Name: Dissecção e Isolamento de Tecido Pulmonar Descelularizado Regional-Específico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Aprenda a isolar tecido pulmonar descelularizado regional para engenharia de tecidos. Este método permite analisar assinaturas proteômicas distintas da matriz extracelular em pulmões saudáveis e doentes.

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Os autores agradecem aos serviços de autópsia da UVM pela obtenção de pulmão humano e ao doutor Robert Pouliot pelas contribuições às técnicas gerais de dissecção. Esses estudos foram apoiados pelo R01 HL127144-01 (DJW).

Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com a IACUC da Universidade de Vermont (UVM). Todos os pulmões humanos foram adquiridos dos Serviços de Autópsia da UVM e os estudos relacionados foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB da UVM.
NOTA: A decelularização de pulmões de suínos e humanos já foi descrita pelo nosso grupo 7,8,9,10,21. Em resumo, lobos pulmonares inteiros são decelularizados através da perfusão sequencial das vias aéreas e da vasculatura com uma série de soluções enzimáticas e detergente de 2 L usando uma bomba peristáltica: Triton-X 100 a 0,1%, desoxicolato de sódio a 2%, cloreto de sódio 1 M, DNase 30 μg/mL/1,3 mM MgSOCaCl 2 4/2 mM, ácido peracético a 0,1%/etanol a 4%, e uma lavagem com água deionizada. Os métodos padrão para confirmar a descelularização eficiente incluem a determinação de DNA residual de fita dupla de <50 ng/mg dentro de pulmões decelularizados e a ausência de fragmentos de DNA por eletroforese em gel, e a coloração nuclear pela coloração de hematoxilina e eosina (H&E) 9,21.
1. Configuração
<ol><li>Reúna todos os equipamentos necessários para o procedimento de dissecção, incluindo uma caçarola de vidro, dois pares de pinças cirúrgicas, um par de pinças e uma tesoura cirúrgica e autoclave antes do uso.</li>
	<li>Obter uma seção do pulmão, colocá-lo na caçarola de vidro e orientá-lo para que a extremidade superior da via aérea possa ser vista claramente.</li>
	<li>Identificar a extremidade proximal da vasculatura e mantê-la intacta até os passos posteriores. A extremidade da vasculatura deve ser claramente visível e de cor branca totalmente opaca.</li>
	<li>Usando uma pinça e tesoura cirúrgica, remova qualquer pleura que possa estar forrando o exterior do pulmão e descarte.</li>
</ol>2. Exposição da via aérea
<ol><li>Usando uma técnica de espalhamento com a tesoura cirúrgica, trabalhe suavemente para expor a via aérea adicional.<ol><li>Localize a maior via aérea, que normalmente terá um diâmetro de aproximadamente 2-4 cm. Outra forma de identificar uma via aérea é através da observação de anéis cartilaginosos, que podem ser detectados visualmente ou através da palpação do tecido.</li>
		<li>Usando um par de pinças, palpar o comprimento da via aérea para determinar a localização da via aérea invisível a uma profundidade de aproximadamente 1 pol. NOTA: Por ser revestida por anéis de cartilagem, a via aérea é caracteristicamente mais dura que os demais tecidos pulmonares. Como tal, encontrar e palpar a via aérea invisível deve ser relativamente simples.</li>
		<li>Segurando a tesoura cirúrgica paralela à via aérea, insira as pontas fechadas no tecido que envolve diretamente a via aérea invisível.</li>
