Name: Dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprenda a dissecar a estria vascularis de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único e imunomarcação. Este método avança a compreensão dos mecanismos celulares relacionados a distúrbios auditivos como a doença de Meniere.

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Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, NIDCD para M.H. (DC000088)

Todos os experimentos e procedimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do National Institute of Neurological Diseases and Stroke e do National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do National Institute of Neurological Diseases and Stroke e pelo National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais do National Institute of Neurological Diseases and Stroke e do National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health.
1. Eutanásia animal
<ol><li>Use camundongos transgênicos C57BL/6J ou Kcnj10-ZsGreen, dia pós-natal 30+ (P30+), que pesam entre 15-20 g.</li>
	<li>Eutanásia de um camundongo adulto (idade P30 ou mais) usando um protocolo aprovado (aqui asfixia por CO2 ). Execute a decapitação como uma etapa secundária. NOTA: Se a imunomarcação, alguns anticorpos podem ter sinal de fundo devido à ligação inespecífica ao sangue nos capilares da VS. A perfusão cardíaca com fixador pode resolver essa questão removendo o sangue dos capilares da VS. No entanto, a maioria dos anticorpos pode alcançar bons resultados sem esse método, e ele não será abordado neste protocolo.</li>
</ol>2. Expondo o labirinto ósseo
<ol><li>Limpe o rato pulverizando com etanol 70% e limpando com um papel toalha. Preste especial atenção à região da cabeça para reduzir o risco de contaminação. Remova a pele do crânio puxando a pele em direção ao nariz.</li>
	<li>Com uma tesoura afiada, divida o crânio ao longo do plano sagital médio para separar as porções esquerda e direita.</li>
	<li>Remova o cérebro do crânio para expor o labirinto ósseo.</li>
</ol>3. Extração da orelha interna
<ol><li>Identificar a orelha interna dentro do osso temporal (Figura 2A) e raspar os nervos cranianos com pinça #55. NOTA: O usuário deve estabilizar o espécime com sua mão não dominante usando um segundo conjunto de pinças #55. Diferentes áreas do espécime podem ser agarradas com a pinça estabilizadora durante toda a dissecção, se áreas críticas do espécime forem evitadas (por exemplo, não esmagar a cóclea).</li>
	<li>Usando pinças #55, disseque a bula e a cápsula, desprendendo-as do osso circundante. Remova qualquer tecido mole restante da superfície da orelha interna.</li>
	<li>Transfira o espécime para uma placa de cultura de tecidos transparente contendo 1x PBS fria (solução salina tamponada com fosfato), pH 7,4, e coloque sob um escopo de dissecção (Figura 2B).</li>
</ol>4. Dissecção VS
OBS: Com a prática, é possível dissecar o SV como uma peça longa que se assemelha a uma fita. O SV é frágil, portanto, se ele se quebrar em pedaços, estes podem ser armazenados juntos. Alternativamente, estes podem ser armazenados em poços rotulados separadamente de acordo com seu turno (por exemplo, basal, médio, apical).
<ol><li>Se as fontes de luz do escopo de dissecção puderem ser movidas, coloque uma luz acima da placa e a segunda fonte de luz do lado, paralela à superfície dissecante. Isso permite um melhor contraste do tecido sob o osso coclear.</li>
	<li>Com pinça #55, segure o espécime pela porção vestibular com a cóclea voltada para cima.</li>
	<li>Usando pinça #55, perfurar o osso coclear no ápice. NOTA: A pinça #5 é mais grossa que a #55 e pode ser usada para quebrar osso, mas o aumento do tamanho/força sacrifica a finura da pinça e a capacidade de manipular pequenos tecidos. Considere o uso de pinças feitas com um material como inox ou dumostar para evitar danos que podem ocorrer a pinças mais delicadas. Evite empurrar a pinça muito fundo sob o osso para evitar danificar a VS.</li>
