Name: Projeto e Construção de um Microscópio de Fluorescência de Lâmina de Luz Personalizável, de Objetiva Única para a Visualização de Redes de Citoesqueleto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda a construir um microscópio de fluorescência de lâmina de luz de objetiva única para visualizar redes de citoesqueleto em amostras tridimensionais densas. Este método minimiza o foto-branqueamento e permite imagens de alta qualidade em profundidade.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Science Foundation (NSF) RUI Award (DMR-2203791) para J.S. Somos gratos pela orientação fornecida pelo Dr. Bin Yang e pelo Dr. Manish Kumar durante o processo de alinhamento. Agradecemos à Dra. Jenny Ross e K. Alice Lindsay pelas instruções de preparação para os motores de cinesina.

Microscópio de fluorescência personalizável para visualizar redes de citoesqueleto

<ol><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light-sheet+microscopy+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Optics%22%5BJournal%5D)">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal Optics. 20 (5), 053002(2018).</li>
<li>You, R., McGorty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+illuminating+soft+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy illuminating soft matter.</a> Frontiers in Physics. 9, 760834(2021).</li>
<li>Fuchs, E., Jaffe, J. S., Long, R. A., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+laser+light+sheet+microscope+for+microbial+oceanography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Thin laser light sheet microscope for microbial oceanography.</a> Optics Express. 10 (2), 145-154 (2002).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Dunsby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+sectioned+imaging+by+oblique+plane+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy.</a> Optics Express. 16 (25), 20306-20316 (2008).</li>
<li>Bouchard, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+confocally-aligned+planar+excitation+%28SCAPE%29+microscopy+for+high-speed+volumetric+imaging+of+behaving+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li>
<li>Smith, C. W., Botcherby, E. J., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+oblique-plane+images+in+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Resolution of oblique-plane images in sectioning microscopy.</a> Optics Express. 19 (3), 2662-2669 (2011).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epi-illumination+SPIM+for+volumetric+imaging+with+high+spatial-temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution.</a> Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+multiview+capture+and+fusion+improves+spatial+resolution+in+wide-field+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Simultaneous multiview capture and fusion improves spatial resolution in wide-field and light-sheet microscopy.</a> Optica. 3 (8), 897-910 (2016).</li>
<li>Sahasrabudhe, A., Vittal, V., Ghose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peeping+in+on+the+cytoskeleton%3A+Light+microscopy+approaches+to+actin+and+microtubule+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Science%22%5BJournal%5D)">Peeping in on the cytoskeleton: Light microscopy approaches to actin and microtubule organization.</a> Current Science. 105 (11), 1562-1570 (2013).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., Nasenbeny, J., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+one-+and+two-photon+scanned+oblique+plane+illumination+%28SOPi%29+microscopy+for+rapid+volumetric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Integrated one- and two-photon scanned oblique plane illumination (SOPi) microscopy for rapid volumetric imaging.</a> Optics Express. 26 (10), 13027-13041 (2018).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nature Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Sapoznik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+oblique+plane+microscope+for+large-scale+and+high-resolution+imaging+of+subcellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics.</a> eLife. 9, e57681(2020).</li>
<li>Bernardello, M., Marsal, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+in+vivo+study+of+microtubule+dynamics+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for the in vivo study of microtubule dynamics in the zebrafish embryo.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6237-6254 (2021).</li>
<li>Shelden, E. A., Colburn, Z. T., Jones, J. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+super+resolution+on+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Focusing super resolution on the cytoskeleton.</a> F1000Res. 5, F1000 Faculty Rev-998 (2016).</li>
<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology-dependent+anomalous+dynamics+of+ring+and+linear+DNA+are+sensitive+to+cytoskeleton+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking.</a> Science Advances. 5 (12), (2019).</li>
<li>Sheung, J. Y., Garamella, J., Kahl, S. K., Lee, B. Y., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+advection+competes+with+crowding+to+drive+spatiotemporally+heterogeneous+transport+in+cytoskeleton+composites%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Motor-driven advection competes with crowding to drive spatiotemporally heterogeneous transport in cytoskeleton composites.</a> Frontiers in Physics. 10, 1055441(2022).</li>
