão Adquirir na interface do software depois de realizar pequenos ajustes do foco óptico, que consiste em 512 A-lines/B-scan e 512 B-scans/volume. Observação : esse processo leva ~ 10,5 s. A aquisição de imagens é guiada por um estimador de índice de qualidade (QI) embutido para garantir que imagens abaixo de um limiar pré-determinado (QI < 45) não sejam incluídas.<ol><li>Para cada rato, adquira quatro volumes vis-OCT do mesmo olho. Alinhe a cabeça do nervo óptico (ONH) em cada um dos quatro cantos do FOV para cobrir diferentes áreas da retina. NOTA: Esta colocação minimiza a curvatura da retina, o que maximiza a reflectância da CFNR ao longo do FOV. Requer ~1 min para reposicionar o olho entre cada aquisição (Figura 1A,B).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Análise Vis-OCTF NOTA: MATLAB é usado para executar análise de imagem.<ol><li>Para gerar fibrogramas vis-OCT a partir do volume vis-OCT, use um método de limiar baseado em intensidade (linha de código MATLAB 808) para detectar a superfície da retina. Observação : essas linhas usam a função imadjust para ajustar os valores de intensidade do bscan. O argumento [0,0087 0,08] passado para imadjust especifica o intervalo de intensidades a ser mapeado para o intervalo dinâmico completo da imagem de saída.</li>
		<li>Corte o RNFL selecionando o primeiro ~16 μm em profundidade. Consulte a linha de código Matlab 782. NOTA: A espessura RNFL in vivo típica em um camundongo C57BL/6 selvagem adulto é de ~14 μm e pode variar entre diferentes métodos de segmentação13.</li>
		<li>Altere os caminhos do arquivo RAW (linha 9), Arquivos para reconstrução (linha 11) e nome do arquivo (linha 15), clique em Executar e aguarde até que a imagem da OCT seja analisada pelo código MATLAB. Calcular a projeção de intensidade média ao longo da direção axial (z) (linhas de código MATLAB 905-908) para gerar a imagem de fibrograma composta por feixes axonais RGC e vasculatura circundante. Monte as quatro imagens após o processamento do fibrograma para cada FOV alinhando os vasos sanguíneos com um editor gráfico de escolha, cobrindo ~1,2 x 1,2 mm no total. Os arquivos RAW geralmente são salvos na pasta: Halo Data, sob a data da imagem da OCT (por exemplo, 0606 Opticent). Observação : os códigos MATLAB estão disponíveis no arquivo suplementar 1.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Imagem confocal ex vivo
<ol><li>Eutanásia em camundongos<ol><li>Após a aquisição dos dados vis-OCT, eutanasiar os camundongos com uma mistura de pentobarbital sódico (390 mg/mL) e fenitoína sódica (50mg/mL). A fenitoína sódica tem função amplificando os efeitos do pentobarbital sódico, que tem sido amplamente aplicado na eutanásia de roedores14,15. Para cada camundongo, utilizar 0,2 mL/20 g da mistura diluída (156 mg/mL) e perfundir com 20 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, 20 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% em PBS16,17.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissecção e orientação ocular<ol><li>Enuclear os olhos e fazer uma marca no lado temporal para indicar a orientação.</li>
		<li>Após a remoção cuidadosa da câmara anterior, a lente ocular, vítreo, e fixar os óculos em PFA por 30 min.</li>
		<li>Lave os óculos com PBS por 30 min e substitua a solução PBS 3x durante a lavagem. Em seguida, lavar com Triton X-100 a 0,5% em PBS (pH 7,5) por 30 min.</li>
		<li>Incubar as oculares em tampão de bloqueio (soro de burro a 5% com albumina de soro bovino a 2,5% e Triton X-100 a 0,5% em solução salina tamponada com Tris [pH 7,5]) por 2 h à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Imunomarcação NOTA: Os óculos estão agora prontos para serem corados com os anticorpos primários de camundongo anti-Tuj1 para detectar feixes de axônio RGC e rato anti-ICAM-2 para detectar vasos sanguíneos.<ol><li>Incubar os copos oculares durante a noite com os anticorpos primários, anti-Tuj1 de rato (1:200 em tampão de bloqueio) e anti-ICAM-2 de rato (1:500 em tampão de bloqueio), a 4 °C.</li>
		<li>Lave os óculos 3-5x por 1 h cada vez, com uma solução salina tamponada com fosfato contendo Triton X-100 a 0,5% (PBST) para minimizar o fundo e remover qualquer anticorpo não ligado.</li>
		<li>Após a lavagem, incubar os copos oculares durante a noite com os anticorpos secundários, burro anti-camundongo Imunoglobulina G conjugada ao corante Alexa Fluor 488 (fluorescência verde) e IgG anti-rato de burro conjugado ao corante Alexa Fluor 594 (fluorescência vermelha), todos diluídos 1:1000 em tampão de bloqueio, a 4 °C.</li>
		<li>No dia seguinte, lave os óculos 3-5x por 1 h cada com PBST para minimizar o fundo e remover o anticorpo não ligado.</li>
		<li>Transfira as oculares para uma placa de Petri de PBS antes da montagem plana.</li>
	</ol></li>
	<li>Retina plana<ol><li>Após o processo de imunomarcação, isole as retinas das oculares ao microscópio.</li>
		<li>Corte as retinas em quatro folhas e monte-as planas com a camada RGC virada para cima. Deixe a marca no lado temporal preso à retina para indicar a orientação.</li>
		<li>Cobrir as retinas com meiode montagem 13,18. Selar as lâminas com esmalte13,18,19.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagem confocal OBS: O processamento das imagens confocais foi realizado utilizando o software ZEN Microscopy.<ol><li>Ligue o microscópio confocal e, no modo Localizar, encontre a área de interesse usando a ocular do microscópio.</li>
		<li>No modo de aquisição, configure blocos para cobrir toda a retina e fatias z-stack para cobrir todas as camadas de informações. Imagem de pelo menos 25 blocos em toda a retina para cobrir o volume total de 5,99 mm (x) x 5,88 mm (y) x 30 μm (z) a um tamanho de pixel de 1,24 μm/pixel.</li>
		<li>Projetar os cortes Z-stack para criar imagens de microscopia confocal bidimensional en face (Figura 1C,D)11,13,19,20,21.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Alinhamento de imagens in vivo e ex vivo
<ol><li>Depois de processar o fibrograma, crie uma imagem composta que inclua as quatro imagens adquiridas de cada mouse, alinhando todos os vasos sanguíneos com um editor gráfico de escolha. NOTA: Em média, a imagem composta final é de aproximadamente 1,2 mm (x) x 1,2 mm (y), conforme mostrado na Figura 1B.</li>
	<li>Use a cabeça do nervo óptico (ONH) e o padrão dos vasos sanguíneos como pontos de referência para alinhar o fibrograma composto. Obter o alinhamento in vivo e ex vivo sobrepondo o padrão dos vasos sanguíneos das imagens compostas de OCT com as imagens confocais da mesma retina coradas com ICAM-2.</li>
</ol>