	<li>Usando pinça #55, raspe ao longo da espira apical (Figura 2C), aplicando força suave para quebrar pequenos pedaços da camada óssea externa. Levante suavemente o osso e desconecte-o da parede lateral. NOTA: Pode ser útil pensar nesta dissecação como "remover tudo da VS", em vez de "dissecar a VS para fora da cóclea".</li>
	<li>Continuar usando pinça #55 para remover fragmentos de osso coclear das espiras apical e média (Figura 2D,E). Empurrar suavemente a parede lateral, fritar e remover os pedaços da parede óssea em direção à curva média para expor a parede lateral das espiras apical e média.</li>
	<li>Continuando usando pinça #55, empurre suavemente a parede lateral do giro apical para o lado para expor o gânglio espiral. Destacar-se a parede lateral das espiras apical e média do gânglio espiral ao longo da camada externa de células ciliadas. Remova pedaços de gânglio espiral de dentro da cóclea. NOTA: As pinças #55 são menores e oferecem uma vantagem ao manipular tecidos pequenos e delicados. Cuidados extras devem ser tomados para evitar dobrá-los ou danificá-los.</li>
	<li>Para melhor acesso à parede lateral do giro basal, desprenda a cóclea da porção vestibular do osso temporal utilizando pinça #55. Coloque a pinça #55 na janela redonda e oval e empurre para baixo em direção ao vestíbulo. A cóclea vai se destacar. Remova a porção vestibular da orelha interna.</li>
	<li>Continuando usando a pinça #55, agora remova pedaços de osso coclear basal, começando pela área do giro médio. Empurre suavemente a camada lateral da parede sob o osso para desprendê-lo.</li>
	<li>Remova a parte basal mais distante da parede lateral por meio de fritura e puxando suavemente o tecido. O osso nesta região pode ser muito espesso para ser removido sem danificar o tecido mole abaixo.</li>
	<li>Agora, com a parte basal da parede lateral descolada, separe o máximo possível da parede lateral da cóclea. Isso pode ser feito traçando a pinça #55 ao longo da parede lateral. Escove suavemente a pinça entre o osso e a parede lateral restante. Isso pode ser feito até o ápice em uma única peça, se o usuário for experiente. Mova a parede lateral para PBS fresco. NOTA: Embora pedaços maiores de VS possam ser mais fáceis de obter imagens, dada a natureza delicada dos tecidos, pedaços menores podem ser retirados (Figura 2F,G) e, dependendo do tamanho, também podem funcionar para aquisição de imagens.</li>
	<li>Use pinça #55 para colocar a parede lateral plana. A VS deve ser visível como uma camada mais escura de tecido no lado interno da parede lateral. NOTA: Os usuários podem encontrar, particularmente mais perto da extremidade apical, que parte do tecido da VS acidentalmente se desprende da parede lateral durante toda a dissecção.</li>
	<li>Delicadamente pincelar a camada do VS para descolá-la da parede lateral em sua extremidade basal (Figura 2H). Afastar suavemente o VS descolado e mover a pinça em direção à extremidade apical da parede lateral, desprendendo o VS como uma fita longa, se possível (Figura 2I). Não aperte o SV com pinça para puxá-lo. Se o tecido for muito frágil para ser agarrado, ele pode ser coletado alternativamente usando uma colher de tecido, como uma cureta de calázio. NOTA: A movimentação do SV deve ser sempre feita sob microscopia de luz para garantir que ele não seja perdido. Tenha sempre cuidado ao agarrar usando pinças devido ao risco de danos. Os usuários podem achar que o uso de cureta de calázio atenua o risco de danos ao tecido SV. Para sequenciamento de núcleo único, prossiga para a seção 5. Para imunomarcação de VS, prossiga para a seção 7.</li>
</ol>5. Suspensão de núcleo único SV
NOTA: Este protocolo é adaptado para tecido SV especificamente a partir de um protocolo de suspensão de núcleo único publicado pelo fabricante. Plataformas de diferentes fabricantes podem ser utilizadas31. Dada a variação específica da plataforma, recomenda-se rever o protocolo específico do fabricante fornecido com o equipamento. Para obter resultados ótimos para sNuc-Seq e minimizar a degradação do RNA, quanto mais rápida a dissecção do tecido, melhor (recomendado dentro de 15-20 min da eutanásia). Pode ser útil eutanasiar um animal de cada vez e somente quando estiver pronto para dissecar. Ter várias pessoas trabalhando simultaneamente nas dissecções também pode eliminar o tempo de degradação (por exemplo, um pessoal de laboratório trabalhando na orelha esquerda enquanto outro trabalha na orelha direita).
