Name: Uso da Plataforma de Tecido de Barreira MicroSiM (μSiM) para Modelagem da Barreira Hematoencefálica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprenda a usar a plataforma microSiM para modelar a barreira hematoencefálica in vitro com células-tronco pluripotentes humanas. Este método avança pesquisas sobre inflamação sistêmica e função cerebral.

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J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. e L.W. foram financiados pelo NIH grant R33 HL154249. J.L.M. foi financiado pela R44 GM137651. M.M. foi financiado pelo Schmidt Program Award Del Monte Institute for Neuroscience, Universidade de Rochester. M.T. foi financiado pela RF1 AG079138. K.C. foi financiado pela International Foundation for Ethical Research.

Análise de modelos de barreira hematoencefálica via coloração por imunofluorescência

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J.L.M. é co-fundador da SiMPore e detém participação acionária na empresa. A SiMPore está comercializando tecnologias ultrafinas à base de silício, incluindo as membranas usadas neste estudo.

Embora os chips de membrana tenham sido projetados para estabilidade, eles podem trincar ou quebrar se manuseados incorretamente durante a montagem. Assim, é fundamental segurar o chip nos entalhes da pinça do chip e colocá-lo suavemente no acessório. Ao manusear os dispositivos em geral, deve-se tomar cuidado extra para não bater ou soltar os dispositivos. Durante a colagem do chip de membrana ao acessório A1, o chip deve ser colocado plano e centrado no pilar do acessório A1 para evitar rachaduras na membrana durante a colagem ao componente 1. Além disso, qualquer contato com as camadas de PSA expostas deve ser evitado após a remoção das máscaras de proteção. Ao manusear o componente 2 após a remoção das máscaras de proteção, é aconselhável segurá-lo ao longo da borda do componente e usar pinças para agarrar o canto do triângulo que é livre de PSA.
Enquanto protocolos de cultura celular foram descritos para possíveis modelos de BBB, o modelo de co-cultura BMEC/pericyte da BBB aqui descrito pode ser suficiente ou insuficiente, dependendo do contexto fisiológico e das questões de interesse. Por exemplo, o tráfego de células imunes ocorre em grande parte nas vênulas pós-capilares do cérebro41,42. Nessas regiões, um espaço perivascular separa a barreira BMEC/pericitos dos limites gliais estabelecidos pelos astrócitos. Assim, nas vênulas pós-capilares, a unidade neurovascular (NVU) compreende duas barreiras fisicamente separadas em série, e os pés finais astrocitários não entram em contato direto com a BMEC/barreira sanguínea pericitária, o que é bem representado pelo modelo atual. Se o objetivo for um modelo de NVU que explique o impacto dos fatores secretados pelos astrócitos na barreira sanguínea, um compartimento astrócito poderia ser adicionado ao dispositivo que permite a troca de fatores solúveis através do espaço perivascular. Este exemplo foi ilustrado anteriormente 34 e poderia ser estendido para incluir outras células, como a micróglia e neurônios em um compartimento3D "cérebro". A arquitetura modular da plataforma permite que estratégias de montagem simples sejam usadas para alcançar essas reconfigurações de modo que a plataforma seja tão simples ou complexa quanto necessário para abordar as hipóteses em questão. Configuração de cada cultura celular; no entanto, deve ser otimizado para novas linhagens celulares e multiculturas. Por exemplo, devido às propriedades das membranas de nitreto de silício, as soluções de revestimento podem precisar ser ajustadas em comparação com as placas de cultura de tecido. A inclusão de fibronectina tipicamente auxilia na fixação e sobrevivência celular. Além disso, os usuários poderiam cultivar células endoteliais e pericitos em direções opostas. Nesse caso, pode ser necessário modificar, por exemplo, a forma como as medidas de permeabilidade são feitas e interpretadas. Fornecer passos para esse tipo de cultura, no entanto, está além do escopo deste artigo.
Outro desafio que pode ser encontrado durante a cultura celular é a rápida evaporação dos meios, uma vez que os dispositivos podem ser mais sensíveis a alterações no ambiente em comparação com placas e frascos de cultura de tecidos padrão. Se o excesso de evaporação for observado ou o crescimento celular for retardado, todos os parâmetros críticos da incubadora devem ser medidos para garantir ajustes precisos. Mais água pode ser adicionada à tampa do tecido ou à pequena placa de Petri colocada dentro da câmara de cultura celular, ou os meios devem ser trocados com mais frequência. Além disso, as bolhas podem entrar no canal inferior e ficar presas na trincheira para dispositivos de trincheira. Embora eles possam ser removidos, é mais fácil evitar a adição de bolhas em primeiro lugar. Para fazer