Name: Retenção molecular universal com microscopia de expansão de 11 vezes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T12:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Aprenda a técnica Magnify de microscopia de expansão para imagem nanométrica de amostras biológicas e clínicas. Este método preserva epítopos proteicos com resolução de 15 nanômetros sem equipamentos especializados.

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Este trabalho foi apoiado pela Carnegie Mellon University e pela D.S.F. Charitable Foundation (Y.Z. e X.R.), pelo National Institutes of Health (N.I.H.) Prêmio Novo Inovador do Diretor DP2 OD025926-01 e Fundação Kauffman.

Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health (NIH) e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Carnegie Mellon. Amostras de tecido humano foram obtidas comercialmente.
1. Preparação dos reagentes e soluções de estoque
NOTA: Consulte a Tabela de materiais para obter uma lista dos reagentes usados.
<ol><li>Prepare as soluções-mãe gelificantes. Estes serão combinados imediatamente antes da etapa de gelificação.<ol><li>Preparar a solução-mãe de monómero (ácido n,n-dimetilacrilamida 4 g/100 mL [DMAA], 50 g/100 ml de acrilato de sódio [AS], 66,7 g/100 ml de acrilamida [AA], 0,10 g/100 mL N,N′-metilenobisacrilamida [Bis], 33 g/100 ml de cloreto de sódio [NaCl], 1x solução salina tamponada com fosfato; PBS) utilizando os componentes listados na Tabela 1. Dissolver ou diluir todas as soluções-mãe em água. A solução-mãe de monómero pode ser armazenada a 4 °C durante, pelo menos, 3 meses.</li>
		<li>Fazer separadamente em água as seguintes soluções-mãe: 0,5% (p/p) 4-Hidroxi-TEMPO (4HT), que inibe a gelificação durante a difusão do monômero nos tecidos, e 10% (p/p) tetrametiletilenodiamina (TEMED), que acelera a geração radical iniciada pelo persulfato de amônio (APS) e é preparada a 10% (p/p). NOTA: As soluções-mãe podem ser distribuídas em alíquotas de 1-2 mL e armazenadas a 4 °C por até 3 meses; no entanto, a SAF é feita imediatamente antes de preparar a solução gelificante.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar o tampão de homogeneização (1% p/v S.D.S., 8 M de ureia, 25 mM de EDTA, 2x PBS, pH 8, à temperatura ambiente [R.T.]) combinando 1 g de SDS, 48,048 g de ureia, 5 mL de EDTA (0,5M, pH 8), 20 mL de 10x PBS, 25 mL de Tris (2 M) e 0,75 g de glicina. Adicionar água para um volume total de 100 mL. A solução pode ser ampliada ou reduzida conforme necessário e pode ser armazenada em R.T.</li>
</ol>2. Preparo tecidual para lâminas de tecidos clínicos arquivados e recém-preparados
NOTA: As etapas de pré-processamento do tecido diferem com base em como os espécimes são preparados.
<ol><li>Para amostras clínicas de FFPE (formaldeído-fixado em parafina), siga as etapas abaixo.<ol><li>Colocar as amostras em uma série sequencial de soluções (pode ser usado um frasco de coloração de lâmina de vidro ou tubo cônico de 50 mL): xileno, etanol 95%, etanol 70% e etanol 50%, seguidos de água duplamente deionizada. Use cada solução duas vezes por pelo menos 3 min de cada vez. Use a pinça para colocar a lâmina no recipiente e adicione 15 mL da respectiva solução (o suficiente para cobrir a amostra). Coloque o tubo cônico tampado horizontalmente em um agitador à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Para amostras coradas e montadas em lâminas permanentes, siga os passos abaixo.<ol><li>Coloque a lâmina brevemente em xileno e remova cuidadosamente as lamínulas usando uma ferramenta apropriada, como uma lâmina de barbear. Se a lamínula permanecer presa, devolva as lâminas em xileno à temperatura ambiente até que a lamínula se solte.</li>
		<li>Em seguida, processe as amostras como amostras FFPE (passo 2.1.1). NOTA: Para lâminas coradas com hematoxilina e eosina (H&E), a coloração de hematoxilina e eosina é perdida durante o processo de expansão.</li>
	</ol></li>
	<li>Para lâminas de tecido congelado não fixadas em solução de temperatura de corte ótima (OCT), fixe os tecidos em acetona a -20 °C por 10 minutos antes de lavar as amostras com 1x solução de PBS três vezes por 10 min cada vez à temperatura ambiente.</li>
	<li>Para lâminas de tecido clínico congelado previamente fixadas, derreter o OCT incubando as lâminas por 2 min à temperatura ambiente e, em seguida, lavar com solução de PBS 1x três vezes por 5 min cada vez à temperatura ambiente.</li>
