Sistema de Pseudoilhotas Humanas para Avaliação Síncrona da Dinâmica de Biossensores Fluorescentes e Perfis Secretores de Hormônios
November 3rd, 2023
Este protocolo descreve um método para a aquisição sincrônica e o co-registro de eventos de sinalização intracelular e a secreção de insulina e glucagon por pseudoilhotas humanas primárias usando a entrega adenoviral de um biossensor cíclico de adenosina monofosfato (AMPc), um detector de diferença de AMPc in situ (cADDis) e um sistema de microperfusão.
Nosso laboratório está trabalhando para entender, prevenir e reverter a disfunção das células beta e outras anormalidades palpebrais no diabetes tipo um e tipo dois. Nossos estudos se concentram na patogênese do diabetes humano, integrando estudos da biologia do pâncreas e das pálpebras humanas e da saúde e doença. Os ilhós humanos são estruturas esféricas 3D, e o acesso às células ao longo de todo o ilhós apresenta alguns desafios experimentais.
Por exemplo, ao tentar introduzir biossensores para entender a sinalização das células dos ilhós, nosso protocolo de pseudopálpebras supera esse desafio realizando manipulações genéticas no estado de célula única e agregando essas células de ilhós humanos transduzidas em pseudopálpebras para estudos a jusante. Nosso sistema de pseudopálpebras nos permite expressar biossensores em todo o ilhó, em vez de apenas na superfície palpebral. Combinado com nossa imagem de células vivas e sistema de microperfusão, podemos medir e co-registrar processos intracelulares dinâmicos com a secreção hormonal a jusante.
Este protocolo poderia ser aplicado para responder a uma variedade de questões científicas importantes. Por exemplo, estratégias de silenciamento gênico poderiam ser combinadas com essa abordagem para entender o impacto de um gene de interesse na função palpebral e vias de sinalização associadas, seja globalmente ou de maneira auto-específica.
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Visão Geral
Este estudo aborda a disfunção das células beta e anormalidades das ilhotas no diabetes, utilizando um sistema modelo de pseudoilhota para aquisição síncrona de sinalização celular e secreção hormonal. O método emprega a entrega adenoviral de um biossensor de cAMP e um sistema de microperifusão para permitir a análise dinâmica das respostas de insulina e glucagon.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Diabetes Tipo 1 e Tipo 2
- Biologia das ilhotas humanas
- Dinâmica de sinalização celular
Fundo
- As ilhotas humanas são estruturas esféricas que apresentam desafios experimentais.
- O protocolo de pseudoilhota resolve esses desafios para uma introdução eficaz do biossensor.
- Entender a sinalização da ilhota é crítico para a pesquisa do diabetes.
Métodos Utilizados
- Entrega adenoviral para expressão do biossensor
- Modelo de pseudoilhota humana primária
- Sistema de microperifusão para medição da secreção hormonal
Principais Resultados
- Co-registro bem-sucedido de sinalização intracelular e liberação de hormônios.
- Permitiu a análise dos efeitos do silenciamento gênico na função da ilhota.
- Monitoramento dinâmico das respostas de secreção em tempo real.
Conclusões
- Este estudo fornece um protocolo robusto para examinar a sinalização hormonal da ilhota.
- Tem implicações significativas para a compreensão da biologia das ilhotas no diabetes.