isso, é importante verificar se não há bolhas na ponta da pipeta ou ar na extremidade da ponta da pipeta antes de pipetar o meio para a câmara inferior. Além disso, a evaporação do meio no canal pode levar a uma lacuna entre a superfície do meio e o topo da porta. Um pequeno volume de mídia pode ser pipetado em uma porta até que a mídia atinja a superfície da porta oposta, após o que a mídia pode ser trocada nessa porta oposta. Enquanto os meios hECSR e E6 + 10% FBS não devem ser aquecidos em banho-maria, outros meios podem ser pré-aquecidos para reduzir a formação de bolhas. Se uma bolha entrar na câmara inferior, ela pode ser removida pipetando rapidamente 100 μL através do canal. No entanto, este método pode levar à contaminação entre câmaras ou meios derramados pela superfície do dispositivo. Também pode interromper as camadas celulares. Alternativamente, a mídia pode ser removida do canal primeiro e depois reintroduzida com um volume de 50 μL. Remover a mídia primeiro, no entanto, pode resultar em mais formação de bolhas no canal. Se uma bolha não estiver diretamente sob a área da membrana, ela pode ser deixada no canal sem efeitos na cultura celular.
A fixação e o crescimento dos pericitos, como demonstrado na Figura 2, podem ser desafiadores. O uso de uma densidade de semeadura otimizada é essencial para a formação de uma camada com uma relação perícito-célula endotelial fisiologicamente relevante. Além disso, como os pericitos são sensíveis ao cisalhamento, todas as trocas de mídia no canal devem ser feitas muito lentamente para proteger as células. Para a cultura de CPPC, uma melhor fixação pode ser obtida revestindo-se a câmara inferior com 800 μg/mL de colágeno tipo IV ou 100 μg/mL de fibronectina.
A imunocitoquímica nos dispositivos aqui descritos permite a análise qualitativa da saúde e função celular. Os métodos de coloração em placas de cultura de tecidos ou outras plataformas devem ser diretamente traduzíveis para a plataforma. Para cultura celular apenas na câmara superior, após a fixação, o PBS pode ser adicionado à câmara inferior e deixado para as etapas restantes, com bloqueio e coloração feitos apenas na câmara superior. Isso minimiza os riscos de quebrar as membranas ou obter bolhas na câmara inferior. Para coloração de cocultura, recomendamos o uso de ambas as câmaras em todas as etapas. É importante notar que a viscosidade do fixador e PBS é diferente da do meio. Assim, pode ser mais fácil adicionar bolhas na câmara inferior, e deve-se tomar cuidado extra para verificar as pontas da pipeta para o ar no final da ponta antes de pipetar para a câmara inferior.
O protocolo descrito para o ensaio de permeabilidade de moléculas pequenas permite a avaliação funcional e quantitativa da função de barreira das células endoteliais cultivadas no aparelho de μSiM. Um problema que pode ser encontrado durante este ensaio é desenhar bolhas de ar na pipeta durante a coleta de amostra do canal inferior na etapa de protocolo 4.1.7.4. Para evitar esse problema, é importante certificar-se de que a ponta esteja selada na porta antes de iniciar a coleta de amostras e que a amostra não deve ser retirada muito rápido. Se isso não resolver o problema, o tamanho das pontas usadas pode ser muito pequeno ou muito grande para caber nas portas; use as dicas listadas na Tabela de Materiais. Se valores de permeabilidade inesperadamente altos forem medidos apesar de uma monocamada confluente de aparência saudável, a integridade da monocamada deve ser verificada quanto à interrupção durante a coleta da amostra. Recomendamos sempre verificar a monocamada ao microscópio imediatamente após a coleta da amostra. Se a monocamada ainda parece intacta e saudável, a amostra pode ser fixada e marcadores biológicos de função de barreira podem ser avaliados, por exemplo, via imunomarcação das proteínas juncionais. Por outro lado, se forem medidos valores de permeabilidade inesperadamente baixos, é importante garantir que 50 μL de meio sejam amostrados do canal inferior sem bolhas de ar. Se o meio sair do porto de amostragem assim que a ponta do reservatório for colocada, esse meio deve ser coletado antes de encaixar a pipeta no porto de amostragem, pois a maior parte da pequena molécula fluorescente estará presente no volume inicial de 10 μL amostrado do canal de fundo. Desenhar círculos ao redor das portas usando uma caneta hidrofóbica ou colocar uma fita hidrofóbica com um orifício ao redor da porta impede que qualquer mídia passivamente bombeada se espalhe. Se as bolhas forem retiradas durante a colheita de amostras ou se a amostra total de 50 μL não for removida, a amostra não deve ser utilizada. Alternativamente, o volume exato pode ser determinado e usado no cálculo da permeabilidade; no entanto, isso só deve ser feito se o volume removido for de ≥40 μL, o que corresponde a ~98-99% de recuperação do corante34.