</ol>3. Preparação tecidual para cérebro de camundongo fixado com paraformaldeído
<ol><li>Siga este protocolo para seções cerebrais de camundongos com 30-50 μm de espessura. NOTA: O sucesso pode ser encontrado com seções maiores, mas tempos mais longos podem ser necessários para a difusão e homogeneização da solução de monômero.</li>
	<li>Se as seções não estiverem atualmente armazenadas em uma solução de PBS 1x (por exemplo, em uma solução de glicerol [v/v] a 30% e etilenoglicol a 30% [v/v] em 1x PBS), lave três vezes por pelo menos 10 min cada vez à temperatura ambiente em 1x PBS em uma placa de 6 a 24 poços.</li>
	<li>Obter uma lâmina de microscopia de vidro não revestida. Se um lado da lâmina de vidro for revestido, use um pincel molhado para verificar o lado não revestido (muitas vezes, a etiqueta do lado revestido será feita de vidro moído e se tornará menos opaca quando molhada).</li>
	<li>Use um pincel para molhar a lâmina sem revestimento. Remova o tecido cerebral do rato da placa do poço com o pincel e coloque-o cuidadosamente sobre a lâmina, usando um movimento de rolamento para garantir que o tecido esteja plano. Deixe o excesso de PBS permanecer no tecido até que todos os cortes sejam montados. NOTA: Embora uma única lâmina de vidro possa ser usada para várias seções de tecido, quando mais seções de tecido são gelificadas ao mesmo tempo (mesmo em lâminas separadas), mais cuidado deve ser tomado para garantir que elas não sequem completamente.</li>
	<li>Usando um pano de papel de laboratório, remova a maior parte do excesso de PBS da lâmina. Deixe um pequeno anel líquido ao redor de cada seção de tecido, mas deixe o resto da lâmina praticamente seca. Este líquido restante cobrirá o tecido enquanto a solução de monômero de gel estiver sendo preparada.</li>
</ol>4. Geleixização
NOTA: Este protocolo é adequado para todos os tipos de tecidos preparados para uso com esta técnica.
<ol><li>Aplicar espaçadores em cada lado do corte de tecido (Figura 2A) para evitar a compressão do tecido. Para fazer isso, faça os espaçadores cortando finamente pedaços de vidro de cobertura usando uma caneta com ponta de diamante e, em seguida, fixe-os na lâmina usando pequenas quantidades de água ou 1x PBS, ou fixe-os usando uma pequena quantidade de super cola. Em seguida, coloque delicadamente os espaçadores em cada lado do tecido.</li>
	<li>Prepare a solução gelificante final. Geralmente, ~200 μL é suficiente por corte de tecido, mas o volume não deve exceder 800 μL por lâmina. Qualquer solução gelificante mais resultará em transbordamento. NOTA: A metacroleína é usada para ancorar biomoléculas no gel. No entanto, nenhuma etapa de ancoragem separada é necessária, e a metacroleína pode ser adicionada diretamente à solução gelificante final.<ol><li>Por secção, combinar o seguinte por ordem: 200 μL de solução monomérica, 0,5 μL de solução-mãe 4HT a 0,5% (diluição 1:400), 0,2-0,5 μL de metacroleína (diluição 1:400-1:1.000, dependendo do tipo de tecido; geralmente, utilizar uma diluição 1:1.000 para amostras fixadas em paraformaldeído [PFA] e 1:400 para amostras clínicas FFPE), 2 μL de solução-mãe TEMED a 10% (diluição 1:100), e 5 μL de solução-estoque de A.P.S. a 10% (diluição de 1:40). NOTA: Preparar a solução gelificante final imediatamente antes da utilização. Para evitar a gelificação prematura, adicione a solução de APS por último.</li>
	</ol></li>
	<li>Retire o excesso de solução da seção de tecido e coloque a lâmina em uma placa de Petri. Adicionar à amostra toda a solução gelificante fresca e preparada recentemente e incubar a mistura no tecido durante 30 minutos a 4 °C para permitir a difusão para o tecido.</li>
	<li>Coloque uma segunda lâmina de vidro não revestida cuidadosamente sobre o tecido e a solução de gel. Bolhas de ar devem ser evitadas (Figura 2B). NOTA: Se as bolhas de ar ficarem presas sobre o tecido, a tampa de vidro pode ser cuidadosamente levantada e colocada de volta para baixo. Além disso, qualquer solução de monômero que vaze pode ser cortada após a polimerização e não causará problemas para o tecido.</li>