<li>Zeiss Lightsheet 7. Light-Sheet Multiview Imaging of Living and Cleared Specimens. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Zeiss Lattice Lightsheet 7. Long-Term Volumetric Imaging of Living Cells. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossbill%3A+An+open+access+single+objective+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Crossbill: An open access single objective light-sheet microscopy platform.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+microscopy%3A+A+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Optics+and+Photonics%22%5BJournal%5D)">Light-sheet microscopy: A tutorial.</a> Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).</li>
<li>Pitrone, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSPIM%3A+An+open-access+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">OpenSPIM: An open-access light-sheet microscopy platform.</a> Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).</li>
<li>Sheung Lab, Single Objective Light Sheet Microscope (SOLS) Guide. Sheung Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols">https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols</a> (2023).</li>
<li>Lamb, J. R., Ward, E. N., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+software+package+for+on-the-fly+deskewing+and+live+viewing+of+volumetric+lightsheet+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Open-source software package for on-the-fly deskewing and live viewing of volumetric lightsheet microscopy data.</a> Biomedical Optics Express. 14 (2), 834-845 (2023).</li>
<li>Harvard University. Mitchison Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mitchison.hms.harvard.edu/home">https://mitchison.hms.harvard.edu/home</a> (2023).</li>
<li>Research at Dogic Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/">http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/</a> (2023).</li>
<li>Watkins, S. C., St. Croix, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+imaging+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Light sheet imaging comes of age.</a> Journal of Cell Biology. 217 (5), 1567-1569 (2018).</li>
<li>Ndlec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+and+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules and motors.</a> Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).</li>
<li>Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+motion+in+hierarchically+assembled+active+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter.</a> Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li>
<li>Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensile+to+contractile+transition+in+active+microtubule-actin+composites+generates+layered+asters+with+programmable+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (5), e2115895119(2022).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isomorphic+coalescence+of+aster+cores+formed+in+vitro+from+microtubules+and+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Isomorphic coalescence of aster cores formed in vitro from microtubules and kinesin motors.</a> Physical Biology. 13 (5), 056002(2016).</li>
<li>Millett-Sikking, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMillett-Sikking%2C+A+%22High+NA+single-objective+lightsheet%22">High NA single-objective lightsheet</a>. , (2019).</li>
<li>Bourgenot, C., Saunter, C. D., Taylor, J. M., Girkin, J. M., Love, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+adaptive+optics+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">3D adaptive optics in a light sheet microscope.</a> Optics Express. 20 (12), 13252-13261 (2012).</li>
<li>Bernardello, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+multimodal+platform+for+classical+and+high+throughput+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Modular multimodal platform for classical and high throughput light sheet microscopy.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1969(2022).</li>
<li>Crombez, S., Leclerc, P., Ray, C., Ducros, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+hyperspectral+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Computational hyperspectral light-sheet microscopy.</a> Optics Express. 30 (4), 4856-4866 (2022).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar. Todas as pesquisas foram realizadas na ausência de relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como conflito de interesses.

Dois detalhes importantes sobre esse protocolo são o custo geral do sistema e o tempo esperado de construção e alinhamento. Embora o custo exato seja variável, podemos confortavelmente estimar que o custo in toto deste SOLS ou de um sistema DIY semelhante cairia na faixa de US$ 85.000. Observamos que esta estimativa considera o preço de varejo de todos os componentes, portanto, esse preço global pode ser bastante reduzido pelo fornecimento de componentes usados. Em termos de tempo de construção, seria razoável esperar que um usuário com pouca experiência óptica construísse e alinhasse todo esse sistema SOLS dentro de 1-2 meses, desde que todos os componentes estejam disponíveis e prontos. Apesar da extensão e complexidade do protocolo, acreditamos que a quantidade de detalhes no manuscrito escrito, pareado com o protocolo de vídeo, deve tornar este protocolo simples e rápido de seguir.