Os tecidos vivos são compartimentalizados por células especializadas que criam e mantêm barreiras e regulam quais células e moléculas são transportadas de um compartimento para outro. A regulação inadequada das funções de barreira pode ser fonte tanto de doenças agudas quanto de doenças crônicas. A barreira hematoencefálica (BHE) é a barreira tecidual mais restritiva do corpo humano1. A disfunção da BHE está subjacente a uma ampla gama de doenças do sistema nervoso central (SNC), incluindo doença de Alzheimer2, doença de Parkinson 3,4 e esclerose múltipla 5,6. A lesão no BBB também está ligada ao comprometimento cognitivo de longo prazo como resultado de distúrbios agudos, como sepse7, COVID-198 e delírio pós-operatório9. O desenvolvimento de drogas com potencial para tratar distúrbios cerebrais tem sido frustrantemente difícil devido ao desafio de intencionalmente romper o BBB para entregar moléculas bioativas a alvos no cérebro10. Por essas razões, métodos para estudar a função da BHE in vitro são de suma importância para o entendimento e tratamento das doenças do SNC.
Os métodos básicos para medir a função de barreira in vitro envolvem o estabelecimento de uma monocamada ou co-cultura em uma membrana semipermeável e a medição da resistência conferida pelas células à difusão de pequenas moléculas ou pequenas correntes elétricas11,12,13,14. Embora o surgimento de sistemas microfisiológicos (MPS) tenha produzido uma abundância de opções para a modelagem da BBB em 3D15,16, a diversidade de geometrias de sistemas dificulta a comparação de medidas de permeabilidade entre MPS ou com valores estabelecidos na literatura. O estabelecimento de valores basais confiáveis é particularmente importante na pesquisa de BHE, onde, devido à extensa regulação de barreira pelas células endoteliais vasculares cerebrais, os valores de permeabilidade in vitro são altamente examinados12,17,18. Por essas razões, as medidas de permeabilidade através de monocamadas estabelecidas em membranas 2D permanecerão um grampo nos estudos de BBB nos próximos anos. Isso vale para outras barreiras teciduais, incluindo as barreiras epiteliais, onde valores absolutos de permeabilidade basal são utilizados para validar e comparar modelos in vitro 19,20,21.
Com o objetivo de estabelecer uma nova ferramenta valiosa para a comunidade de pesquisa BBB, introduzimos22 e avançamos23,24,25,26 o microdispositivo com uma plataforma de silicon membrane (μSiM) para uso em modelagem de tecidos de barreira nos últimos 5 anos. A característica habilitante da plataforma é uma membrana ultrafina (<100 nm de espessura) com centenas de milhões de nanoporos 27,28 ou uma mistura de nanoporos e microporos29. Os chips de membrana independentes são produzidos em um 'chip' de silício de 300 μm que estabiliza as estruturas ultrafinas30 e permite que elas sejam manuseadas por pinças para a montagem do dispositivo. Devido à sua natureza ultrafina, as membranas têm uma permeabilidade duas ordens de magnitude maior do que a das membranas convencionais condicionadas por esteira usadas em dispositivos comerciais de cultura de membranas31,32. Na prática, isso significa que o impedimento da membrana para a difusão de moléculas menores que os nanoporos (<60 nm) é desprezível33. Assim, para as barreiras celulares, somente as células e as matrizes por elas depositadas determinarão a taxa de transporte de pequenas moléculas dos compartimentos apical para os basais que estão separados pela membrana34. O design do dispositivo e a natureza ultrafina das membranas também fornecem muitas vantagens para a microscopia óptica. Estes incluem 1) a capacidade de seguir culturas vivas usando contraste de fase ou imagens de campo brilhante, 2) a capacidade de colorir fluorescentemente e obter imagens in situ sem a necessidade de extrair e transferir a membrana para um vidro de cobertura, e 3) o fato de que as membranas são mais finas do que "fatias" confocais, de modo que as coculturas diretas têm um espaçamento mais natural entre os tipos celulares do que pode ser alcançado com membranas gravadas por trilha de 6-10 μm de espessura.
Mais recentemente, avançamos a plataforma para um formato modular para facilitar a montagem rápida34 e a personalização35,36. Aproveitamos o formato modular para distribuir componentes de dispositivos entre nossos laboratórios de bioengenharia e laboratórios de barreira cerebral colaboradores. Em seguida, desenvolvemos conjuntamente protocolos para montagem de dispositivos, monocultura e co-cultura, coloração por imunofluorescência e permeabilidade de pequenas moléculas e mostramos que esses métodos eram reprodutíveis entre laboratórios. Usando esses protocolos, também mostramos que a plataforma modular suporta uma BHE validada desenvolvida usando o método de cultura endotelial estendida (EECM) para criar células endoteliais cerebrais semelhantes a microvasculares (BMEC) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs)37. O objetivo do presente relatório é revisar esses métodos com mais detalhes e, com o auxílio do vídeo que o acompanha, facilitar a adoção mais ampla da plataforma na comunidade BBB.