	<li>Certifique-se de que a polimerização seja concluída. Essa polimerização pode ser feita de duas formas, cada uma produzindo resultados semelhantes. Primeiro, incube as amostras a 37 °C em um ambiente umidificado (como uma placa de Petri fechada com uma toalha de papel úmida) durante a noite. Alternativamente, para uma polimerização mais rápida, incubar as amostras na atmosfera umidificada por 2 h a 37 °C seguido de 1 h a 60 °C.</li>
</ol>5. Digestão da amostra e expansão do tecido
NOTA: Este protocolo é adequado para todos os tipos de tecido.
<ol><li>Usando proteção ocular, deslize uma lâmina de barbear entre as duas lâminas de vidro da câmara gelificante para separá-las. NOTA: As lâminas de vidro devem separar-se muito facilmente. Se diferentes partes do gel estiverem presas a ambas as lâminas, um pincel pode ser usado para guiar o gel para uma ou outra. Se o gel se tornou particularmente seco durante a polimerização, 1x PBS pode ser aplicado na parte externa da câmara de gel, mas não submerja o gel completamente, pois isso fará com que ele se expanda antes que o tecido seja homogeneizado, o que resultará em rachaduras.</li>
	<li>Corte o gel em branco ao redor do tecido para minimizar o volume. O corte assimétrico do gel permite o rastreamento da orientação do gel após a homogeneização, pois a amostra ficará completamente transparente.</li>
	<li>Levante suavemente o gel que contém tecido da lâmina com uma lâmina de barbear e transfira-o suavemente para um tubo de centrífuga de 2 mL com um pincel.</li>
	<li>Encher o tubo até ao topo com tampão de homogeneização (Tabela 2) pré-aquecido a 80 °C.</li>
	<li>Incubar a amostra com agitação a 80 °C durante 8 h (para cérebro de ratinho fixado em PFA) ou 60 h (a maioria das amostras clínicas FFPE; ver Tabela 3). OBS: O tempo de homogeneização é dependente do tipo de tecido e do método de fixação. Muitas dessas condições já foram validadas, mas para outras, a otimização pode ser necessária.</li>
	<li>Despeje o conteúdo do tubo de centrífuga em um único poço de uma placa de cultura de células plásticas de 6 poços.</li>
	<li>Remova o tampão de desnaturação com um pipet de transferência.</li>
	<li>Para remover completamente o SDS restante do hidrogel, lavar a amostra numa solução de tensoactivo não iónico a 1% (C12E 10) da seguinte forma: pelo menos três vezes durante10 minutos de cada vez à temperatura ambiente; por 60 min a 60 °C; e, em seguida, mais três lavagens por 10 min cada vez em temperatura ambiente.</li>
	<li>Armazenar a amostra em 1x PBS + azida sódica a 0,02% a 4 °C até que a coloração pós-expansão e as imagens precisem ser realizadas. NOTA: Neste ponto, a amostra deve ser ~3-4,5 vezes maior em cada dimensão, dependendo do tipo de tecido.</li>
</ol>6. Perfil de biomoléculas pós-expansão
<ol><li>Coloração de anticorpos NOTA: Isso segue um protocolo típico de coloração de imunofluorescência (IF)/imunohistoquímica (I.H.C.). As quantidades de anticorpos primários e secundários utilizados dependem das concentrações sugeridas pelo fabricante ou pela otimização para o experimento específico. Buffers individuais podem ser substituídos a critério do usuário.<ol><li>Com a amostra em um único poço de uma placa de cultura celular de 6 poços, lave as amostras expandidas três vezes por 10 min cada vez em 1x PBS em T.R., transferindo o líquido com uma pipeta.</li>
		<li>Executar uma etapa de bloqueio opcional (por exemplo, albumina de soro bovino a 3%/Triton-X100 a 0,1% em 1x PBS) por pelo menos 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.</li>
		<li>Incubar com os anticorpos primários em tampão de coloração (por exemplo, 0,1% Triton-X100 1x PBS ou 9x PBS/1% TritonX/10 mg/L heparina) durante a noite a 37 °C. Dependendo do tamanho da amostra, 0,5-2 mL deve cobrir adequadamente o gel.</li>
		<li>Lavar a amostra três vezes durante, pelo menos, 10 minutos de cada vez em 1x PBS à temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar nos anticorpos secundários correspondentes durante 3 h a 37 °C no tampão de coloração de escolha.</li>
		<li>Lavar a amostra três vezes durante, pelo menos, 10 minutos de cada vez em 1x PBS à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração pan-proteína do NHS-éster<ol><li>Com a amostra em uma placa de 6 poços, despeje 1-2 mL de polietilenoglicol (PEG 200) sobre a amostra (o suficiente para cobri-la completamente). NOTA: O tecido deve encolher e retornar ao seu tamanho original pré-expansão (ou próximo a ele).</li>
