Sistema de Pseudoilhotas Humanas para Avaliação Síncrona da Dinâmica de Biossensores Fluorescentes e Perfis Secretores de Hormônios
3 de novembro de 2023
Este protocolo descreve um método para a aquisição sincrônica e o co-registro de eventos de sinalização intracelular e a secreção de insulina e glucagon por pseudoilhotas humanas primárias usando a entrega adenoviral de um biossensor cíclico de adenosina monofosfato (AMPc), um detector de diferença de AMPc in situ (cADDis) e um sistema de microperfusão.
Nosso laboratório está trabalhando para entender, prevenir e reverter a disfunção das células beta e outras anormalidades palpebrais no diabetes tipo um e tipo dois. Nossos estudos se concentram na patogênese do diabetes humano, integrando estudos da biologia do pâncreas e das pálpebras humanas e da saúde e doença. Os ilhós humanos são estruturas esféricas 3D, e o acesso às células ao longo de todo o ilhós apresenta alguns desafios experimentais.
Por exemplo, ao tentar introduzir biossensores para entender a sinalização das células dos ilhós, nosso protocolo de pseudopálpebras supera esse desafio realizando manipulações genéticas no estado de célula única e agregando essas células de ilhós humanos transduzidas em pseudopálpebras para estudos a jusante. Nosso sistema de pseudopálpebras nos permite expressar biossensores em todo o ilhó, em vez de apenas na superfície palpebral. Combinado com nossa imagem de células vivas e sistema de microperfusão, podemos medir e co-registrar processos intracelulares dinâmicos com a secreção hormonal a jusante.
Este protocolo poderia ser aplicado para responder a uma variedade de questões científicas importantes. Por exemplo, estratégias de silenciamento gênico poderiam ser combinadas com essa abordagem para entender o impacto de um gene de interesse na função palpebral e vias de sinalização associadas, seja globalmente ou de maneira auto-específica.
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Visão Geral
Este estudo aborda a disfunção das células beta e anormalidades das ilhotas no diabetes, utilizando um sistema modelo de pseudoilhota para aquisição síncrona de sinalização celular e secreção hormonal. O método emprega a entrega adenoviral de um biossensor de cAMP e um sistema de microperifusão para permitir a análise dinâmica das respostas de insulina e glucagon.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Diabetes Tipo 1 e Tipo 2
- Biologia das ilhotas humanas
- Dinâmica de sinalização celular
Fundo
- As ilhotas humanas são estruturas esféricas que apresentam desafios experimentais.
- O protocolo de pseudoilhota resolve esses desafios para uma introdução eficaz do biossensor.
- Entender a sinalização da ilhota é crítico para a pesquisa do diabetes.
Métodos Utilizados
- Entrega adenoviral para expressão do biossensor
- Modelo de pseudoilhota humana primária
- Sistema de microperifusão para medição da secreção hormonal
Principais Resultados
- Co-registro bem-sucedido de sinalização intracelular e liberação de hormônios.
- Permitiu a análise dos efeitos do silenciamento gênico na função da ilhota.
- Monitoramento dinâmico das respostas de secreção em tempo real.
Conclusões
- Este estudo fornece um protocolo robusto para examinar a sinalização hormonal da ilhota.
- Tem implicações significativas para a compreensão da biologia das ilhotas no diabetes.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
The human pseudoislet system enables synchronous, quantitative assessment of intracellular signaling and hormone secretion in primary human islet cells, addressing a critical bottleneck in diabetes target validation. By allowing genetic manipulation and biosensor integration throughout the 3D islet structure, this platform enhances predictive confidence in mechanistic studies and supports risk-adjusted portfolio decisions in metabolic disease research. Its integration of live-cell imaging and microperifusion workflows positions it as a reusable capability for early discovery and translational research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking intracellular signaling to hormone secretion in human islet cells.
- Facilitates biological de-risking through gene-silencing or biosensor-based pathway clarification in a physiologically relevant 3D context.
- Supports predictive confidence and functional target validation for diabetes and metabolic disease programs.
Screening & Assay Development
- Prepares validated pseudoislet systems for downstream compound screening and mechanistic assays.
- Standardizes assay conditions for reproducible, quantitative measurement of hormone secretion and biosensor dynamics.
- Enables scalable, multiplexed evaluation of candidate interventions in a human-relevant model.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant human islet biology for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic de-risking in primary human tissue.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by integrating functional and signaling readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This system bridges early discovery, target validation, and preclinical research by enabling hypothesis-driven interrogation of islet signaling and function in a single workflow.
- Discovery Biology: Supports mechanistic hypothesis testing and pathway clarification via synchronous biosensor and hormone readouts.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible pseudoislet models for quantitative evaluation of interventions.
- Analytics: Provides dynamic, quantitative measurements of cAMP signaling and hormone secretion for robust condition comparison.
- Translational Research: Connects in vitro mechanistic insights to human disease biology, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for repeated use across metabolic disease discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in diabetes target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of islet functional assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by integrating functional and signaling data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of metabolic disease assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human islet isolation, genetic manipulation, and live-cell imaging.
- Demands access to confocal microscopy, microperifusion systems, and quantitative hormone analytics.
- Necessitates cross-team standardization of pseudoislet preparation and assay protocols.
- Adaptation may be needed for different donor sources or disease models.
- Throughput and scalability are limited by primary tissue availability and technical complexity.