<table><tbody><tr><td><forte>anticorpos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31 Anticorpo policlonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-32321</td><td></td></tr><tr><td>Claudin-5 anticorpo IgG de camundongo, 4C3C2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35-2500</td><td></td></tr><tr><td>Cabra &alpha;-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Cabra &alpha;-Coelho IgG Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>NG2, mouse IgG2a, 9.2.27</td><td>Millipore</td><td>&nbsp; </td><td></td>MAB2029</tr><tr><td>anticorpo IgG de camundongo oclusina, OC-3F10</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&beta;, anticorpo IgG de coelho, 28E1</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3169</td><td></td></tr><tr><td>VE-caderina camundongo IgG2B Clone # 123413</td><td>R& D Systems</td><td>MAB9381</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo IgG de coelho ZO-1, policlonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals, peptides, e proteínas recombinantes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% Metanol</td><td>VWR</td><td>101443-718</td><td>Pode ser substituído por produtos similares</td></tr><tr><td>16% Paraformaldeído</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Pode ser substituído por produtos similares</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>suplemento B27</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno IV da placenta humana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno, solução tipo I da cauda de rato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>Pode ser substituído por produtos similares</td></tr><tr><td>DMEM/Ham' s F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>Fetal soro bovino (FBS)</td><td>Peak Serum</td><td>PS-FB1</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina de plasma bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina proteína humana, plasma</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33016015</td><td>Pode ser substituído por produtos similares</td></tr><tr><td>hESFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11111044</td><td></td></tr><tr><td>Lúcifer Amarelo CH sal de dilítio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861502</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>500627</td><td>Pode ser substituído por produtos similares</td></tr><tr><td>PBS sem cálcio, magnésio</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.01</td><td>Pode ser substituído por produtos similares</td></tr><tr><td>Pericyte Medium</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td>Use o kit completo (inclui suplementos)</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine, 10 mg/mL</td><td>ScienCell</td><td>0413</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>JT Baker</td><td>X198-05</td><td>Pode ser substituído por produtos similares</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Água Destilada</td><td>Invitrogen&trade;</td><td>10977015</td><td>Pode ser substituído por produtos similares</td></tr><tr><td><forte>Modelos experimentais: Linhas celulares</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barreira hematoencefálica hCMEC/D3 Linha celular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>Pericitos vasculares cerebrais humanos</td><td>ScienCell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>iPS(IMR90)-4 células-tronco pluripotentes induzidas por humanos</td><td>WiCell</td><td>RRID:CVCL_C437</td><td></td></tr><tr><td>Glassware and Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 mm TC-treated Cell Culture Plate com 20 mm Grid</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Clamps</td><td>VWR</td><td>MFLX06832-10</td><td></td></tr><tr><td>Corning Placas de cultura de tecidos (6 poços)</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Microplacas planas sem ligação de 96 poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>Suporte para Dispositivo de Lâmina de Microscópio</td><td> SiMPore</td><td>USIM-SB</td><td>Dimensões compatíveis com suportes de lâminas de microscópio</td></tr><tr><td>Nunc 15 mL Tubos de centrífuga cônicos estéreis de polipropileno</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL Tubos de centrífuga cônicos estéreis de polipropileno</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>339653</td><td>tampas de tubos podem ser preenchidas com água para cultura de células</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta P20-200</td><td>VWR</td><td>76322-516</td><td>Marcas alternativas podem não selar tão efetivamente nos portos</td></tr><tr><td>Filtros Transwell (12 poços, 12 mm, 0,4 &mu; tamanho do poro m, PC)</td> <td>CoStar</td><td>3401</td><td></td></tr> <tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>10X Objective (para Andor)</td> <td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRD00105</td><td>Ar; WD: 4 mm; NA 0.45</td></tr><tr><td>Objetiva 10X (para Nikon)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRP40102</td><td>Ar; WD: 6,2 mm; NA 0.25</td></tr><tr><td>40X Objetiva (LWD) (Para Andor)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRD77410</td><td>Imersão em água; WD: 590-610 mm; Microscópio</td></tr><tr><td>confocal de disco giratório NA</td> 1.15 Andor Oxford <td>Instruments, Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ts2 Microscópio de contraste de fase</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>Pode ser substituído por produtos similares</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M200</td><td>TECAN</td><td></td><td>Pode ser substituído por produtos similares</td></tr><tr><td><forte>Outros</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caneta PAP Avançada</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z672548</td><td>ponta de 2 mm é recomendada</td></tr><tr><td>Kit de montagem com acessórios</td><td>SiMPore</td><td>USIM-JIGSET</td><td>Incluindo acessórios A1, A2, B1 e B2</td></tr><tr><td>Adaptador de Câmera para Microscópios</td><td>AmScope</td><td>CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR</td><td>&Phi; 23.2 - &phi; Adaptador 30 se encaixa Nikon Eclipse Ts2</td></tr><tr><td>Canon EOS Rebel SL3 Câmera DSLR</td><td>Canon</td><td>EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001</td><td>Pode ser substituído por produtos similares</td></tr><tr><td>Filtro de células, 40 &micro; m</td><td>Millipore Sigma (Corning)</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>Componente 1</td><td>SiMPore</td><td>USIM-C1</td><td></td></tr><tr><td>Componente 2</td><td>SiMPore</td><td>USIM-C2</td><td></td></tr><tr><td>Chips de membrana</td><td>SiMPore</td><td>NPSN100-1L</td><td>Outros formatos de chips estão disponíveis</td></tr><tr><td>Pinça de manuseio SMD ângulo duplo</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW003</td> <td>"Pinças de chip"</td></tr> <tr><td>Inoxidável tipo de aço pinça GG</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW534</td> <td>"Pinças retas"</td></tr> <tr><td> Software</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Para processamento de imagem</td></tr><tr><td>Fusion</td><td>Oxford Instruments, Andor</td><td></td><td>Instruções para a versão 2.3.0.44</td></tr><tr><td>i-control</td><td>TECAN</td><td></td><td>Instruções para a versão 2.0</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Para processamento de imagens. Instruções para a versão 9.9.0</td></tr></tbody></table>