		<li>Abra lentamente a tesoura cirúrgica para afastar suavemente a membrana circundante. Em seguida, retire a tesoura cirúrgica e evite cortar qualquer tecido.</li>
		<li>Repita esse processo intermitentemente durante todo o procedimento de dissecção para continuar expondo a via aérea.</li>
	</ol></li>
	<li>Com a tesoura cirúrgica, cortar a via aérea nos pontos de ramificação e dissecar ao longo de cada ramo de forma independente. NOTA: Um ponto de ramificação é um local no qual uma via aérea se divide em duas vias aéreas separadas.</li>
	<li>Regiões severas da via aérea, uma vez confiantes de que as extremidades intactas permanecerão identificáveis e facilmente localizadas para posterior dissecção.</li>
	<li>Coloque regiões cortadas da via aérea no tubo correspondente. O tamanho das regiões cortadas varia dependendo da amostra, mas, em geral, varia entre 1 e 5 cm de comprimento. A largura varia de acordo com a localização relativa ao longo da árvore das vias aéreas, com as regiões distais mantendo larguras menores do que as regiões mais proximais.</li>
</ol>3. Expondo e excisando regiões da vasculatura
<ol><li>Aplique uma pressão suave na vasculatura e afaste-se lentamente das vias aéreas. Deixe a vasculatura esticar ligeiramente e use uma tesoura cirúrgica para separar ainda mais a vasculatura da via aérea. NOTA: Muita pressão irá rasgar a vasculatura. Se a vasculatura rasgar, basta colocar essa seção da vasculatura no tubo marcado correspondente e identificar sua extremidade intacta.</li>
	<li>Quando um ponto de ramificação na árvore vascular tiver sido exposto, use tesoura cirúrgica e pinça para expor regiões mais inferiores da vasculatura.<ol><li>Comece inserindo as pontas fechadas da tesoura cirúrgica logo abaixo de um ponto de ramificação e entre as duas regiões vasculares correspondentes.</li>
		<li>Abra lentamente a tesoura para espalhar os tecidos subjacentes.</li>
		<li>De forma intermitente, use uma pinça para remover o tecido que foi espalhado com a tesoura cirúrgica, bem como qualquer outro tecido que envolva diretamente a vasculatura.</li>
	</ol></li>
	<li>Quando a vasculatura estiver cobrindo regiões da via aérea ou se tornando incômoda para qualquer etapa do procedimento de dissecção, corte a vasculatura em um ponto de ramificação e disseque ao longo de cada ramo independentemente.</li>
	<li>Regiões severas da vasculatura uma vez confiantes de que as extremidades intactas permanecerão identificáveis e facilmente localizadas para posterior dissecção.</li>
</ol>4. Identificação e excisão do tecido alveolar
<ol><li>Usando um par de pinças ou pinças, aperte e depois rasgue suavemente pequenas regiões de tecido alveolar.<ol><li>Localizar uma região de tecido que não esteja nas proximidades diretas da via aérea ou da vasculatura.</li>
		<li>Usando a pinça, pinça uma pequena região do tecido que parece ser desprovida de qualquer vasculatura ou via aérea.</li>
		<li>Rasgue a região pinçada do tecido do pulmão.</li>
	</ol></li>
	<li>Observe a região do tecido removido e confirme se é ou não tecido alveolar. OBS: O tecido alveolar está presente em todo o pulmão, por isso pode e deve ser removido durante todo o procedimento de dissecção. Qualquer tecido que não possa ser facilmente identificado como primariamente alvéolos, vasculatura ou via aérea deve ser categorizado como tecido volumoso e colocado no tubo marcado correspondente.</li>
</ol>