Há duas etapas críticas neste protocolo. Primeiro, a colocação do galvo determina o posicionamento de muitas lentes, pois faz parte de três pares de lentes 4f separados. É crucial que o galvo seja conjugado com os planos focais traseiros de O1 e O2 e centralizado corretamente para garantir a varredura invariante de inclinação. Em segundo lugar, a qualidade da imagem é extremamente sensível ao alinhamento de O2 e O3 em relação um ao outro. Aqui, deve-se tomar cuidado para garantir que, primeiro, o ângulo de alinhamento de O3 a O2 corresponda à inclinação da folha de luz de excitação, fornecendo assim iluminação plana máxima em todo o FoV igualmente inclinado. Em segundo lugar, o O3 deve ser colocado na distância axial correta para manter um FoV plano com a maior área possível. Terceiro, o O3 deve ser colocado na distância lateral correta do O2 para maximizar o sinal que passa pela interface O2-O3.

Em termos de FoV utilizável, este sistema alcançou um campo plano e confiável com iluminação consistente em uma área de 80 μm x 80 μm. Essa área é menor do que o FoV máximo fornecido pela câmera, de modo que o FoV utilizável é indicado pela caixa amarela na Figura 13. Em termos de poder de resolução, esse sistema alcançou uma distância mínima resolúvel de 432 nm ao longo do eixo x e 421 nm ao longo do eixo y, que foi medida encontrando o sigma x e y médios das funções gaussianas de dispersão pontual (PSFs) no bom FoV e multiplicando por dois. Observamos que este sistema não foi otimizado em termos de seu NA total, o que significa que há espaço para melhorias significativas se os usuários desejarem um poder de resolução maior do que o que este sistema alcançou. Há uma infinidade de opções objetivas compatíveis para esse tipo de construção SOLS, muitas das quais contribuiriam para uma maior resolução do sistema, mas com as desvantagens de um custo mais alto, um FoV menor ou técnicas de alinhamento mais complicadas na interface do relé 8,11,13,20. Separadamente, se os usuários desejarem um FoV maior, a incorporação de um segundo galvo para permitir a digitalização 2D atingiria esse objetivo, mas exigiria óptica e mecânica de controle adicionais para serem integradas ao projeto32. Fornecemos mais detalhes sobre as modificações no sistema em nossa página do site, juntamente com links para outros recursos úteis sobre o processo de design23.

Além de melhorar os componentes específicos para este projeto em particular, seria muito viável adicionar outras técnicas ou modalidades de microscopia de alta resolução a esta construção. Uma dessas melhorias seria incorporar a iluminação multicomprimento de onda, o que envolveria o alinhamento de lasers de excitação adicionais ao caminho de excitação original8. Além disso, como esse tipo de desenho do SOLS deixa a amostra acessível, a adição de funções adicionais ao microscópio, incluindo, mas limitadamente, tweezing óptico, microfluídica e reometria, é relativamente simples 2,33.

Em comparação com a miríade de guias de folha de luz que foram publicados, este protocolo fornece instruções em um nível de compreensão que um usuário sem experiência óptica significativa pode achar útil. Ao tornar uma construção SOLS fácil de usar com recursos tradicionais de montagem de lâminas de amostra acessível a um público maior, esperamos permitir uma expansão ainda maior das aplicações da pesquisa baseada em SOLS em todos os campos em que o instrumento tem ou poderia ser utilizado. Mesmo com as aplicações dos instrumentos SOLS crescendo rapidamente em número 2,34,35, acreditamos que muitos benefícios e utilizações de instrumentos do tipo SOLS ainda permanecem inexplorados e expressam entusiasmo com as possibilidades desse tipo de instrumento avançar.

A microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) representa uma família de técnicas de imagem de fluorescência de alta resolução em que a luz de excitação é moldada em uma folha 1,2, incluindo microscopia de iluminação plana seletiva (SPIM), excitação planar confocamente alinhada varrida (SCAPE) e microscopia de plano oblíquo (OPM)3,4,5,6,7. Ao contrário de outras modalidades de microscopia, como epifluorescência, microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRFM) ou microscopia confocal, a fototoxicidade é mínima no LSFM e as amostras podem ser imageadas em escalas de tempo mais longas, pois apenas o plano da amostra que está sendo ativamente fotografada é iluminado 8,9,10. Portanto, as técnicas de LSFM são extremamente úteis para a obtenção de imagens de amostras 3D em longos períodos de tempo, notadamente mesmo aquelas muito espessas para técnicas de microscopia confocal. Por essas razões, desde seu desenvolvimento original em 2004, o LSFM tornou-se a técnica de imagem de escolha para muitos fisiologistas, biólogos do desenvolvimento e neurocientistas para a visualização de organismos inteiros, como zebrafish vivo e embriões de Drosophila 3,4,6,11 . Nessas duas últimas décadas, as vantagens do LSFM têm sido aproveitadas para visualizar estrutura e dinâmica em escalas progressivamente menores, incluindo as escalastecidual11,12, celular e subcelular, tanto in vivo quanto in vitro13,14,15,17.