uso da plataforma de tecido de barreira microsim (μsim) para modelagem da barreira hematoencefálica

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

O microSiM (μSiM) é uma plataforma de cultura baseada em membrana para modelagem da barreira hematoencefálica (BHE). Ao contrário das plataformas convencionais baseadas em membrana, o μSiM fornece aos experimentalistas novas capacidades, incluindo imagens de células vivas, sinalização parácrina sem obstáculos entre câmaras de "sangue" e "cérebro" e a capacidade de obter imagens diretas de imunofluorescência sem a necessidade de extração/remontagem de membranas. Aqui demonstramos o uso básico da plataforma para estabelecer modelos de monocultura (células endoteliais) e co-cultura (células endoteliais e pericitos) da BBB usando membranas de nitreto de silício nanoporosas ultrafinas. Demonstramos compatibilidade com culturas de células primárias e culturas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC). Fornecemos métodos para análise qualitativa de modelos de BBB via coloração por imunofluorescência e demonstramos o uso do μSiM para a avaliação quantitativa da função de barreira em um ensaio de permeabilidade de moléculas pequenas. Os métodos fornecidos devem permitir que os usuários estabeleçam seus modelos de barreira na plataforma, avançando no uso da tecnologia de chips de tecido para estudar tecidos humanos.

A montagem de um dispositivo de trincheira é mostrada na Figura 1. As luminárias orientam a montagem dos componentes e do chip de membrana. O componente 1 é principalmente acrílico com uma superfície PSA para ligação ao cavaco e uma abertura para a câmara inferior e portas para acesso de pipeta à câmara inferior. O componente 2 é a camada do canal e contém um "triângulo" não adesivo e livre de PSA no canto superior direito para preensão. Os dispositivos de trincheira fornecem uma área plana de crescimento de cultura de células na câmara superior, enquanto os dispositivos de trincheira têm uma superfície plana para cultura de células na câmara inferior.
Foram realizadas monoculturas e co-culturas endoteliais de hCMEC/D3 e HBVPs e de células EECM-BMEC-like derivadas do hiPSC IMR90-4 e BPLCs e imagens de fase adquiridas usando um microscópio de contraste de fase Nikon Eclipse Ts2 e objetiva de 10x (Figura 2). Densidades ótimas de semeadura para cultura de células primárias são mostradas (imagens obtidas 1 dia após a semeadura), bem como HBVPs sub-semeadas (Figura 2A). As imagens finais da fase de cocultura e monocultura (6 dias de cultura de células endoteliais) podem ser difíceis de distinguir (Figura 2C), e a confirmação de co-cultura de células primárias bem-sucedida pode exigir a coloração por imunofluorescência (ver secção 3 do protocolo). Densidades de semeadura BPLC derivadas de hiPSC baixas, altas e ótimas também são ilustradas (Figura 2B). A co-cultura derivada da hiPSC é mais clara de distinguir na imagem de contraste de fase em comparação com as coculturas primárias (Figura 2D). A semeadura baixa da CPPC resulta em baixa cobertura de pericitos e aglomeração de pericitos, enquanto a sobressemeadura resulta na descamação da camada de pericitos da membrana. Além disso, a troca do meio na câmara inferior muito rapidamente pode resultar em perda de pericitos, pois essas células são muito sensíveis ao cisalhamento. A cobertura ótima pelos pericitos é de ~90% para um modelo BBB, sem lacunas na camada endotelial.
Imagens representativas da co-cultura derivada de hiPSC imunomarcada estão ilustradas na Figura 3 (6 dias de cultura de células endoteliais). BPLCs derivadas de IMR90-4 foram coradas para o marcador de pericitos PDGFRβ, e células EECM-BMEC-like derivadas de IMR90-4 foram coradas para o marcador de junção de aderentes VE-caderina. Hoechst foi usado para corar os núcleos. As imagens foram adquiridas em microscópio confocal Spinning Disc com objetiva LWD 40x com cortes de 0,2 μm e processadas com Imaris. Ambas as camadas celulares podem ser visualizadas mesmo que a fina nanomembrana não seja vista.
Realizamos o ensaio de permeabilidade de pequenas moléculas baseado em amostragem usando as mesmas condições experimentais em dois laboratórios fisicamente distantes na Universidade de Berna, Suíça, e na Universidade de Rochester, NY, EUA para demonstrar a reprodutibilidade interlaboratorial dos resultados (Figura 4)34. Células EECM-BMEC-like derivadas do hiPSC IMR90-4 foram cultivadas no aparelho μSiM por 2, 4 ou 6 dias e em filtros transwell por 6 dias. O ensaio foi realizado utilizando-se 150 μg/mL de Lucifer Yellow (457 Da) em ambos os laboratórios. A alta variabilidade na permeabilidade das células endoteliais cultivadas por 2 dias no aparelho indica que 2 dias de cultura foram insuficientes para a maturação da barreira. Não houve diferenças significativas na permeabilidade entre os laboratórios na maturação da barreira a partir de 4 dias. Mostramos também que a permeabilidade das células endoteliais cultivadas em μSiM e filtros transwell por 6 dias coincidiu com aquelas previamente publicadas40.