Isolamento regional de tecido pulmonar descelularizado para estudar interações célula-célula e célula-ECM

<ol><li>López-Campos, J. L., Tan, W., Soriano, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">Global burden of COPD.</a> Respirology. 21 (1), 14-23 (2016).</li>
<li>Raherison, C., Girodet, P. -O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Review%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of COPD.</a> European Respiratory Review. 18 (114), 213-221 (2009).</li>
<li>Glass, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+pulmonary+fibrosis%3A+Current+and+future+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Idiopathic pulmonary fibrosis: Current and future treatment.</a> The Clinical Respiratory Journal. 16 (2), 84-96 (2022).</li>
<li>Dickinson, K. M., Collaco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics+in+Review%22%5BJournal%5D)">Cystic Fibrosis.</a> Pediatrics in Review. 42 (2), 55-67 (2021).</li>
<li>DeFreitas, M. R., McAdams, H. P., Azfar Ali, H., Iranmanesh, A. M., Chalian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+of+lung+transplantation%3A+update+on+imaging+manifestations+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%3A+Cardiothoracic+Imaging%22%5BJournal%5D)">Complications of lung transplantation: update on imaging manifestations and management.</a> Radiology: Cardiothoracic Imaging. 3 (4), e190252(2021).</li>
<li>Young, K. A., Dilling, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">The future of lung transplantation.</a> Chest. 155 (3), 465-473 (2019).</li>
<li>Wagner, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+decellularization+and+recellularization+of+normal+versus+emphysematous+human+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs.</a> Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).</li>
<li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+normal+and+fibrotic+human+lung+matrices+as+a+culture+system+for+in+vitro+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).</li>
<li>Uhl, F. E., Wagner, D. E., Weiss, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+decellularized+lung+matrices+for+cell+culture+and+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of decellularized lung matrices for cell culture and protein analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1627, 253-283 (2017).</li>
<li>Wagner, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+scaffolds+of+acellular+human+and+porcine+lungs+for+high+throughput+studies+of+lung+disease+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration.</a> Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).</li>
<li>Uhl, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+glycosaminoglycans+in+decellularized+lung+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Functional role of glycosaminoglycans in decellularized lung extracellular matrix.</a> Acta Biomaterialia. 102, 231-246 (2020).</li>
<li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li>
<li>Giobbe, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogel+derived+from+decellularized+tissues+enables+endodermal+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogel derived from decellularized tissues enables endodermal organoid culture.</a> Nature Communications. 10 (1), 5658(2019).</li>
<li>Petrou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clickable+decellularized+extracellular+matrix+as+a+new+tool+for+building+hybrid-hydrogels+to+model+chronic+fibrotic+diseases+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry.+B%22%5BJournal%5D)">Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid-hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro.</a> Journal of Materials Chemistry. B. 8 (31), 6814-6826 (2020).</li>
<li>Nizamoglu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+fibrosis+using+crosslinked+native+extracellular+matrix-derived+hydrogels+to+modulate+biomechanics+without+changing+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of fibrosis using crosslinked native extracellular matrix-derived hydrogels to modulate biomechanics without changing composition.</a> Acta Biomaterialia. 147, 50-62 (2022).</li>
<li>Marhuenda, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+extracellular+matrix+hydrogels+enhance+preservation+of+type+ii+phenotype+in+primary+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lung extracellular matrix hydrogels enhance preservation of type ii phenotype in primary alveolar epithelial cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 4888(2022).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+tissue+extracellular+matrix-derived+hydrogels+protect+against+radiation-induced+lung+injury+by+suppressing+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lung tissue extracellular matrix-derived hydrogels protect against radiation-induced lung injury by suppressing epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Cellular Physiology. 235 (3), 2377-2388 (2020).</li>
<li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+naturally+derived+lung+extracellular+matrix+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).</li>
<li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+lung-derived+extracellular+matrix+hydrogel+properties+are+dependent+on+pepsin+digestion+time%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Porcine lung-derived extracellular matrix hydrogel properties are dependent on pepsin digestion time.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (6), 332-346 (2020).</li>
<li>de Hilster, R. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+extracellular+matrix+hydrogels+resemble+the+stiffness+and+viscoelasticity+of+native+lung+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human lung extracellular matrix hydrogels resemble the stiffness and viscoelasticity of native lung tissue.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (4), L698-L704 (2020).</li>
<li>Hoffman, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+and+disease+specific+human+lung+extracellular+matrix+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Regional and disease specific human lung extracellular matrix composition.</a> Biomaterials. 293, 121960(2023).</li>
<li>Sicard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+anatomical+variations+in+lung+tissue+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging and anatomical variations in lung tissue stiffness.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (6), L946-L955 (2018).</li>
</ol>

Nenhum dos autores tem conflitos de interesse.