Apesar dos relatos de casos de uso bem-sucedidos na literatura, o alto custo dos sistemas comerciais de LSFM (~0,25 milhões de dólares até o momento em que este artigo foi escrito)18,19 impede o uso generalizado da técnica. Para tornar o DIY uma alternativa viável para pesquisadores, vários guias de construção foram publicados 8,13,20,21, incluindo o esforço de acesso aberto OpenSPIM 22. No entanto, até o momento, pesquisadores com experiência óptica mínima só podem usar desenhos LSFM anteriores, que são incompatíveis com amostras tradicionais montadas em lâminas (Figura 1A). A recente implementação de um único objetivo, light-sheet (SOLS) utiliza um único objetivo tanto para a excitação quanto para a detecção (Figura 1C), superando assim a limitação relacionada à compatibilidade 5,6,8,13,20. No entanto, o custo para a versatilidade do projeto SOLS é um aumento substancial na complexidade da construção devido à exigência de duas objetivas adicionais para retransmitir, desinclinar e recriar imagens do plano do objeto na câmera para geração de imagens (Figura 1D). Para facilitar o acesso às configurações complexas no estilo SOLS, este artigo apresenta um guia passo a passo sobre o projeto, construção, processo de alinhamento e uso de um sistema SOLS compatível com slides, que seria útil para pesquisadores com conhecimento de apenas um curso de óptica de nível básico.
Embora o protocolo em si seja sucinto, os leitores devem consultar outros recursos durante as etapas de preparação para saber mais sobre partes específicas do design ou considerações de hardware. No entanto, se um leitor pretende seguir as especificações deste projeto, pode não ser necessário entender como selecionar componentes ópticos específicos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig01.jpg"> Figura 1: Características das diferentes configurações do LSFM. (A) A configuração com dois objetivos ortogonais comuns nos primeiros projetos de LSFM. Nesta configuração, um tubo capilar ou um cilindro de gel é usado para conter a amostra, o que não é compatível com as técnicas tradicionais de montagem por lâmina. (B) Um esquema de um desenho de folha luminosa SOLS mostrando o seguinte: (C) o objetivo único usado tanto para a excitação quanto para a coleta de emissões no plano da amostra (O1); isso permite que uma corrediça tradicional seja montada na parte superior, e (D) o sistema de objetiva do relé no caminho de emissão SOLS. O O2 coleta a luz de emissão e desamplia a imagem. O O3 fotografa o plano no ângulo de inclinação correto no sensor da câmera. Abreviações: LSFM = microscopia de fluorescência de folhas; SOLS = folha luminosa de objetivo único; O1-O3 = objetivos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Lente Plano-Concave de 1" f = -50 mm</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>LC1715-A-ML</td><td>Para laser de alinhamento Custo estimado: $49.5</td></tr><tr><td>Doubleto acromático de 1" f = 100 mm (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A-ML</td><td>L2, L4 e laser de alinhamento Custo estimado: $342.42</td></tr><tr><td>Doublet acromático de 1" f = 125 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-125-A-ML</td><td>SL2 Custo estimado: $114.14</td></tr><tr><td>Doubleto acromático de 1" f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L3 Custo estimado: $114.14</td></tr><tr><td>Gibão acromático de 1" f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>TL2 Custo estimado: $114.14</td></tr><tr><td>Gibão acromático de 1" f = 45 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-045-A-ML</td><td>L1 Custo estimado: $114.14</td></tr><tr><td>Gibão acromático de 1" f = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-075-A-ML</td><td>SL1 Custo estimado: $114.14</td></tr><tr><td>Lente Cilíndrica de 1" f = 100 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1567RM</td><td>CL3 Custo Estimado: $117.62</td></tr><tr><td>Lente Cilíndrica de 1" f = 200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1653RM</td><td>CL2 