		<li>Coloração com éster-NHS conjugado com fluoróforo diluído a 13,3-80 μg/mL por 3 h em T.R. em 1-2 mL de tampão de coloração (por exemplo, 1x PBS, 2x S.S.C. ou solução de bicarbonato de sódio 100 mM).</li>
		<li>Lavar a amostra três vezes durante, pelo menos, 10 minutos de cada vez em 1x PBS à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração lipídica NOTA: A coloração lipídica pós-expansão não é eficaz em amostras clínicas FFPE, pois os lipídios são perdidos durante o processo de fixação.<ol><li>Lavar a amostra três vezes durante, pelo menos, 10 minutos de cada vez em 1x PBS à temperatura ambiente.</li>
		<li>Aplicar um corante lipofílico convencional (DiO, DiI ou DiD) diluído 200 vezes em 2 mL de TritonX-100/1x PBS a 0,1% por 72-96 h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave pelo menos três vezes com 1x PBS</li>
	</ol></li>
	<li>Hibridação in situ fluorescente (FISH)<ol><li>Colocar amostras de gel homogeneizado em tampão de hibridização pré-aquecido a 60 °C durante 30 min.</li>
		<li>Preparar o tampão de hibridização para FISH: Combinar 2x S.S.C. (NaCl 300 mM, citrato de sódio 30 mM, pH 7,0), sulfato de dextran a 10% (v/v), carbonato de etileno a 20% (v/v) e Tween a 0,1% (v/v)20.</li>
		<li>Incubar as amostras de gel com um tampão de hibridização contendo 10 pM (por oligo) de sondas FISH contra o gene alvo (pelo menos 20 sondas por 10 kb) a 45 °C durante a noite.</li>
		<li>Lavar com tampão de lavagem de rigor (2x S.S.C. e 0,1% Tween20) duas vezes por 15 min cada vez a 45 °C.</li>
		<li>Lavar com tampão de lavagem de rigor mais duas vezes durante 10 minutos de cada vez a 37 °C.</li>
		<li>Finalmente, lave com 1x PBS pelo menos três vezes por 10 min cada vez à temperatura ambiente.</li>
		<li>As amostras estão prontas para aquisição de imagens ou armazenamento em 1x PBS + azida sódica a 0,02% a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Expansão tecidual completa e imagem de fluorescência NOTA: O fator de expansão atingível com o Magnify varia de acordo com o tipo de tecido e o método de expansão (um resumo completo pode ser encontrado na Tabela 3). No entanto, como uma estimativa geral, uma amostra de ampliação se expandirá 3-4,5 vezes em 1x PBS, 5-7 vezes em PBS diluído para 1:50 em ddH 2 O e8-11 vezes em ddH2O. O fator de expansão ideal para aquisição de imagens depende das necessidades de cada experimento. O fator de expansão é altamente ajustável, de modo que uma única amostra pode ser expandida e encolhida muitas vezes para obtenção de imagens em várias escalas.<ol><li>Mova as amostras expandidas 4 vezes em PBS para uma placa de imagem de 6 poços com fundo de vidro usando um pincel. Mova ainda mais qualquer amostra expandida cortando-a em pedaços menores ou colocando-a suavemente em uma grande placa de imagem com fundo de vidro com um pedaço fino de plástico flexível.</li>
		<li>Realize imagens de fluorescência usando um microscópio convencional de campo largo, um microscópio confocal ou outro sistema de imagem de sua escolha. Remover o excesso de líquido ao redor do gel com um pano de laboratório de papel pode impedir o movimento do gel durante a imagem. Os géis também podem ser imobilizados pela aplicação de poli-L-lisina a 0,1% na superfície do vidro antes da obtenção de imagens. NOTA: A aplicação de poli-L-lisina tornará o gel totalmente imóvel após o contato. Por esta razão, deve-se tomar cuidado para que o gel seja aplicado no vidro sem dobrar ou esticar. Além disso, o gel não deve secar completamente em vidro revestido com poli-L-lisina, pois isso pode dificultar a remoção, e o gel não deve ser encolhido em PBS enquanto ainda estiver preso ao vidro com poli-L-lisina, pois isso pode causar danos ao gel ou tecido.</li>
		<li>Após a obtenção de imagens, encolher as amostras em PBS 1x com pelo menos três lavagens por 10 min de cada vez, pois não é recomendado armazenar as amostras a longo prazo em ddH2O devido à degradação do sinal de fluorescência. Em particular, amostras totalmente expandidas coradas com corantes lipofílicos devem ser fotografadas o mais próximo possível do tempo de expansão para evitar a dissociação do corante na água.</li>
		<li>Conservar as amostras em 1x PBS + 0,02% de azida sódica a 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>