Alinhamento de Fibra de OCT de Retina de Camundongo com Imagens Confocais

<ol><li>Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+retinal+ganglion+cell+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Development of retinal ganglion cell structure and function.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).</li>
<li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+types+of+retinal+ganglion+cells%3A+current+status+and+implications+for+neuronal+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li>
<li>Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture%2C+function%2C+and+assembly+of+the+mouse+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Architecture, function, and assembly of the mouse visual system.</a> Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).</li>
<li>Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+function%2C+organization%2C+and+development+of+the+mouse+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus.</a> Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).</li>
<li>Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+glaucomatous+optic+neuropathy%3A+the+synergy+between+clinical+observation+and+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation.</a> Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).</li>
<li>Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glaucoma%3A+thinking+in+new+ways-a+role+for+autonomous+axonal+self-destruction+and+other+compartmentalised+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).</li>
<li>Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+injury+signaling+and+compartmentalized+injury+response+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769(2019).</li>
<li>Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-dependent+morphological+and+functional+degeneration+of+retinal+ganglion+cells+in+mouse+models+of+experimental+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nature+and+Science%22%5BJournal%5D)">Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma.</a> Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).</li>
<li>Tatham, A. J., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+structural+progression+in+glaucoma+with+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography.</a> Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).</li>
<li>Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visible-light+optical+coherence+tomography%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Visible-light optical coherence tomography: a review.</a> Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).</li>
<li>Miller, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy+for+quantitative+imaging+of+retinal+ganglion+cell+axon+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles.</a> Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).</li>
<li>Beckmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+inner+retinal+layer+structure+in+mice+after+eye-opening+using+visible-light+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography.</a> Experimental Eye Research. 211, 108756(2021).</li>
<li>Grannonico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+damages+in+retinal+ganglion+cell+axon+bundles+monitored+non-invasively+by+visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy.</a> Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).</li>
<li>Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+Injection+of+Ethanol+for+the+Euthanasia+of+Laboratory+Mice+%28Mus+musculus%29+and+Rats+%28Rattus+norvegicus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus).</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).</li>
<li>Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologic%2C+Behavioral%2C+and+Histologic+Responses+to+Various+Euthanasia+Methods+in+C57BL%2F6NTac+Male+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+degeneration+of+retinal+and+superior+collicular+functions+in+mice+with+sustained+ocular+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).</li>
<li>Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+laser-induced+mouse+model+of+chronic+ocular+hypertension+to+characterize+visual+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).</li>
<li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+experimental+glaucoma+on+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice.</a> Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).</li>
<li>Thomson, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiopoietin-1+knockout+mice+as+a+genetic+model+of+open-angle+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma.</a> Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).</li>
<li>Feng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+ocular+hypertension+induces+dendritic+degeneration+of+mouse+retinal+ganglion+cells+that+depends+on+cell+type+and+location%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).</li>
<li>Grannonico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+analysis+of+retinal+ganglion+cell+damage+at+individual+axon+bundle+level+in+mice+using+visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy.</a> Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).</li>
</ol>