Custo Estimado: $111.22</td></tr><tr><td>Lente Cilíndrica de 1" f = 50 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1695RM</td><td>CL1 Custo Estimado: $117.62</td></tr><tr><td>Furo de Pino Montado de 1", 30 &micro; m Diâmetro do furo</td><td>Thorlabs</td><td>P30K</td><td>Custo estimado: $ 77,08</td></tr><tr><td>Espelho prateado de 1 "(x3)</td> <td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>M1, M2, um para alinhamento Custo estimado: $ 168,78</td></tr><tr><td>Espelho elíptico de 2 "</td><td>Thorlabs</td><td>PFE20-P01</td><td>M3 Custo estimado: $ 179,98</td></tr><tr><td>Suporte de poste de 2 "(x11)</td> <td>Thorlabs</td><td>PH2</td><td>Para montagem a laser personalizada, roda ND, telas de segurança Custo estimado: $98.45</td></tr><tr><td>Postes de 2" (x47)</td><td>Thorlabs</td><td>TR2</td><td>Para montagem a laser personalizada e componentes ópticos Custo estimado: $277.3</td></tr><tr><td>Postes de 3" (x4)&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TR3</td><td>Para suportes M3 e outras montagens Custo estimado: $24.6</td></tr><tr><td>Suporte de poste de 3" (x4)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td>Custo estimado <td>do PH3</td><td>: $38.48</td></tr><tr><td>Adaptador de gaiola de 30 a 60 mm&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>LCP33</td><td>Para montar O1 Custo estimado: $45.42</td></tr><tr><td>Roda de filtro de gaiola de 30 mm</td><td>Thorlabs</td><td>CFW6</td><td>Para montar filtros ND Custo estimado: $172.36</td></tr><tr><td>Placa de gaiola de 30 mm (x6)</td><td>Thorlabs</td><td>CP33</td><td>Para construir gaiola de alinhamento e laser de alinhamento Custo estimado: $114.54</td></tr><tr><td>Montagem de espelho cinemático de ângulo reto de 30 mm (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td><td>Para montar M1 e M2 e para alinhamento a laser Custo estimado: $463.95</td></tr><tr><td>Suporte de poste de 4" (x30)</td><td>Thorlabs</td><td>PH4</td><td>Custo estimado: $320.1</td></tr><tr><td>Laser de 561 nm e fonte de alimentação&nbsp;</td><td>Opto Engine LLC</td><td>MGL-FN-561-100mW</td><td>Excitação laser Custo estimado: $6000</td></tr><tr><td>Placa de gaiola de 60mm (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01</td><td>Para montar montagem TL1 e M3 Custo estimado: $88.52</td></tr><tr><td>Montagem de espelho cinemático de ângulo reto de 60mm</td><td>Thorlabs</td><td>KCB2</td><td>Para montar M3 Custo estimado: $187.26</td></tr><tr><td>90&deg; </td><td>Thorlabs</td> de Montagem Flip<td>TRF90</td><td>Para alinhamento laser Custo estimado: $95.5</td></tr><tr><td>Adaptador com roscas externas C-Mount e roscas internas SM1</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A9</td><td>Para conectar o tubo da lente à câmera Custo estimado: $20.96</td></tr><tr><td>Adaptador com roscas externas SM1 e roscas internas C-Mount</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A10</td><td>Para conectar a lente do tubo à montagem da lente Custo estimado: $21.82</td></tr><tr><td>Adaptador com roscas SM1 externas e roscas M25 internas (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A12</td><td>Para montar O1 e O2 Custo estimado: $47.06</td></tr><tr><td>Adaptador com roscas SM1 externas e roscas M26 internas</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A27</td><td>Para montar O3 Custo estimado: $22.38</td></tr><tr><td>Disco de Alinhamento</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A7</td><td>Custo estimado: $ 20.45</td></tr><tr><td>Alinhamento Laser</td><td>BISKEE</td><td></td><td>https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM Custo estimado: $16.98</td></tr><tr><td>Slide de plástico autolubrificante, vermelho&nbsp;</td>Custo estimado <td>do Chroma</td><td>92001</td><td>: $20</td></tr><tr><td>Obturador de feixe&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1SH1</td><td>Para bloquear a luz laser Custo estimado: $65.8</td></tr><tr><td>Montagem de rotação da gaiola (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1T</td><td>Para montar CL1-3 Custo estimado: $282.15</td></tr><tr><td>Hastes do sistema de gaiola 1" (x8)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER1</td><td>Para montar M3 e O1 Custo estimado: $44.8</td></tr><tr><td>Hastes do sistema de gaiola 3" (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER3</td><td>Para montar O3 Custo estimado: $14.28</td></tr><tr><td>Hastes do sistema de gaiola 4" (x4)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER4</td><td>Para montar fenda Custo estimado: $30.76</td></tr><tr><td>Sistema de gaiola Hastes 8" (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER8</td><td>Para alinhamento de lentes tubulares Custo estimado: $25.3</td></tr><tr><td>Hastes do sistema de gaiola 12" (x8)</td><td>Thorlabs</td><td>ER12</td><td>Para gaiola de alinhamento Custo estimado: $145.36</td></tr><tr><td>Câmera</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 sCMOS</td><td>Custo estimado: ~$14,000</td></tr><tr><td>Garfo de fixação (x35)</td><td>Thorlabs</td><td>CF125</td><td>Para prender montagens de postes Custo estimado: $338.8</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura, 22 x 22 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>2850-22</td><td>Para amostras de lâminas Custo estimado: $265</td></tr><tr><td>Dichroic&nbsp;</td><td>AVR</td><td>DI01-R405/488/561/635-25x36</td><td>Para dividir caminhos de exciação/emissão Custo estimado: $965</td></tr><tr><td>Estágio de tradução em cauda de andorinha</td><td>Thorlabs</td><td>DT12</td><td>Para traduzir pinhole Custo estimado: $90.55</td></tr><tr><td>Filtro de emissão</td><td>Thorlabs</td><td>FELHO600</td><td>Custo estimado: $140.99</td></tr><tr><td>Disco de alinhamento de vidro fosco (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1</td><td>Para gaiola de alinhamento e plano intermediário Custo estimado: $ 75,14</td></tr><tr><td>Gerador de função</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP 33120A 15 MHz</td><td>Para controlar galvo Custo estimado: $ 900</td></tr><tr><td>Galvanômetro - Sistema de grande diâmetro de feixe 1D</td><td>Thorlabs</td><td>GVS011</td><td>Custo estimado: $ 1715,78</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação do galvanômetro</td><td>Siglent</td><td>SPD3303C</td><td>Custo estimado: $ 300</td></tr><tr><td>Gelrite</td><td>Research Products International</td><td>G35020-100.0</td><td>Goma gelana para amostra de contas 3D Custo estimado: $68.25</td></tr><tr><td>Software FIJI</td><td>Download de código</td><td></td> aberto <td>de https://imagej.net/software/fiji/downloads Custo estimado:</td></tr><tr><td>Placa quente / agitador</td> gratuito <td>Corning</td><td>6795-220</td><td>Para preparar soluções de amostra Custo estimado: $ 550</td></tr><tr><td>Controlador de motor escovado K-Cube</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>Drives Z825B Custo estimado: $ 757,51</td></tr><tr><td>Kinematic Mount</td><td>Thorlabs</td><td>KM100S</td><td>Para montar dicroic Custo estimado: $ 92,01</td></tr><tr><td>Kinesis Software</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td></td><td>Baixe em https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 Custo estimado:</td></tr><tr><td>Bloqueador de luz laser</td> gratuito<td>Thorlabs&nbsp;</td><td>LB1</td><td>Para reflexões de filtro ND Custo estimado: $57.65</td></tr><tr><td>Montagem a laser</td><td>personalizada impressa</td><td></td> em <td>3D Custo estimado: N/A</td></tr><tr><td>Tela de segurança a laser (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TPS4</td><td>Para bloquear luz laser difusa Custo estimado: $92.02</td></tr><tr><td>Lente de tubo de varredura a laser</td><td>Thorlabs</td><td>TTL200MP</td><td>TL1 Custo estimado: $1491</td></tr><tr><td>Montagem de lente (x10)&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td>Para montar todas as lentes e espelho de alinhamento extra. Custo estimado: $164.7</td></tr><tr><td>Régua