Microscopia de expansão para expansão robusta de 11 vezes

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</ol>

Os autores declaram o(s) seguinte(s) interesse(s) financeiro(s) concorrente(s): Y.Z., A.K., Z.C. e B.R.G. inventaram várias invenções relacionadas à Magnify e ExM.

Aqui, apresentamos o protocolo Magnify 17, uma variante de ExM que pode reter múltiplas biomoléculas com uma única ancoragem química e expandir espécimes clínicos FFPE desafiadores até11 vezes com desnaturação térmica. As principais mudanças neste protocolo que o distinguem de outros protocolos ExM incluem o uso de um gel reformulado que permanece mecanicamente robusto mesmo quando totalmente expandido, bem como o uso de metacroleína como âncora da biomolécula. As etapas mais críticas desse protoc...

Os sistemas biológicos exibem heterogeneidade estrutural, desde os membros e órgãos até os níveis de proteínas na nanoescala. Portanto, uma compreensão completa do funcionamento desses sistemas requer um exame visual através dessas escalas de tamanho. No entanto, o limite de difração da luz causa desafios na visualização de estruturas menores que ~200-300 nm em um microscópio de fluorescência convencional. Além disso, os métodos ópticos de super-resolução 1,2,3, como a depleção de emissão estimulada (STED), a microscopia de localização fotoativada (PALM), a microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) e a microscopia de iluminação estruturada (SIM), embora poderosos, apresentam seus próprios desafios, pois requerem hardware e reagentes caros e, muitas vezes, têm tempos de aquisição lentos e baixa capacidade de obter imagens de grandes volumes em 3D.
A microscopia de expansão4 (ExM) fornece um meio alternativo de contornar o limite de difração da luz ancorando covalentemente biomoléculas em um gel de polímero intumescível em água e separando-as fisicamente, tornando-as resolúveis em microscópios ópticos convencionais. Uma infinidade de variantes do protocolo ExM foi desenvolvida desde a publicação original do ExM há menos de uma década, e esses protocolos permitem a incorporação direta de proteínas 5,6,7, RNA 8,9,10 ou lipídios11,12,13 na rede de gel, alterando a âncora química ou expandindo ainda mais a amostra (melhorando assim a resolução efetiva) em um único passo14 ou em vários passos iterativos15,16. Até recentemente, nenhum protocolo ExM poderia reter essas três classes de biomoléculas com uma única âncora química comercialmente disponível, fornecendo um gel mecanicamente resistente que poderia se expandir ~10 vezes em uma única rodada de expansão.
Aqui, apresentamos a Magnify17, uma adição recente ao arsenal ExM que usa metacroleína como âncora de biomolécula. A metacroleína forma ligações covalentes com tecidos como o do paraformaldeído, garantindo que várias classes de biomoléculas possam ser retidas dentro da rede de gel sem a necessidade de vários agentes de ancoragem específicos ou personalizados. Além disso, essa técnica pode expandir um amplo espectro de tecidos em até 11 vezes, incluindo amostras notoriamente desafiadoras, como amostras clínicas fixadas em formalina e emblocadas em parafina (FFPE). Métodos anteriores para expandir tais amostras mecanicamente rígidas exigiam digestão severa de proteases, tornando impossível a marcação de anticorpos de proteínas de interesse após a amostra ter sido expandida. Em contraste, esta técnica consegue a expansão de amostras clínicas FFPE usando uma solução desnaturante a quente, preservando assim epítopos de proteína inteira dentro do gel, que podem ser alvo de imagem pós-expansão (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>4-hidroxi-TEMPO (4HT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>176141 