Chang, S., Nenhum; Xu, W., Nenhum; Torcedor, W., Nenhum; McDaniel, J.A., Nenhum; D.A. Miller, Nenhum; M. Grannonico, Nenhum; M. Liu, Nenhum; X. Liu, Nenhum; H.F. Zhang tem interesses financeiros na Opticent Health, que não apoiou este trabalho.

Há duas etapas nesse protocolo que requerem atenção. Primeiro, é necessário garantir que o animal esteja sob anestesia profunda e que seus olhos estejam totalmente dilatados antes da realização de exames de OCT. Se os camundongos não estiverem adequadamente anestesiados, sua respiração rápida pode levar a movimentos instáveis das imagens da face em face , o que pode afetar negativamente a qualidade do fibrograma. Além disso, a dilatação insuficiente também pode ter um impacto negativo na qualidade da imagem, uma...

As células ganglionares da retina (CGRs) desempenham um papel crítico no processamento da informação visual, recebendo entradas sinápticas através de suas árvores dendríticas na camada plexiforme interna (LIP) e transmitindo a informação através de seus axônios na camada de fibras nervosas da retina (CFNR) para o cérebro 1,2,3,4. Em condições de doença como o glaucoma, a degeneração precoce do CGR pode resultar em alterações sutis na CFNR, na camada de células ganglionares (LCG), na LIP e no nervo óptico, tanto em pacientes quantoem modelos de roedores5,6,7,8,9. A detecção precoce dessas alterações morfológicas nos CGRs é, portanto, essencial para uma intervenção oportuna na prevenção do CGR e da perda da visão.
Recentemente, desenvolvemos uma nova tecnologia de imagem pronta para uso clínico chamada tomografia de coerência óptica com luz visível (vis-OCT) para satisfazer a necessidade de monitoramento in vivo dos danos do CGR. O Vis-OCT melhorou a resolução axial, atingindo 1,3 μm naretina10,11, permitindo a visualização de feixes axonais RGC individuais na CFNR. Posteriormente, a fibrografia vis-OCT (vis-OCTF) foi estabelecida para rastrear e quantificar o dano do CGR no nível do feixe axônio único emcamundongos 11,12,13. No entanto, imagens confocais ex vivo da mesma retina do padrão-ouro são frequentemente necessárias para validar os achados in vivo. Portanto, este estudo demonstrará como alinhar imagens in vivo adquiridas por vis-OCTF com imagens confocais ex vivo da mesma retina de camundongo. O protocolo visa validar os achados in vivo por imagens confocais ex vivo e estabelecer uma base para examinar as alterações moleculares e celulares subjacentes ao dano RGC em condições doentes.