<ol><li>Se o tecido SV for usado para sNuc-Seq, colocar o tecido em tampão de lise refrigerado (Tris-HCl 10 mM, NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM, P40 nonidet 0,005% em água livre de nucleases). Observação : se o sequenciamento deve ser feito imediatamente após a dissecção, continue o protocolo. Se desejar pausar o protocolo, a preservação da VS é possível colocando-a em RNAlater. Conservar durante a noite a 4 °C, congelar rapidamente em azoto líquido e conservar a -80 °C até estar pronto a utilizar. Quando estiver pronto para uso, descongelar e lavar duas vezes em PBS por 5 min cada, em seguida, proceder à homogeneização (passo 5.2).</li>
	<li>Homogeneizar o tecido em homogeneizador de 2 mL com 10-20 golpes de gelo. NOTA: O cilindro de vidro entrará em contato manualmente com o fundo do tubo de vidro, fragmentando o SV. A VS é delicada, de modo que 20 golpes geralmente alcançam homogeneização bem-sucedida.</li>
	<li>Lise o tecido no gelo por 25 min. OBS: O tempo de lise varia de acordo com o tipo de tecido. Uma lise de 25 minutos no tecido da VS pode atingir uma baixa viabilidade celular (menos de 4%), mas o tempo pode ser adaptado se a viabilidade celular for muito alta (passo 5.8).</li>
	<li>Filtrar através de um filtro de 30 μm e girar o filtrado a 500 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 1 mL de tampão de lavagem e ressuspensão dos núcleos (1x PBS, albumina de soro bovino [BSA] 1%, inibidor de RNase 0,2U/μL).</li>
	<li>Filtrar as células através de um filtro de 10 μm e centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Retirar o sobrenadante e ressuspender em 50 μL de tampão de lavagem e ressuspensão dos núcleos.</li>
	<li>Conte os núcleos usando um contador de células e coloração azul de tripano. Diluir 5 μL da suspensão celular em 50 μL de 1x PBS para contagem celular; A viabilidade deve ser mínima (3%-4%) neste momento. Se a viabilidade for maior, adaptar o protocolo para a etapa 5.3 (lise) e padronizar o tempo de lise para garantir a lise adequada das células. NOTA: Uma alta viabilidade celular em uma única preparação de núcleo significa que há mais células intactas do que o desejado, e que a digestão adicional pode ser necessária.</li>
	<li>Carregue a amostra com a densidade nuclear desejada no aparelho/chip do fabricante (consulte o guia do fabricante). As capturas de núcleos únicos já estão prontas. NOTA: A partir de um camundongo adulto SV, geralmente são alcançados 50 μL da suspensão a uma concentração de 150.000 núcleos/mL.</li>
</ol>6. Sequenciamento de núcleo único da VS
<ol><li>Envie as amostras para a instalação principal para sequenciamento. NOTA: Esta parte do protocolo segue as etapas gerais de (1) geração de emulsão de contas de gel (GEM) e código de barras, (2) limpeza pós-GEM-RT e amplificação de cDNA, e (3) construção de biblioteca de expressão gênica 3'. O restante do protocolo sNuc-Seq é relativamente longo, e recomenda-se que os leitores usem seu protocolo específico do fabricante. O guia do fabricante provavelmente descreverá as etapas com detalhes específicos e imagens que o acompanham. Também pode haver vídeos de "como fazer" no site do fabricante. Os conjuntos de dados gerados podem ser representados de forma reduzida dimensionalmente, como uma aproximação e projeção de variedade uniforme (UMAP; Gráfico 3). Muitos laboratórios utilizam um núcleo de sequenciamento que pode executar esse protocolo para os usuários.</li>
</ol>7. Imunomarcação do VS e montagem tecidual
<ol><li>Se o tecido for usado para imunomarcação, transferi-lo para uma placa de 24 poços, submersa em 200 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% em 1x PBS, e incubar por 20 min à temperatura ambiente. NOTA: É útil realizar toda a remoção de líquido, lavagem e imunomarcação sob um microscópio. A visualização durante a pipetagem do tecido garantirá que ele não seja perdido acidentalmente durante a remoção do líquido. Os volumes dos anticorpos e lavagens podem ser ajustados desde que o volume seja grande o suficiente para submergir o tecido da VS dentro da solução.</li>