Tecidos decelularizados de humanos e de outras espécies são frequentemente utilizados como biomateriais para estudar a composição da MEC, bem como interações célula-MEC em modelos de cultura ex vivo, incluindo hidrogéis 3D12,13. À semelhança de outros órgãos, pulmões descelularizados têm sido previamente utilizados para determinar diferenças na composição da MEC em pulmões saudáveis versus doentes (isto é, enfisematosos e FPI) e estão sendo cada vez mais...

Atualmente, as doenças pulmonares, incluindo a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), a fibrose pulmonar idiopática (FPI) e a fibrose cística (FC), permanecem sem cura 1,2,3,4. O transplante pulmonar é muitas vezes a única opção para pacientes em estágios mais avançados, porém continua sendo uma opção limitada, tanto pelo suprimento de pulmões de doadores adequados quanto pela rejeição aguda e crônica após o transplante 3,5,6. Como tal, há uma necessidade crítica de novas estratégias de tratamento. Uma abordagem promissora em bioengenharia respiratória é a aplicação de arcabouços derivados de tecidos preparados a partir de tecido pulmonar nativo decelularizado. Como os arcabouços pulmonares acelulares retêm grande parte da complexidade da composição e bioatividade da matriz extracelular nativa (MEC), eles têm sido intensamente estudados para engenharia de órgãos inteiros e como modelos aprimorados para o estudo de mecanismos de doenças pulmonares 7,8,9,10. Paralelamente, há um crescente interesse na utilização de tecidos decelularizados de diferentes órgãos, incluindo pulmões, como hidrogéis e outros substratos para o estudo das interações célula-célula e célula-MEC em modelos de cultura de organoides e outros tecidos 11,12,13,14,15,16,17 . Estes fornecem modelos mais relevantes do que substratos comercialmente disponíveis, como o Matrigel, derivado de fontes tumorais. No entanto, as informações sobre hidrogéis derivados do pulmão humano são relativamente limitadas no momento. Descrevemos previamente hidrogéis derivados de pulmões de porcos decelularizados e caracterizamos suas propriedades mecânicas e materiais, bem como demonstramos sua utilidade como modelos de cultura celular18,19. Um relato recente detalhou a caracterização mecânica e viscoelástica inicial de hidrogéis derivados de pulmões humanos normais e doentes (DPOC, FPI)decelularizados 20. Também apresentamos dados iniciais caracterizando o conteúdo de glicosaminoglicanos de pulmões humanos normais e DPOC decelularizados, bem como sua aplicabilidade no estudo das interações célula-célula ecélula-MEC11.
Esses exemplos ilustram o poder da utilização de ECMs de pulmão humano decelularizado para fins investigativos. No entanto, o pulmão é um órgão complexo, e tanto a estrutura quanto a função variam em diferentes regiões do pulmão, incluindo a composição da MEC e outras propriedades, como a rigidez21,22. Dessa forma, é de interesse estudar a MEC em regiões individuais do pulmão, incluindo traqueia e grandes vias aéreas, médias e pequenas vias aéreas e alvéolos, bem como grandes, médios e pequenos vasos sanguíneos. Para isso, desenvolvemos um método confiável e reprodutível para dissecar pulmões humanos e suínos descelularizados e, posteriormente, isolar cada uma dessas regiões anatômicas. Isso permitiu uma análise diferencial detalhada do conteúdo proteico regional em pulmões normais e doentes21.