<table><tbody><tr><td><forte>Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Halo 100</td><td>Opticent Health, Evanston, IL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Zeiss LSM800</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Drogas e anticorpos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldeído (PFA)</td><td>Santz Cruz Biotechnology, SC-281692</td><td></td><td>1-2 gotas</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino em pó</td><td>Fisher Scientific, BP9706-100</td><td></td><td>1:10</td></tr><tr><td>Burro anti rato Alexa Fluor 488 corante</td><td>Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202</td><td></td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>Burro anti rato Alexa Fluor 594 corante</td><td>Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209</td><td></td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>Euthasol (uma mistura de pentobarbital sódico (390 mg/mL) e fenitoína sódica (50 mg/mL))</td><td>Covetrus, NDC 11695-4860-1</td><td></td><td>15,6 mg/mL</td></tr><tr><td>de cetamina</td><td>Covetrus, NADA043304</td><td></td><td>114 mg/kg</td></tr><tr><td>de camundongo anti-Tuj1</td><td>Um presente de Anthony J. Spano, Universidade da Virgínia</td><td></td><td>1:200</td></tr><tr><td>Soro de burro normal (NDS)</td><td>Millipore Sigma, S30-100 mL</td><td></td><td>1:100</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS, 10x), pH 7,4 (Contém 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4 e 20 mM KH2PO4)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036. K3</td><td></td><td>1:10</td></tr><tr><td>Rato anti-ICAM-2</td><td>BD Pharmingen, Cat#553325</td><td></td><td>1:500</td></tr><tr><td>Tropicamida cai</td><td>Covetrus, NDC17478-102-12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (Grau de Reagente)</td><td>VWR, CAS: 9002-93-1</td><td></td><td>1:20</td></tr><tr><td>Meio de montagem Vectashield</td><td>Vector Laboratories Inc. H2000-10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Covetrus, NDC59399-110-20</td><td></td><td>17 mg/kg</td></tr></tbody></table>

alinhamento de fibrogramas de tomografia de coerência Óptica com luz visível com imagens confocais da mesma retina de camundongo

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Nos últimos anos, a imagem in vivo da retina, que fornece informações não invasivas, em tempo real e longitudinais sobre sistemas e processos biológicos, tem sido cada vez mais aplicada para obter uma avaliação objetiva do dano neural em doenças oculares. Imagens confocais ex vivo da mesma retina são frequentemente necessárias para validar os achados in vivo , especialmente em pesquisas com animais. Neste estudo, demonstramos um método para alinhar uma imagem confocal ex vivo da retina de camundongos com suas imagens in vivo . Uma nova tecnologia de imagem pronta para uso clínico chamada fibra de tomografia de coerência óptica de luz visível (vis-OCTF) foi aplicada para adquirir imagens in vivo da retina de camundongos. Em seguida, realizamos a imagem confocal da mesma retina como "padrão ouro" para validar as imagens in vivo vis-OCTF. Este estudo não só permite uma investigação mais aprofundada dos mecanismos moleculares e celulares, mas também estabelece uma base para uma avaliação sensível e objetiva do dano neural in vivo.

O fibrograma composto vis-OCT é comparado com a imagem confocal correspondente de retina plana imunomarcada com Tuj-1 para axônios RGC (Figura 1D, painel superior). Os feixes de axônio fotografados por vis-OCTF podem ser combinados com os feixes de axônios marcados com Tu-j1 na imagem confocal. Os vasos sanguíneos geralmente exibem estruturas ramificadas distinguíveis em comparação com feixes axonais circundantes em imagens de fibrograma, que podem ser combinados com os vasos sanguíneos marc...

O presente protocolo descreve os passos para o alinhamento in vivo de imagens de fibrografia por tomografia de coerência óptica de luz visível (vis-OCTF) com imagens confocais ex vivo da mesma retina de camundongos com o objetivo de verificar a morfologia do feixe axonal de células ganglionares da retina observada nas imagens in vivo.

Alinhamento de Fibrogramas de Tomografia de Coerência Óptica com Luz Visível com Imagens Confocais da Mesma Retina de Camundongo

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Apresentamos um protocolo para alinhar imagens in vivo de VIS-OCT com fibras nervosas retinianas imunocoradas ex vivo para validar nossa nova tecnologia de imagem. O VIS-OCT permite a visualização das fibras nervosas retinianas in vivo, e esse processo confirma a acurácia de nossos achados. Nosso protocolo combina imagens in vivo e ex vivo para fornecer uma visualização em tempo real da estrutura da retina e confirmar os achados.O processo é aplicável a modelos de doenças oculares em camundongos, desde que a porção anterior do olho permita imagens ópticas. Isso inclui retinopatia diabética e modelos de isquemia retiniana. Esses estudos estabelecem as bases para estabelecer uma avaliação objetiva dos danos neurológicos em humanos, o que pode melhorar significativamente o diagnóstico e o tratamento do glaucoma no futuro.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra uma técnica de imagem in vivo para detectar e quantificar a inflamação ocular em um modelo de camundongo com uveíte pós-infecciosa. A técnica, conhecida como tomografia de coerência óptica (OCT), gera imagens transversais de alta resolução do olho para avaliar a progressão da doença.