	<li>Após a etapa de fixação, remova o PFA realizando duas lavagens curtas em 1x PBS (aproximadamente 500 μL) a 4 °C por 5 min cada em um agitador orbital a baixa (30-50) RPM. Se armazenar, o tecido pode ser armazenado em 1x PBS a 4 °C.</li>
	<li>Remover o PBS e permeabilizar e bloquear por um mínimo de 1 h à temperatura ambiente em aproximadamente 300 μL de solução de PBS-T (0,05 Tween20 em 1x PBS com 10% de soro fetal bovino). NOTA: Os anticorpos primários e secundários devem ser diluídos nesta solução de bloqueio.</li>
	<li>Manchar o tecido com anticorpo primário de acordo com as especificações do anticorpo específico usado, geralmente durante a noite a 4 °C . Remova o PBS restante e adicione o anticorpo primário diluído. NOTA: A diluição deve ser escolhida com base nas sugestões do fabricante, dados publicados, experiência anterior, etc. Normalmente, a primeira concentração a ser testada é uma diluição de 1:100-200. Para o exemplo apresentado neste trabalho, os anticorpos GS-IB4 e DAPI foram diluídos a 1:200. Se houver coloração para mais de uma proteína, vários anticorpos primários podem ser combinados na mesma solução, desde que cada anticorpo primário tenha um hospedeiro diferente para evitar a reatividade cruzada de anticorpos secundários.</li>
	<li>Lave o anticorpo primário do tecido usando aproximadamente 500 μL de 1x PBS duas vezes por 10 min cada em um agitador orbital a baixas RPM. NOTA: Continue a garantir que o tecido SV esteja submerso na solução e não preso na lateral do poço.</li>
	<li>Coloração com um anticorpo secundário de acordo com as especificações do anticorpo específico usado, geralmente por 2 h à temperatura ambiente em um agitador orbital a baixas RPM. Cubra a placa de 24 poços para que o anticorpo secundário marcado fluorescentemente esteja protegido da luz. NOTA: Se for necessário mais de um anticorpo secundário, combine os anticorpos secundários na mesma solução. Certifique-se de evitar a rotulagem cruzada.</li>
	<li>Lave o anticorpo secundário do tecido usando aproximadamente 500 μL de 1x PBS quatro vezes por 5 min cada em um agitador orbital a baixas RPM. Mantenha a placa de 24 poços coberta para protegê-la da luz.</li>
	<li>Prepare a microlâmina maior (75 mm x 25 mm) colocando duas pequenas faixas de cola ao longo do eixo de 25 mm, um pouco menor do que a tampa de vidro menor de 18 mm x 18 mm. Coloque uma gota de reagente de montagem (aproximadamente 50 μL) entre as estrias de cola. NOTA: A cola cria uma pequena quantidade de espaço vertical para que, quando a segunda lamínula for colocada na parte superior, a amostra de tecido SV possa existir com segurança, mas continuar no lugar. Enquanto a espessura da estria é de 30-40 mícrons, a compressão do tecido entre as superfícies de vidro deve ser evitada para preservar a morfologia. Alternativamente, fita transparente também pode ser usada.</li>
	<li>Usando pinça #55, pegue o mínimo de tecido possível em uma extremidade da VS e transfira do PBS para a gota do reagente de montagem na microlâmina maior (75 mm x 25 mm). Coloque uma extremidade de uma tampa de vidro menor (18 mm x 18 mm) na lâmina onde uma faixa de cola foi colocada e solte suavemente para evitar a criação de bolhas de ar. A lamínula cairá para a outra faixa de cola e cobrirá o tecido SV.</li>
	<li>Sele o suporte passando uma gota de esmalte transparente em cada canto do suporte. Rotule o espécime de acordo com a tampa de vidro para longe do campo de visualização. Está pronto para a microscopia confocal (Figura 4).</li>
	<li>Visualize o tecido SV usando um microscópio de dissecção para garantir que ele esteja plano e não perto de bolhas de ar. Se o tecido SV não estiver orientado corretamente, o usuário pode tentar empurrar bolhas de ar para fora ou remover cuidadosamente a tampa de vidro menor e reposicionar o SV. Isso deve ser feito com cuidado para evitar quebrar as tampas de vidro.</li>
</ol>