Inhibitor</td></tr><tr><td>Placa de fundo de vidro de 6 poços (#1.5 coverglass)</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8887</td><td>Componente de monômero de gel</td></tr><tr><td>Persulfato de amônio (APS)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>Iniciador</td></tr><tr><td>DAPI (1 mg/mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Decaeetilenoglicol mono éter dodecílico (C12E10)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9769</td><td>Surfactante não iônico</td></tr><tr><td>Faca de diamante nº 88 CM</td><td>Ferramentas Gerais</td><td>31116</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco</td><td></td><td></td>111000200</tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,5 M</td><td>VWR</td><td>BDH7830-1</td><td>Componente tampão de homogeneização</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>Aldrich G8898</td><td>Componente tampão de homogeneização</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Metacroleína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>133035</td><td>Agente de ancoragem</td></tr><tr><td>Micro vidro de cobertura #1 (24x60mm)</td><td>VWR</td><td>48393 106</td><td></td></tr><tr><td>Micro vidro de cobertura #1.5 (24x60mm)</td><td>VWR</td><td>48393 251</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;- Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td>Acelerador</td></tr><tr><td>N,N&prime;-Metilenobisacrilamida (Bis)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7279</td><td>Componente de monômero de gel</td></tr><tr><td>N,N-dimetilacrilamida (DMAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>274135</td><td>Componente de monômero</td></tr><tr><td>em gel Nunclon 4-Well x 5 mL Placa de Cultura de Células MultiDish</td><td>Thermo Fisher</td><td>167063</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon 6-Well Placa de Cultura de Células</td><td>Thermo Fisher</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; 15mL&nbsp; Garrafa térmica cônica</td><td></td><td>Fisher 339651</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; 50mL&nbsp; Pincel</td><td></td><td></td> de pintura Orbital Shaker <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>339653 Thermo</tr> Fisher cônico <tr><td>Medidor</td><td></td><td></td><td></td>de pH</tr><tr><td>Tampolado com fosfato salino (PBS), solução 10x</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP399-1</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol&nbsp; 200</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3015</td><td></td></tr><tr><td></td> Proteinase K (<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Grau de Biologia Molecular)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>Fischer Scientifc</td><td>12640</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga Safelock 1,5 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3457</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga Safelock 2,0 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3459</td><td></td></tr><tr><td>Acrilato de sódio (SA)</td> <td>AK Scientific</td><td>R624</td><td>Componente de monômero</td></tr> <tr>de gel<td>Azida de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio tribásico di-hidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>Tampão de homogeneização Componente</td></tr><tr><td>Tris Base Fischer</td><td>Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Tampão de homogeneização Componente</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td>Componente Tampão de Homogeneização</td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lisina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr></tbody></table>