Tomografia de coerência óptica para avaliação de uveíte em modelo de camundongo

Fonte: Wang, Z., et al. Imagem in vivo de dois fótons transpupilares da retina de camundongos. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo demonstra uma técnica para imagens de retina in vivo usando microscopia de dois fótons. Os camundongos anestesiados são preparados para a imagem prendendo suas cabeças, aplicando lubrificante ocular e colocando uma lamínula sobre o olho. As células ganglionares da retina (RGCs) que expressam proteínas fluorescentes são visualizadas pela primeira vez usando...

Imagem in vivo de dois fótons da retina de camundongos

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55865/ coerência-óptica-tomografia-imagem-de-camundongo-células-ganglionares-de-retina-em-vivo'&gt;Jagodzinska, J., et. al., Tomografia de Coerência Óptica: Imagem de células ganglionares da retina de camundongos In Vivo. J. Vis. exp. (2017)  Neste vídeo, demonstramos o uso da tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) para obter imagens das camadas da retina e avaliar as mudanças estruturais em um modelo...

Imagem in vivo da retina de camundongo usando tomografia de coerência óptica

Este manuscrito descreve um protocolo para a imagem no vivo da retina do rato com a tomografia de coerência óptica de domínio espectral de alta resolução (SD-OCT). Centra-se em células ganglionares da retina (RGC) na região de peripapillary, com vários digitalização e quantificar as abordagens descritas.

Tomografia de coerência óptica: Imagens Mouse ganglionares da retina células In Vivo

Aqui vamos demonstrar uma nova abordagem para usando a tomografia de coerência óptica espectral-domínio de alta resolução (HR-SD-OCT) para auxiliar entrega de agentes de terapia do gene para o espaço subretinal, avaliar sua cobertura areal e caracterizar vitalidade fotoreceptor.

Tomografia de coerência óptica Mouse ultra alta resolução para auxiliar a injeção intra-ocular em pesquisa de terapia de genes da retina

Este protocolo descreve técnicas como de alta resolução de imagem como tomografia de coerência óptica de domínio espectral e digitalização laser Oftalmoscopia pode ser utilizado em pequenos roedores, usando um sistema de plataforma de imagem oftálmica, para obter informações sobre espessura da retina e microglial celular distribuição, respectivamente.

Na Vivo Imagem de Cx3cr1gfp/gfp repórter ratos com a tomografia de coerência óptica espectral-domínio e digitalização Laser Oftalmoscopia

Aqui, apresentamos um protocolo para obter um grande campo de visão (FOV) tridimensional (3D) fluorescência e imagem retiniana OCT usando uma romance plataforma multimodal de imagens. Apresentaremos na configuração do sistema, o método de alinhamento e os protocolos operacionais. Imagem latente na vivo será demonstrada, e serão fornecidos resultados representativos.

Multimodal volumétrico Retinal Imaging pelo oblíquo digitalização Laser Oftalmoscopia (oSLO) e a tomografia de coerência óptica (OCT)

Um protocolo detalhado para a avaliação de leituras visuais e estruturais em roedores por coerência óptica tomografia computadorizada e optocinético resposta é apresentado. Os resultados fornecem informações valiosas para investigação oftalmológica, bem como neurológica.

Usando a tomografia de coerência óptica e resposta Optokinetic como estrutural e funcional sistema Visual leituras em camundongos e ratos

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa para o estudo da biologia na saúde e na doença. Este protocolo descreve imagens transpupilares da retina de camundongos com um microscópio padrão de dois fótons. Também demonstra diferentes métodos de imagem in vivo para marcar fluorescentemente múltiplas coortes celulares da retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

Aqui, descrevemos uma técnica de imagem in vivo usando tomografia de coerência óptica para facilitar o diagnóstico e a medição quantitativa da retinopatia em camundongos.

Aplicação da Tomografia de Coerência Óptica a um Modelo de Retinopatia de Rato

Aprenda a alinhar imagens de tomografia de coerência óptica com luz visível e confocal de retina de camundongo. Este método valida a morfologia dos feixes de axônios de células ganglionares retinianas in vivo.

Alinhamento de Fibrogramas de Tomografia de Coerência Óptica com Luz Visível com Imagens Confocais da Mesma Retina de Camundongo (Vídeo) | JoVE Journal

Alinhamento de Fibrogramas de Tomografia de Coerência Óptica com Luz Visível com Imagens Confocais da Mesma Retina de Camundongo

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