Microdissecção da Estria Vascular para Sequenciamento de Núcleo Único ou Imunomarcação

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<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-sequencing+from+single+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Antes do advento do sequenciamento de célula única, muitos pesquisadores usaram a análise de tecido em massa, que só tornou possível analisar transcriptomas médios entre células. Em particular, unicelular e sNuc-Seq permitiram isolar o transcriptoma de uma única célula ou núcleo único, respectivamente32. Nesse caso, transcriptomas de núcleo único podem ser identificados para células marginais, intermediárias e basais, bem como células fusiformes30. Isso permite a investigaç...

A cóclea consiste de três câmaras cheias de líquido, a escala vestibular, a escala média e a escala timpânica. A escala vestibular e a escala timpânica contêm perilinfa, que apresenta alta concentração de sódio (138 mM) e baixa concentração de potássio (6,8 mM)1. A escala média contém endolinfa, que apresenta alta concentração de potássio (154 mM) e baixa concentração de sódio (0,91 mM)1,2,3. Essa diferença na concentração de íons pode ser chamada de potencial endococlear (PE), e é gerada primariamente pelo movimento de íons potássio através de vários canais iônicos e junções comunicantes na estria vascular (VS) ao longo da parede lateral da cóclea4,5,6,7,8,9,10,11 . A VS é um tecido heterogêneo, altamente vascularizado, que reveste a face medial da parede lateral da cóclea e contém três tipos celulares principais: células marginais, intermediárias ebasais12 (Figura 1).
As células marginais são conectadas por tight junctions para formar a superfície mais medial da VS. A membrana apical está voltada para a endolinfa da escala média e contribui para o transporte iônico de potássio para a endolinfa usando vários canais, incluindo KCNE1/KCNQ1, SLC12A2 e Na+-K+-ATPase (NKA)5,10,13,14. As células intermediárias são células pigmentadas que residem entre as células marginais e basais e facilitam o transporte de potássio através da VS utilizando KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. As células basais estão próximas à parede lateral da cóclea e estão intimamente associadas aos fibrócitos do ligamento espiral para promover a reciclagem de potássio da perilinfa12. A patologia da VS tem sido implicada em inúmeras afecçõesotológicas17,18. Mutações em genes expressos nos principais tipos celulares de VS, como Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 e Cldn11, podem causar surdez e disfunção de VS, incluindo a perda de PE19,20,21,22,23. Além dos três principais tipos celulares, existem outros tipos celulares menos estudados na VS, como as células fusiformes22, as células radiculares12,24, os macrófagos25, os pericitos26 e as células endoteliais27, que têm papéis incompletamente definidos envolvendo a homeostase iônica e a geração de EP28.
Em comparação com o sequenciamento de RNA em massa, o sequenciamento de RNA de núcleo único (sNuc-Seq) fornece informações sobre a heterogeneidade celular, em vez de uma média de RNAm em um grupo de células29, e pode ser particularmente útil ao estudar o SV30 heterogêneo. Por exemplo, o sNuc-Seq produziu uma análise transcricional que sugere que pode haver um papel das células fusiformes e radiculares na geração de PE, perda auditiva e doença de Ménière18. Uma caracterização transcricional adicional dos vários tipos de células da VS pode nos fornecer informações valiosas sobre a fisiopatologia subjacente aos diferentes mecanismos e subtipos de flutuação e perda auditiva relacionados à VS. A colheita dessas delicadas estruturas da orelha interna é de suma importância para a análise ótima dos tecidos.
Neste estudo, a abordagem de microdissecção para acessar e isolar a estria vascular da cóclea de camundongos adultos para sNuc-Seq ou imunomarcação é descrita. A dissecção do VS de camundongos adultos é necessária para entender vários tipos de células VS e caracterizar melhor seu papel na audição.