retenção molecular universal com microscopia de expansão de 11 vezes

Universal Molecular Retention with 11-Fold Expansion Microscopy

A obtenção de imagens em nanoescala de espécimes biológicos pode melhorar a compreensão da patogênese de doenças. Nos últimos anos, a microscopia de expansão (ExM) tem se mostrado uma alternativa eficaz e de baixo custo à microscopia óptica de super-resolução. No entanto, tem sido limitada pela necessidade de agentes de ancoragem específicos e muitas vezes personalizados para reter diferentes classes de biomoléculas dentro do gel e por dificuldades com a expansão de formatos de amostras clínicas padrão, como tecido fixado em formalina e embebido em parafina, especialmente se fatores de expansão maiores ou epítopos proteicos preservados forem desejados. Aqui, descrevemos o Magnify, um novo método ExM para expansão robusta de até 11 vezes em uma ampla gama de tipos de tecido. Ao usar a metacroleína como âncora química entre o tecido e o gel, o Magnify retém múltiplas biomoléculas, como proteínas, lipídios e ácidos nucléicos, dentro do gel, permitindo assim a obtenção de imagens em larga escala nanoescala dos tecidos em microscópios ópticos convencionais. Este protocolo descreve as melhores práticas para garantir uma expansão de tecido robusta e livre de rachaduras, bem como dicas para manuseio e geração de imagens de géis altamente expandidos.

Se o protocolo tiver sido concluído com sucesso (Figura 1), a amostra aparecerá clara e plana após a desnaturação por calor; qualquer dobramento ou enrugamento indica homogeneização incompleta. Uma amostra expandida com sucesso será 3-4,5 vezes maior do que antes da expansão em 1x PBS e 8-11 vezes maior quando totalmente expandida em ddH2O. A Figura 3 mostra imagens de exemplo pré e pós-expansão de amostra de rim humano FFPE de 5 μm de espessura proce...

Apresentamos aqui uma nova versão da microscopia de expansão (ExM), Magnify, que é modificada para expansão de até 11 vezes, conservando uma ampla gama de classes de biomoléculas, e é compatível com uma ampla gama de tipos de tecidos. Ele permite a interrogação da configuração em nanoescala de biomoléculas usando microscópios convencionais limitados por difração.

Retenção molecular universal com microscopia de expansão de 11 vezes

The nanoscale imaging of biological specimens can improve the understanding of disease pathogenesis. In recent years, expansion microscopy (ExM) has been ...

Estamos tentando encontrar maneiras fáceis e de baixo custo para os pesquisadores obterem imagens de seus espécimes biológicos em resoluções abaixo do limite de difração, particularmente nas áreas de neurociência e patologia clínica. Muitos desenvolvimentos recentes da microscopia de expansão envolvem a modificação da química do gel para expandir ainda mais as amostras, alterando a molécula de ancoragem para visualizar diferentes alvos e utilizando a alteração de aquecimento para preservar epítopos de proteínas. Com ampliação inovadora, um método robusto de microscopia de expansão que permite imagens em nanoescala de vários espécimes biológicos ou clínicos.Ele simplifica a microscopia de super resolução, eliminando as necessidades de equipamentos especializados, preservando recursos biológicos intrincados com resolução de até 15 nanômetros, aumentando assim a acessibilidade e a utilidade em laboratórios em todo o mundo. Anteriormente, os usuários tinham que experimentar diferentes técnicas de microscopia de expansão, dependendo do tecido e das biomoléculas que queriam imaginar. A ampliação permite imagens de alta resolução em várias biomoléculas e tipos de tecidos sem a necessidade de etapas específicas de ancoragem ou equipamentos especializados, preenchendo assim uma lacuna significativa em imagens em nanoescala.O Magnify expande amostras clínicas mais resistentes em quatro vezes, preservando epítopos de proteínas, permitindo uma investigação mais precisa da doença em fila. Sua âncora química também preserva uma ampla gama de biomoléculas, tornando-a útil para pesquisa básica em modelos animais O Magnify simplifica a obtenção de imagens em nanoescala de biomoléculas e espécimes intactos sem óptica complexa ou equipamentos especializados. É adaptável em várias modalidades de imagem e estratégias de microscopia de expansão, permitindo imagens em nanoescala acessíveis e econômicas que podem acelerar tratamentos de drogas e estudos de doenças, ao mesmo tempo em que potencialmente transformam a geração de atlas de tecido.A Magnify oferece infinitas possibilidades de pesquisa. As áreas de foco atuais incluem a expansão do local do tecido, a investigação de amostras humanas patológicas na nanoescala e o estudo das mudanças de menor escala no cérebro durante o aprendizado e a doença.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A imagem latente de nanoscale de amostras clínicas do tecido pode melhorar a compreensão da patogénese da doença. A patologia de expansão (ExPath) é uma versão da microscopia de expansão (ExM), modificada para compatibilidade com amostras de tecido clínico padrão, para explorar a configuração de nanoescala de biomoléculas usando microscópios limitados de difração convencional.