magnética</td><td>Thorlabs</td><td>BHM4</td><td>Para verificar o alinhamento Custo estimado: $52.74</td></tr><tr><td>Micro-Manager Software&nbsp;</td><td>Download de código</td><td></td> aberto <td>do https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release Custo estimado: Lâminas de</td></tr><tr><td>microscópio</td> gratuitas <td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12550400</td><td>Para amostras de lâminas Custo estimado: $123.9</td></tr><tr><td>Estágio do microscópio&nbsp;</td><td>ASI</td><td>FTP-2000 com peças personalizadas</td><td>Para traduzir amostras Custo estimado: ~$16,000</td></tr><tr><td>Mini Misturador de Vórtice&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10153-688</td><td>Para preparação de amostras Custo estimado: $152.64</td></tr><tr><td>Atuador motorizado</td><td>Thorlabs</td><td>Z825B</td><td>Para tradução fina M1 Custo estimado: $729.07</td></tr><tr><td>Íris padrão montada (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>ID20</td><td>Pelo menos 2 para alinhamento Custo estimado: $118.02</td></tr><tr><td>Conjunto de filtros ND&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>NDK01&nbsp;</td><td>Para reduzir a intensidade da excitação Custo estimado: US$ 726,73</td></tr><tr><td>Lente Objetiva 1</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Plan Apo 60X/ 1.20 WI</td><td>O1 Custo estimado: ~$15,000</td></tr><tr><td>Lente objetiva 2</td><td>Nikon</td><td>TU Plan Fluor 100X/0.90&nbsp;</td><td>O2 Custo estimado: ~$6,000</td></tr><tr><td>Lente objetiva 3</td><td>Plano de Mitutoyo</td><td>Apo HR 50X/0.75</td><td>O3 Custo estimado: ~$6,800</td></tr><tr><td>Software de desinclinação OPM</td><td>de código</td><td></td> aberto <td>Para processamento de imagem. Baixe em https://github.com/QI2lab/OPM Custo estimado:</td></tr><tr><td>Sensor de potência de fotodiodo</td> gratuito <td>Thorlabs&nbsp;</td><td>S121C</td><td>Para medir a intensidade do laser Custo estimado: $379.68</td></tr><tr><td>Distorção de grade positiva</td><td>Target Thorlabs</td><td>R1L3S3P</td><td>Brightfield alignment Custo estimado: $267.87</td></tr><tr><td>Medidor de potência Console digital</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>PM100D</td><td>Para medir a intensidade do laser Custo estimado: $1245.48</td></tr><tr><td>Rodamina 6G</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>J62315.14</td><td>Para amostra de lâmina revestida com fluorescência Custo estimado: $27.7</td></tr><tr><td>Grampo de ângulo reto para postes</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>RA90</td><td>Para suporte M3 e espelho flip down Custo estimado: $32.46</td></tr><tr><td>RMS-Placa de gaiola rosqueada (x2)&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>CP42</td><td>Para alinhamento a laser Custo estimado: $70.56</td></tr><tr><td>Placa de cisalhamento 2.5-5.0 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI050P&nbsp;</td><td>Custo estimado: $ 182.85</td></tr><tr><td>Placa de cisalhamento 5,0-10,0 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI100P</td><td>Custo estimado: $ 201,47</td></tr><tr><td>Placa de cisalhamento 10,0-25,4 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI254P</td><td>Custo estimado: $ 236,42</td></tr><tr><td>Tela de visualização da placa de cisalhamento</td><td>Thorlabs</td><td>SIVS</td><td>Custo estimado: $ 337,74</td></tr><tr><td>Interferômetro de cisalhamento com placa de 1-3 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI035</td><td>Para verificação de colimação Custo estimado: $ 465,85</td></tr><tr><td>Colarinho de Poste Slip-On (x35)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>R2</td><td>Para manter a altura do poste Custo estimado: $208.25</td></tr><tr><td>Fenda</td><td>Thorlabs</td><td>VA100</td><td>Custo estimado: $294.64</td></tr><tr><td>Tubo de lente ranhurado, 3"</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1L30C</td><td>Para alinhamento a laser Custo estimado: $77.45</td></tr><tr><td>Espelho quadrado, 1 x 