<table><tbody><tr><td>10-&micro; m filtro (Polietilenoreftalato)</td><td>PluriSelect</td><td>#43-50010-01</td><td>Tecido filtrante durante a cobertura de vidro sNuc-Seq</td></tr><tr><td>18 x 18 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td>Lamínula para montagem SV</td></tr><tr><td>30-&micro; m filtro (Polietilenoreftalato)</td><td>PluriSelect</td><td>#43-50030-03</td><td>Filtre o tecido durante o sNuc-Seq</td></tr><tr><td>75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide</td><td>Daigger</td><td>EF15978Z</td><td>Microslide para montar SV em</td></tr><tr><td>camundongos C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID: IMSR_JAX:000664</td><td>Cepa de camundongo de uso geral que tem pigmento mais facilmente visto nas células intermediárias do SV.</td></tr><tr><td>Contador de Células</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>Usado para contagem de células</td></tr><tr><td>Chalizon curete 5'', tamanho 3 2.5 mm</td><td>Instrumentos de Pesquisa Biomédica</td><td>15-1020</td><td>Usado para transferir SV</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1</td><td>Chromium</td><td>PN-1000141</td><td>Gera bibliotecas de expressão gênica de célula única 3'</td></tr><tr><td>Esmalte transparente</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1849418</td><td>Usado para selar</td></tr><tr><td>placas de cultura de tecidos padrão Corning Falcon</td> de montagem SV, placa de cultura <td>Corning</td><td>08-772B</td> de 24 poços <td>usada para segurar a amostra durante a dissecação</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306, RRID: AB_2629482</td><td>Mancha usada para rotulagem de núcleo</td></tr><tr><td>Homogeneizador Dounce</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8938</td><td>Usado para homogeneizar tecido para pinça</td></tr> <tr><td></td><td>sNuc-seq Dumont #5Ferramentas de Ciências Finas</td><td>11252-30</td><td>Fórceps gerais para dissecação</td></tr><tr><td>Dumont # 55 Fórceps</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>11255-20</td><td>Fórceps com ponta fina que facilita a manipulação do SV</td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>Usado para etapas de cola sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Stick</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0691392</td><td>Usado para montagem SV</td></tr><tr><td>GS-IB4 Anticorpo</td><td>Molecular Sondas</td><td>I21411, RRID: AB-2314662</td><td>Anticorpo usado para marcação capilar</td></tr><tr><td>KCNJ10-ZsGreen Camundongos</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Camundongo transgênico que expressa KCNJ10-ZsGreen, particularmente nas células intermediárias do SV.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9530G</td><td>Usado para etapas de reagente de montagem sNuc-Seq</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>#S36940</td><td>Reagente de montagem para</td></tr><tr><td>placa de 24 poços SV Multiwell</td><td>Placa Corning</td><td>#353047</td><td>usada para imunocoloração</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ThermoFisher</td><td>AAJ216183</td><td>Usado para etapas de sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9-16-45-9</td><td>Usado para etapas de sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>ThermoFisher</td><td>4387936</td><td>Usado para etapas de sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Silent Shake</td><td>SYC-2102A</td><td>Usado para etapas de imunocoloração</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>J61196. AP</td><td>Usado para etapas de imunocoloração e dissecação</td></tr><tr><td>RNA Posteriormente</td><td>Invitrogen</td><td>AM7021</td><td>Usado para preservação de SV para sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Scizzors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>Usado para dividir o crânio de camundongo</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15506017</td><td>Usado para etapas de sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Coloração azul de tripano</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>Usado para contagem de células</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>ThermoFisher</td><td>AAJ20605AP&nbsp;</td><td>Usado para etapas de sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio Zeiss STEMI SV 11 Apo</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>Microscópio usado para dissecções</td></tr></tbody></table>

dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação

Dissection of Adult Mouse Stria Vascularis for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining

O potencial endococlear, gerado pela estria vascular, é essencial para manter um ambiente propício à adequada mecanotransdução das células ciliadas e, finalmente, à audição. Patologias da estria vascular podem resultar em diminuição da audição. A dissecção da estria vascular do adulto permite a captura focalizada de núcleo único e subsequente sequenciamento e imunomarcação de núcleo único. Essas técnicas são usadas para estudar a fisiopatologia da estria vascular em nível unicelular. 
O sequenciamento de núcleo único pode ser usado na análise transcricional da estria vascular. Enquanto isso, a imunomarcação continua a ser útil na identificação de populações específicas de células. Ambos os métodos requerem dissecção adequada da estria vascular como pré-requisito, o que pode revelar-se tecnicamente desafiador.

Apresentamos um método para isolar o VS a ser usado para sNuc-Seq ou imunomarcação. A anatomia relevante (Figura 1) da cóclea em relação à VS pode ajudar o usuário a entender melhor a organização da VS e as etapas do protocolo de dissecção.
Cada passo dessa microdissecção de VS de um mouse P30 é detalhado no vídeo associado, e instantâneos dos principais passos dessa dissecção e isolamento de VS são apresentados na Figura 2.
<p cl...

A estria vascular é vital para a geração do potencial endococlear. Apresentamos aqui a dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação.

Dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação

Endocochlear potential, which is generated by the stria vascularis, is essential to maintain an environment conducive to appropriate hair cell ...

A estria vascular tem a função de gerar o potencial endococlear e regular a homeostase iônica na cóclea. O programa de desenvolvimento e restauração auditiva busca compreender os mecanismos subjacentes que ligam a homeostase iônica disfuncional com os distúrbios da audição e estabilidade, que são doenças em que ocorre flutuação ou perda auditiva súbita. O trabalho em meu laboratório estabeleceu a paisagem transcricional da estria vascular e contribuiu para a compreensão de sua importância na audição.Usamos esses dados para traçar paralelos com distúrbios auditivos e de estabilidade mal compreendidos, incluindo a doença de Ménière. Este protocolo permite a dissecção e o isolamento da estria vascular de toda a montaria para estudos moleculares posteriores, incluindo imunohistoquímica. Dado que os tipos celulares da estria vascular estão intrinsecamente entrelaçados entre si, o uso de isolamento nuclear e sequenciamento de RNA de núcleo único facilitou nossa compreensão da distinta maquinaria transcricional envolvida.

dissection-adult-mouse-stria-vascularis-for-single-nucleus-sequencing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Daynac, M., et. al. Classificação celular de células-tronco neurais e progenitoras da zona subventricular de camundongos adultos e imagens ao vivo de sua dinâmica do ciclo celular. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra imagens de lapso de tempo de células-tronco neurais (NSCs) de um cérebro de camundongo transgênico usando um microscópio confocal de varredura a laser. Os NSCs fluorescem em vermelho durante a fase G1 e não são fluorescentes em outras fases do ciclo celular. Uma cultura...

Imagem de lapso de tempo da divisão de células-tronco neurais de camundongo usando microscopia confocal

Aqui descrevemos um procedimento baseado no uso de partículas lentivirais para a modificação genética de longo prazo de células-tronco neurais e/ou suas células ependimárias adjacentes no nicho neurogênico ventricular-subventricular adulto que permite a análise separada de efeitos celulares autônomos e não autônomos, dependentes de nicho em células-tronco neurais.