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig01.jpg"> Figura 1: Etapas da montagem μSiM . (A) Prepare o chip colocando-o no acessório A1. Coloque a trincheira de cavacos para cima para um dispositivo final de trincheira. Coloque a trincheira de cavacos para baixo para um dispositivo de trincheira final. (B) Ligue o componente 1 ao chip, removendo as máscaras de proteção do componente 1 e colocando-o virado para baixo em FA1. Colagem aplicando pressão com o acessório A2. (C) Unir o componente 2 e o componente 1, removendo o componente 2 de sua folha e descascando as camadas protetoras superiores. Coloque o canal no acessório B1 e coloque o componente 1 em cima do componente 2 virado para cima. Colagem aplicando pressão com o acessório B2. Abreviações: FAn = fixture An; FBn = acessório Bn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig02.jpg"> Figura 2: Esquema de cocultura e imagens representativas de contraste de fase de cultura de células em dispositivos. (A) Localização do pericito e semeadura das células endoteliais. (B) Vista lateral esquemática da localização das células através da trincheira do chip de membrana. (C) Imagens representativas de densidades de semeadura baixas e ótimas para HBVP primário e linhagem endotelial cerebral hCMEC/D3. As imagens foram adquiridas 1 dia após a semeadura (HBVP) e 2 h após a semeadura (hCMEC/D3). (D) Imagens representativas de baixas, altas e ótimas densidades de semeadura para células semelhantes a pericitos cerebrais derivadas de hiPSC. As imagens foram adquiridas 1 dia após a semeadura. (E) Imagens representativas da co-cultura final de HBVP e hCMEC/D3 e da monocultura hCMEC/D3. As imagens foram adquiridas 8 dias após a semeadura do HBVP e 7 dias após a semeadura do hCMEC/D3. (F) Imagens representativas de co-cultura de células BPLC e EECM-BMEC-like falhadas e bem-sucedidas e monocultura de células EECM-BMEC-like. As imagens foram adquiridas 7 dias após a semeadura BPLC e 6 dias após a semeadura EECM-BMEC. As culturas de BPLC subsemeadas não têm cobertura suficiente, enquanto as culturas de BPLC sobresemeada crescerão superconfluentes e começarão a se aglomerar/recuar. Barras de escala = 100 μm (C-F). Abreviações: HBVPs = pericitos vasculares cerebrais humanos; hiPSC = células-tronco pluripotentes induzidas por humanos; BPLCs = células semelhantes a pericitos cerebrais derivadas de hiPSC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig03.jpg"> Figura 3: Imagens representativas da co-cultura celular derivada de hiPSC imunocorada em dispositivos. As células foram coradas para o marcador de células endoteliais VE-caderina (verde), marcador de pericitos PDGFRβ (vermelho) e corante nuclear (azul). Duas camadas de células podem ser vistas próximas, separadas apenas por uma fina nanomembrana de nitreto de silício (seta branca marca a localização da membrana na imagem à esquerda). Barra de escala = 50 μm. Abreviações: hiPSC = human induced pluripotent stem cell; PDGFRβ = receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig04.jpg"> Figura 4: Ensaio de permeabilidade de pequenas moléculas baseado em amostragem. (A) Esquema do fluxo de trabalho experimental. (B) Demonstração da reprodutibilidade interlaboratorial entre dois laboratórios fisicamente distantes da Universidade de Berna (UniBe), Suíça, e da Universidade de Rochester (UR), NY, EUA: células endoteliais derivadas de hiPSC foram cultivadas no aparelho de μSiM por 2, 4 ou 6 dias e em filtros transwell por 6 dias. O ensaio de permeabilidade foi realizado utilizando-se 150 μg/mL de Amarelo Lúcifer (457 Da). A barra vermelha indica os dados de permeabilidade à fluoresceína sódica (376 Da) previamente publicados das mesmas células endoteliais derivadas da hiPSC cultivadas por 6 dias em filtros transwell40. N = 4-16 por grupo. Utilizou-se ANOVA two-way com post hoc de Tukey, e as comparações foram apresentadas apenas para p relevante &lt; 0,05. (C) Demonstração da resposta de citocinas usando células EECM-BMEC-like derivadas de hiPSC cultivadas no μSiM por 2 dias; 0,1 ng/mL de TNFα + 2 UI/mL de IFNγ) ou meio controle (não estimulado, NS) foi adicionado à câmara superior por 20 horas antes do ensaio de permeabilidade usando 150 μg/mL de Lucifer Yellow. N = 3 por grupo. Teste t de Student, p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Área de superfície de semeadura da câmara superior</td>
			<td>Volume do poço superior</td>
			<td>Área de superfície de semeadura da câmara inferior</td>
			<td>Volume do canal inferior</td>
		</tr><tr><td>~37 milímetros2</td>
			<td>100 μL (pode conter ≥115 μL)</td>
			<td>~42 milímetros2</td>
			<td>10 μL (pipetar 20 μL para evitar bolhas)</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Área superficial e volumes críticos de μSiM.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Alvo</td>
			<td>Fixador</td>
			<td>Solução de bloqueio</td>
			<td>Diluição</td>
		</tr><tr><td>VE-caderina</td>
			<td>4% PFA ou 100% MeOH</td>
			<td>5% GS + 0,4% Tx-100 ou 10% GS + 0,3% Triton X-100</td>
			<td>1:50</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>4% PFA ou 100% MeOH</td>
			<td>5% GS + 0,3-0,4% Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>Claudin-5</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0,3% Triton X-100</td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>ZO-1</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0,3% Triton X-100</td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>Ocludina</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0,3% Triton X-100</td>
			<td>1:50</td>
		</tr><tr><td>PDGFRβ</td>
			<td>4% PFA</td>
			<td>5% GS + 0,4% Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>GN2</td>
			<td>4% PFA</td>
			<td>5% GS + 0,4% Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>Cabra α-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>Cabra α-Mouse IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Anticorpos e métodos de coloração validados para imunocitoquímica de co-cultura em dispositivos de μSiM. Abreviações: PFA = paraformaldeído; MeOH = metanol; GS = soro caprino.
Arquivo Suplementar 1: Modelo para cálculo do valor de permeabilidade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258_SupplementalFile_SamplingCalcTemplate_Updated.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Este relatório fornece protocolos para montagem, cultura de células e ensaios na plataforma μSiM para a construção de modelos de barreira hematoencefálica.