Imagem nanoscópica de seções do tecido humano através da expansão física e isotropic

O método apresentado permite a visualização de proteínas celulares fluorescentes com microscopia de expansão levando a uma resolução de 70 nm em um microscópio convencional.

Imagem de Proteínas Podocíticas Nephrin, Actin e Podocina com Microscopia de Expansão

Um protocolo de microscopia de expansão de retenção de rótulo (LR-ExM) é demonstrado. O LR-ExM usa um novo conjunto de âncoras trifuncionais, o que proporciona melhor eficiência de rotulagem em comparação com as microscopias de expansão introduzidas anteriormente.

A microscopia de expansão de retenção de etiquetas (LR-ExM) permite imagens de super-resolução e rotulagem de alta eficiência

Aqui, um protocolo para a implementação de microscopia de expansão em embriões iniciais de Drosophila para obtenção de imagens de super-resolução usando um microscópio confocal convencional de varredura a laser é apresentado.

Usando microscopia de expansão para ampliar fisicamente embriões de Drosophila de montagem inteira para imagens de super-resolução

Este estudo apresenta um protocolo detalhado para a realização de microscopia de expansão ultraestrutural em três estágios do ciclo de vida in vitro do Trypanosoma cruzi, o patógeno responsável pela doença de Chagas. Incluímos a técnica otimizada para proteínas do citoesqueleto e marcação de pan-proteoma.

Microscopia de Expansão Ultraestrutural em Três Estágios do Ciclo de Vida In Vitro do Trypanosoma cruzi

Aqui, propomos um protocolo simples que combina engenharia de oligossacarídeos metabólicos, química de clique e microscopia de expansão que permite a bioimagem de N-glicoproteínas sialiladas intracelulares com resolução aprimorada usando equipamentos de microscopia de rotina.

Visualização da Sialilação Intracelular com Química Click e Microscopia de Expansão

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que combina métodos de criofixação e microscopia de expansão (Cryo-ExM), permitindo imagens de alta resolução com preservação estrutural adaptada a várias amostras biológicas. Amostras biológicas são congeladas, incorporadas em um polímero inchável, desnaturadas, expandidas e imunomarcadas, permitindo imagens de superresolução com microscópios ópticos padrão.

Microscopia de Expansão: Imagem Fluorescente de Alta Resolução com Microscópio Convencional

Neste vídeo, demonstramos como rotular e visualizar exocitose das vesículas sinápticas única e tráfico de células da retina goldfish bipolar usando reflexão interna total de fluorescência microscopia (TIRF).

Exocitose imagem em células da retina com Bipolar Microscopia TIRF

Aqui demonstramos os protocolos para a realização de uma única molécula de microscopia de fluorescência em células vivas de bactérias para habilitar funcionais complexos moleculares a serem detectados, rastreados e quantificados.

Visualizando Único complexos moleculares In Vivo Usando microscopia de fluorescência avançada

Este protocolo demonstra uma simples molécula única técnica de microscopia de fluorescência para a visualização de replicação do DNA por replisomes individuais em tempo real.

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

Aprenda a técnica Magnify de microscopia de expansão para imagem nanométrica de amostras biológicas e clínicas. Este método preserva epítopos proteicos com resolução de 15 nanômetros sem equipamentos especializados.

Retenção molecular universal com microscopia de expansão de 11 vezes

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