Estável e eficiente modificação genética de células do rato adulto V-SVZ para a Análise da Neural Stem Cell Autónoma e Efeitos não autónomos

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar rapidamente núcleos de alta qualidade do tecido fresco ou congelado para a sequenciação do ARN maciçamente paralelo a jusante. Inclui opções de Lise rompimento e célula tecido detergente-mecânica e hipotônica-mecânico, ambos dos quais podem ser usados para isolamento dos núcleos.

Isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do ARN de Single-núcleo maciçamente paralelo

Nós fornecemos um protocolo para o isolamento da microglia de diferentes regiões dissecadas de um hemisfério cerebral de camundongo adulto, seguido de preparação de biblioteca semi-automatizada para sequenciamento profundo de RNA unicelular de transcrições completas. Este método ajudará a elucidar a heterogeneidade funcional da microglia na saúde e na doença.

Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

Este protocolo descreve a microdisseção assistida pela transilação de segmentos de túbulos seminiferos adultos representando estágios específicos do ciclo epitelial seminiferante, e tipos de células, e posterior imunossuagem de preparações de abóbora e segmentos de tubulações intactas.

Dissecção assistida por transilluminação de etapas específicas do ciclo epitelial seminifero do rato para análises de imunostaining a jusante

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar núcleos de alta qualidade de rins de camundongos congelados que melhoram a representação de tipos de células renais medulares e evitam os artefatos de expressão gênica da dissociação do tecido enzimático.

Isolamento de Núcleos do Rim de Rato Adulto para Sequenciamento de RNA de Núcleo Único

Este protocolo descreve a preparação detalhada e de baixa entrada da amostra para sequenciamento de núcleo único, incluindo a dissecção de gânglios cervicais e estelares superiores do rato, dissociação celular, criopreservação, isolamento do núcleo e bar codificação de hashtag.

Isolamento de núcleo de baixa entrada e multiplexing com anticorpos de código de barras de ganglia simpatizante do rato para sequenciamento de RNA de núcleo único

A capacidade de marcar permanentemente células-tronco e sua prole com um fluoróforo usando uma linhagem transgênica indutível que traça a linhagem do mouse permite a análise espacial e temporal de ativação, proliferação, migração e/ou diferenciação in vivo. O rastreamento de linhagem pode revelar novas informações sobre o comprometimento da linhagem, a resposta à intervenção e a multipotência.

Rastreamento de linhagem de células-tronco fluorescentes indutíveis no cérebro do rato adulto

Apresentado aqui é um método para sequenciar núcleos únicos isolados do giro dentado do rato que exclui a maioria dos neurônios através da classificação de núcleos ativados por fluorescência (FAN). Essa abordagem gera perfis de expressão de alta qualidade e facilita o estudo da maioria dos outros tipos de células representadas no nicho, incluindo populações escassas, como células-tronco neurais.

Classificação negativa de neurônios por núcleos ativados por fluorescência combinada com sequenciamento de RNA de núcleos únicos para estudar o nicho neurogênico do hipocampo

A retina exibe uma organização espacial complexa em toda a sua estrutura laminar. As técnicas modernas de transcriptômica espacial e sequenciamento requerem seções de tecido &lt; 20 μm de espessura, limitando sua aplicabilidade na pesquisa da retina. Este método de crioseccionamento recém-congelado produz seções finas na face da retina do camundongo, preservando as relações espaciais planares, permitindo um mapeamento molecular abrangente entre as lâminas.

En face Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

Este artigo fornece um protocolo simplificado para a dissecção e dissociação do epitélio olfatório murino para fins de sequenciamento de RNA de núcleo único.

Dissecção rápida e dissociação do epitélio olfatório de camundongo para suspensões de núcleo único

Aprenda a dissecar a estria vascularis de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único e imunomarcação. Este método avança a compreensão dos mecanismos celulares relacionados a distúrbios auditivos como a doença de Meniere.

Dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação

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