Uso da Plataforma de Tecido de Barreira MicroSiM (μSiM) para Modelagem da Barreira Hematoencefálica

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

Estamos desenvolvendo um modelo GI tecidual da barreira hematoencefálica para entender o impacto da sepse no cérebro e a contribuição de fatores transmitidos pelo sangue. Usando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. Pretendemos avaliar a contribuição de fatores genéticos para a suscetibilidade de determinadas populações de pacientes.Os desafios experimentais atuais dentro da comunidade de chips de tecidos são a reprodutibilidade dos resultados e a adoção de técnicas por laboratórios externos. Projetos exclusivos de chips de tecido, pequenos volumes dentro de chips de tecido e falta de ensaios funcionais padrão contribuem para esses desafios e muitas vezes limitam os usuários a ensaios baseados em fluorescentes como sua saída primária. Os dispositivos Micro simm oferecem modularidade para modelagem in vitro versátil, uma superfície de luz de vidro ideal para imagens de estilo de vida de alta resolução e ultra syn 100 nanômetros, membrana nano altamente produzida, garantindo crosstalk de fator solúvel contínuo e ensaios de permeabilidade precisos.Com o micro simm, vimos que tipos específicos de células tendem a produzir mais proteínas da matriz que fornecem um arcabouço de suporte ao redor dos vasos sanguíneos cerebrais. Agora podemos perguntar se a inflamação faz com que essas mesmas células fortaleçam ou quebrem suas matrizes, alterando assim a integridade da barreira. No futuro, adicionaremos outro compartimento ao modelo com células verdes, como astrócitos e micróglia, para estudar como essas células interagem com a barreira hematoencefálica em casos de inflamação sistêmica, como a sepse.Também planejamos investigar causas adicionais de inflamação sistêmica, como delírio pós-operatório, sobreposto à demência.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este método descreve como isolar e imortalizar células endoteliais microvasculares de cérebro de rato. Descreve-se um protocolo de passo-a-passo a partir da homogeneização do tecido cerebral, as etapas de digestão, a semeadura e imortalização das células. Normalmente, leva cerca de cinco semanas, para se obter uma homogeneidade, linha celular imortalizada microvascular endotelial.