<table><tbody><tr><td>Bonn Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14184-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Pinça Fina</td><td>Ferramentas de Fine Science</td><td>11254-02</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps, Curvado, S/S, Sem Corte, Serrilhado - 130mm</td> Tesoura Fina Endurecida <td>CellPath</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr>Ferramentas<td>de</td><td>Ciência Fina</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Moria Iris Ferramentas</td><td>de Ciência Fina</td><td>11373-22</td><td></td></tr><tr><td>Caçarola de Vidro Pyrex</td><td>Cole-Parmer</td><td>3175-10</td><td></td></tr></tbody></table>

dissecção e isolamento de tecido pulmonar descelularizado regional-específico

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue

O transplante pulmonar é muitas vezes a única opção para pacientes em estágios mais avançados de doença pulmonar grave, mas isso é limitado tanto devido ao suprimento de pulmões de doadores adequados quanto à rejeição aguda e crônica após o transplante. Determinar novas abordagens de bioengenharia para a substituição de pulmões doentes é imperativo para melhorar a sobrevida dos pacientes e evitar complicações associadas às metodologias atuais de transplante. Uma abordagem alternativa envolve o uso de pulmões inteiros descelularizados sem constituintes celulares que são tipicamente a causa da rejeição aguda e crônica. Como o pulmão é um órgão tão complexo, é de interesse examinar os componentes da matriz extracelular de regiões específicas, incluindo a vasculatura, as vias aéreas e o tecido alveolar. O objetivo dessa abordagem é estabelecer métodos simples e reprodutíveis pelos quais os pesquisadores possam dissecar e isolar tecidos específicos da região de pulmões totalmente decelularizados. O protocolo atual foi desenvolvido para pulmões de suínos e humanos, mas pode ser aplicado a outras espécies também. Para esse protocolo, foram especificadas quatro regiões do tecido: via aérea, vasculatura, alvéolos e tecido pulmonar volumoso. Este procedimento permite a obtenção de amostras de tecido que representam com mais precisão o conteúdo do tecido pulmonar decelularizado, em oposição aos métodos tradicionais de análise em massa.

Um esquema geral do protocolo é mostrado na Figura 1. Uma vez dominada, a dissecção regional do tecido pulmonar decelularizado é facilmente reprodutível. A determinação da categorização de cada amostra de tecido cortado é imprescindível para o sucesso do procedimento de dissecção. O tecido vascular é substancialmente mais elástico do que as vias aéreas, portanto, o uso de pinças para esticar o tecido é frequentemente um forte indicador de se uma determinada amostra é vasculatura ou via aérea...

Apresenta-se um protocolo para o isolamento de tecido pulmonar decelularizado regional. Este protocolo fornece uma ferramenta poderosa para o estudo de complexidades na matriz extracelular e interações célula-matriz.

Dissecção e Isolamento de Tecido Pulmonar Descelularizado Regional-Específico

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...

Órgãos descelularizados estão sendo continuamente usados em uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos. No entanto, a maioria desses estudos considera o órgão como um todo e não as regiões anatômicas individuais. Desenvolvemos este método para analisar regiões anatômicas individuais de pulmões humanos descelularizados para sistemas modelos mais precisos para aplicações a jusante.Ao desenvolver sistemas modelo, é importante considerar diferentes aspectos de projeto para que seu sistema recapitule melhor a biologia normal. Para o pulmão, isso inclui fatores como estresse ambiental, estresse mecânico cíclico e elasticidade, que podem diferir entre regiões independentes do pulmão. Utilizando esse método, pudemos mostrar que a matriz extracelular derivada de regiões anatômicas individuais do pulmão de pulmões sadios e doentes tem assinaturas proteômicas distintas.Isso nos permite entender melhor a doença pulmonar e, potencialmente, criar novos caminhos terapêuticos. Para continuar com esta pesquisa, nosso laboratório está atualmente desenvolvendo hidrogéis tridimensionais a partir de matriz extracelular pulmonar saudável e doente. Estes hidrogéis permitem realizar modelagem organoide in vitro a fim de elucidar o papel das interações da matriz extracelular no comportamento celular correspondente.

dissection-and-isolation-of-region-specific-decellularized-lung-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nós desenvolvemos uma matriz extracelular e de pulmão decelularizado biorreator romance biomimético que pode ser usado para gerar tecido pulmonar funcional. Por semeadura de células na matriz e cultura no biorreator, geramos tecido que demonstra a troca gasosa eficaz quando transplantadas in vivo por curtos períodos de tempo.

