Sistema de Pseudoilhotas Humanas para Avaliação Síncrona da Dinâmica de Biossensores Fluorescentes e Perfis Secretores de Hormônios
3 de novembro de 2023
Este protocolo descreve um método para a aquisição sincrônica e o co-registro de eventos de sinalização intracelular e a secreção de insulina e glucagon por pseudoilhotas humanas primárias usando a entrega adenoviral de um biossensor cíclico de adenosina monofosfato (AMPc), um detector de diferença de AMPc in situ (cADDis) e um sistema de microperfusão.
Nosso laboratório está trabalhando para entender, prevenir e reverter a disfunção das células beta e outras anormalidades palpebrais no diabetes tipo um e tipo dois. Nossos estudos se concentram na patogênese do diabetes humano, integrando estudos da biologia do pâncreas e das pálpebras humanas e da saúde e doença. Os ilhós humanos são estruturas esféricas 3D, e o acesso às células ao longo de todo o ilhós apresenta alguns desafios experimentais.
Por exemplo, ao tentar introduzir biossensores para entender a sinalização das células dos ilhós, nosso protocolo de pseudopálpebras supera esse desafio realizando manipulações genéticas no estado de célula única e agregando essas células de ilhós humanos transduzidas em pseudopálpebras para estudos a jusante. Nosso sistema de pseudopálpebras nos permite expressar biossensores em todo o ilhó, em vez de apenas na superfície palpebral. Combinado com nossa imagem de células vivas e sistema de microperfusão, podemos medir e co-registrar processos intracelulares dinâmicos com a secreção hormonal a jusante.
Este protocolo poderia ser aplicado para responder a uma variedade de questões científicas importantes. Por exemplo, estratégias de silenciamento gênico poderiam ser combinadas com essa abordagem para entender o impacto de um gene de interesse na função palpebral e vias de sinalização associadas, seja globalmente ou de maneira auto-específica.
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Visão Geral
Este estudo aborda a disfunção das células beta e as anormalidades das ilhotas na diabetes, utilizando um sistema de modelo de pseudoilhotas para a aquisição sincronizada de sinalização celular e secreção hormonal. O método emprega a entrega adenoviral de um biossensor de cAMP e um sistema de microperfusão para permitir a análise dinâmica das respostas de insulina e glucagon.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Diabetes tipo 1 e tipo 2
- Biologia de ilhotas humanas
- Dinâmica da sinalização celular
Contexto
- Os ilhotas humanos são estruturas esféricas que apresentam desafios experimentais.
- O protocolo de pseudoilhotas resolve esses desafios para a introdução eficaz de biossensores.
- Compreender a sinalização das ilhotas é essencial para a pesquisa sobre diabetes.
Métodos Utilizados
- Entrega adenoviral para expressão do biossensor
- Modelo primário humano de pseudoilhotas
- Sistema de microperfusão para medição da secreção de hormônios
Resultados Principais
- Co-registro bem-sucedido de sinalização intracelular e liberação de hormônios.
- Permitiu a análise dos efeitos do silenciamento gênico na função das ilhotas.
- Monitoramento dinâmico das respostas de secreção em tempo real.
Conclusões
- Este estudo fornece um protocolo robusto para examinar a sinalização hormonal das ilhotas.
- Tem implicações significativas para a compreensão da biologia das ilhotas no diabetes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O sistema de pseudoilhotas humanas permite a avaliação sincronizada e quantitativa da sinalização intracelular e da secreção hormonal em células de ilhotas humanas primárias, abordando um gargalo crítico na validação de alvos para o diabetes. Ao permitir a manipulação genética e a integração de biossensores em toda a estrutura tridimensional da ilhota, esta plataforma aumenta a confiança preditiva em estudos mecanicistas e apoia decisões de portfólio ajustadas ao risco na pesquisa de doenças metabólicas. A integração de microperifusão e imagens de células vivas posiciona-o como uma capacidade reutilizável para descobertas iniciais e pesquisas translacionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao vincular a sinalização intracelular à secreção hormonal em células de ilhotas humanas.
- Facilita a redução de riscos biológicos por meio de silenciamento gênico ou esclarecimento de vias baseado em biossensores em um contexto tridimensional fisiologicamente relevante.
- Oferece suporte à confiança preditiva e à validação funcional de alvos em programas para diabetes e doenças metabólicas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara sistemas de pseudoilhotas validados para triagem de compostos e ensaios mecanicistas subsequentes.
- Padroniza as condições do ensaio para medições reprodutíveis e quantitativas da secreção hormonal e da dinâmica de biossensores.
- Permite a avaliação escalonável e multiplexada de intervenções candidatas em um modelo relevante para humanos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha achados in vitro com a biologia de ilhotas humanas relevantes para doenças, visando o desenvolvimento translacional de biomarcadores.
- Proporciona continuidade do estágio de descoberta até a validação pré-clínica, permitindo a eliminação de riscos mecanicistas em tecido humano primário.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco mediante a integração de leituras funcionais e de sinalização.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este sistema integra a descoberta inicial, a validação de alvos e a pesquisa pré-clínica ao permitir a investigação orientada por hipóteses da sinalização e função das ilhotas em um único fluxo de trabalho.
- Biologia de Descoberta: Apoia testes de hipóteses mecanicistas e esclarecimento de vias por meio de leituras simultâneas de biossensores e hormônios.
- Triagem: Fornece modelos de pseudoilhotas prontos para ensaios e reprodutíveis para avaliação quantitativa de intervenções.
- Análises: Fornece medições dinâmicas e quantitativas da sinalização de cAMP e da secreção hormonal para comparação robusta entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta insights mecanicistas in vitro à biologia da doença humana, apoiando o alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma padronizada e adaptável para uso repetido em diversos programas de descoberta de doenças metabólicas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos para diabetes.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos ensaios funcionais de ilhotas.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de avanço ou interrupção e a eficiência do capital ao integrar dados funcionais e de sinalização.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de ativos para doenças metabólicas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em isolamento de ilhotas humanas, manipulação genética e microscopia de células vivas.
- Exige acesso a microscopia confocal, sistemas de microperfusão e análises quantitativas de hormônios.
- Necessita padronização entre equipes nos protocolos de preparação de pseudoilhotas e ensaios.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes fontes de doadores ou modelos de doenças.
- O rendimento e a escalabilidade são limitados pela disponibilidade de tecido primário e pela complexidade técnica.