Geração de uma Murine Cérebro Imortalizado linha celular endotelial microvascular como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Sangue Cérebro Modelo Barreira

Estabelecimento de modelos humanos da barreira sangue-cérebro (BBB) ​​pode beneficiar de pesquisa em condições cerebrais associadas com insuficiência certificação. Descrevemos aqui uma técnica melhorada para a preparação de um modelo de certificação de contacto, o que permite coculturing de astrócitos e células endoteliais cerebrais sobre os lados opostos de uma membrana porosa.

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

O objetivo do presente estudo foi validar a reprodutibilidade de um modelo in vitro BBB envolvendo um singênico rato co-cultura de células endoteliais e astrócitos. A monocamada de células endoteliais apresentaram alta TEER e baixa permeabilidade LY. Expressão de proteínas TJ específicos, foram avaliadas as respostas funcionais a inflamação e a funcionalidade de transportadores e receptores.

Criação de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rato barreira hemato-encefálica (BBB): A Focus on BBB impermeabilidade e Transportes Receptor mediada

Aqui, descrevemos um modelo murino in vitro da barreira hematoencefálica que faz uso de espectroscopia de impedância celular, com foco nas consequências na integridade e permeabilidade das células endoteliais após a interação com células T ativadas.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da barreira sangue-cérebro que usa espectroscopia de impedância: Um foco na interação celular T Cell-endotelial

O objectivo do protocolo é apresentar um processo otimizado para o estabelecimento de um modelo barreira hemato - encefálica (BBB) em vitro baseado em células endoteliais cerebrais primários de suínos (pBECs). O modelo mostra grande reprodutibilidade, alta tensão e é apropriado para estudos de transporte e o tráfico intracelular de fármacos.

Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

Capilares do cérebro isolado do tecido do cérebro humano podem ser usados como um modelo pré-clínicos para estudar a função de barreira sob condições fisiológicas e fisiopatológicas. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para isolar os capilares do cérebro do tecido do cérebro humano fresco.

Isolamento dos capilares cerebrais do tecido do cérebro humano fresco

Aqui nós apresentamos um protocolo descreve a configuração de um cellulo em BBB (barreira hemato-encefálica)-cultura de poliéster membrana porosa Minibrain inserir o sistema a fim de avaliar o transporte de biomoléculas ou agentes infecciosos em um BBB humana e seus fisiológico impacto sobre as células cerebrais vizinhas.

Um modelo de Interface de sangue-cérebro humano para estudar os cruzamentos de barreira por agentes patogénicos ou medicamentos e suas interações com o cérebro

A barreira hematoencefálica (BBB) é uma unidade neurovascular multicelular que regula fortemente a homeostase cerebral. Ao combinar iPSCs humanos e tecnologias de organ-on-chip, geramos um chip BBB personalizado, adequado para modelagem de doenças e previsões de penetrabilidade de medicamentos CNS. Um protocolo detalhado é descrito para a geração e operação do chip BBB.

Geração de um chip de barreira hematoencefálica baseada no iPSC humano

Este protocolo descreve um método para estabelecer um modelo in vitro de barreira hematoencefálica humana (BBB). As células endoteliais e os pericitos são semeados em cada lado de um filtro de inserção (compartimento sanguíneo), e os astrócitos são semeados no poço inferior (compartimento cerebral). O modelo caracterizado foi utilizado para experimentos de transporte de nanopartículas.

Um sistema celular de cultura tripla modelando a barreira hematoencefálica humana

A barreira hematoencefálica (BHE) tem um papel crucial na manutenção de um ambiente cerebral estável e saudável. A disfunção da BHE está associada a muitas doenças neurológicas. Desenvolvemos um modelo 3D, derivado de células-tronco do BBB para investigar a patologia cerebrovascular, a integridade do BBB e como o BBB é alterado pela genética e pela doença.

Reconstrução da Barreira Hematoencefálica In Vitro para Modelar e Combater Terapeuticamente a Doença Neurológica

Este protocolo descreve uma plataforma de cultura celular baseada em membrana reconfigurável que integra o formato de poço aberto com recursos de fluxo de fluido. Esta plataforma é compatível com protocolos padrão e permite transições reversíveis entre os modos de cultura de poço aberto e microfluídica, acomodando as necessidades dos laboratórios de engenharia e biociências.

Transformando Modelos de Tecidos de Barreira Estática em Sistemas Microfisiológicos Dinâmicos

Aprenda a usar a plataforma microSiM para modelar a barreira hematoencefálica in vitro com células-tronco pluripotentes humanas. Este método avança pesquisas sobre inflamação sistêmica e função cerebral.

Uso da Plataforma de Tecido de Barreira MicroSiM (μSiM) para Modelagem da Barreira Hematoencefálica

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