Procedimento para a Engenharia de pulmão

A preparação altamente purificada de células dendríticas pulmonares do rato é descrito. Ênfase específica é dada para o isolamento de um subconjunto de células dendríticas convencionais.

Isolamento de células dendríticas pulmonares do rato

Este vídeo demonstra um método de produção de matriz extracelular descelularizada ou andaimes ECM aplicando perfusão anterógrada de detergentes através da vasculatura. Os scaffolds estruturais da ECM podem então ser usados para analisar a remodelação da ECM associada à doença cardiopulmonar.

Descelularização do Complexo Cardiopulmonar: Uma Técnica para Descelularização de Coração e Pulmões a partir de Modelo Murino

A descelularização de órgãos inteiros produz andaimes biológicos naturais que podem ser usados para medicina regenerativa. A descrição de um modelo de regeneração pulmonar de primatas não humanos em que pulmões inteiros são descelularizados e depois semeados com células-tronco adultas e células endoteliais em um biorreator que facilita a circulação vascular e a ventilação em meio líquido é apresentada.

Descelularização e recelularização pulmonar de primatas não humanos usando um biorreator especializado de órgãos grandes

Este protocolo eficiente dirige rato estaminais embrionárias endoderme definitivo de células-derivadas para amadurecer as células epiteliais das vias respiratórias. Esta técnica utiliza a diferenciação 3-dimensionais andaimes pulmonares descelularizados para dirigir especificação das linhagens celulares de pulmão, em, uma configuração de cultura isento de soro definido.

Geração de células de camundongo Airway epiteliais derivados de ESC Usando descelularizado Lung Scaffolds

Aqui, apresentamos um protocolo para um ex vivo pulmão câncer modelo que imita as etapas de progressão do tumor e ajuda a isolar um tumor primário, circulam células tumorais e lesões metastáticas.

Modelo de pulmão acelular e celular para estudar o Tumor metástase

Este protocolo visa descelularizar o coração e os pulmões dos ratos. Os andaimes de matriz extracelular resultante (ECM) podem ser imunossuados e imagens para mapear a localização e topologia de seus componentes.

Descelularização do Complexo Cardiopulmonar Murine

Este protocolo descreve um método para gerar tecidos pulmonares projetíveis, de pequena escala, repovoando fatias pulmonares descelularizadas cortadas com células epiteliais tipo 2 alveolares, fibroblastos e células endoteliais.

Tecidos pulmonares projetados preparados a partir de fatias pulmonares descelularizadas

O protocolo elucida duas metodologias distintas de decelularização aplicadas a tecidos pulmonares bovinos nativos, fornecendo um relato abrangente de suas respectivas caracterizações.

Desenvolvimento e caracterização de hidrogéis de matriz extracelular pulmonar decelularizada

Este artigo descreve como criar pulmões de camundongos de bioengenharia usando métodos de descelularização e recelularização. Ele também detalha o transplante pulmonar ortotópico subsequente.

Transplante de Pulmão de Bioengenharia Usando Pulmões de Camundongos Descelularizados e Células Endoteliais Humanas Primárias

O protocolo descrito abaixo é uma maneira simples e eficaz de isolar células contendo retinóides de populações de células pulmonares altamente heterogêneas, fazendo uso de autofluorescência retinóide específica e empregando classificação de células ativadas por fluorescência.

Isolamento de células contendo retinóides pulmonares por classificação de células

Aprenda a isolar tecido pulmonar descelularizado regional para engenharia de tecidos. Este método permite analisar assinaturas proteômicas distintas da matriz extracelular em pulmões saudáveis e doentes.

Dissecção e Isolamento de Tecido Pulmonar Descelularizado Regional-Específico

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