1"</td><td></td><td></td><td>https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva did=642191768069& hvpos = & hvne tw=g& hvrand=1336734911900437 4691& hvpone=& hvptwo=& hvqmt= & hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint=& hvlocphy=9031212& hvtargid=pla-1 943952718742& gclid=Cj0KCQiA6L yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA Lw_wcB& th=1 Custo estimado: $14.76</td></tr><tr><td>Tubo de lente empilhável 1/2" (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td>Para montar CL1-3 Custo estimado: $40.86</td></tr><tr><td>Tubo de lente empilhável 1"</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L10</td><td>Para montar O3 Custo estimado: $15.41</td></tr><tr><td>Tubo de lente empilhável 2" (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L20</td><td>Para caminho da câmera Custo estimado: </td></tr><tr><td>Adaptador de Base de Pedestal com Tachas $35.7 (x37)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>BE1</td><td>Para anexar suportes de poste à tabela Custo estimado: $400.71</td></tr><tr><td>Montagem de lente de translação (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>LM1XY</td><td>Para transladar pinhole, O2 e O3 Custo estimado: $441</td></tr><tr><td>Estágio de tradução com micrômetro padrão (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>TS1-2 Custo estimado: $647.54</td></tr><tr><td>Estágio de tradução do manual de viagem</td><td>Thorlabs</td><td>CT1A</td><td>Montagem de translação de gaiola O3 Custo estimado: $497.3</td></tr><tr><td>Lente de tubo</td><td>Nikon</td><td>MXA20696</td><td>TL3 Custo estimado: $359</td></tr><tr><td>Thorlabs LED montados em branco</td><td>&nbsp;</td>Fonte de luz <td>MNWHL4</td><td>Brightfield Custo estimado: US$ 171,28</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>CUSTO TOTAL ESTIMADO: $ 84.858,98</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Os autores observam que muitas peças foram compradas usadas. Aqui, tentamos refletir o preço de varejo de todos os itens, de modo que o custo total pode ser bastante reduzido comprando itens específicos usados, especialmente os mais caros.</td></tr><tr><td>COMPONENTES OPCIONAIS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grasshopper3 USB3</td><td>FLIR&</td><td>nbsp; GS3-U3-23S6C-C</td><td>Para verificações de diagnóstico durante o alinhamento. A câmera Acquisiton pode ser usada em seu lugar, mas requer realinhamento posteriormente. Custo estimado: $1089</td></tr></tbody></table>

projeto e construção de um microscópio de fluorescência de lâmina de luz personalizável, de objetiva Única para a visualização de redes de citoesqueleto

Design and Building of a Customizable, Single-Objective, Light-Sheet Fluorescence Microscope for the Visualization of Cytoskeleton Networks

Compósitos reconstituídos do citoesqueleto têm emergido como um valioso sistema modelo para o estudo da matéria mole fora do equilíbrio. A captura fiel da dinâmica dessas redes densas e 3D exige seccionamento óptico, que é frequentemente associado a microscópios confocais de fluorescência. No entanto, desenvolvimentos recentes na microscopia de fluorescência de folhas de luz (LSFM) estabeleceram-na como uma alternativa econômica e, às vezes, superior. Para tornar o LSFM acessível aos pesquisadores do citoesqueleto menos familiarizados com a óptica, apresentamos um guia passo a passo para iniciantes para a construção de um microscópio de fluorescência versátil de folhas de luz a partir de componentes prontos para uso. Para permitir a montagem de amostras com amostras de lâminas tradicionais, este LSFM segue o design de folha de luz de objetivo único (SOLS), que utiliza uma única objetiva para a coleta de excitação e emissão. Descrevemos a função de cada componente do SOLS em detalhes suficientes para permitir que os leitores modifiquem a instrumentação e a projetem para atender às suas necessidades específicas. Finalmente, demonstramos o uso deste instrumento SOLS personalizado visualizando asters em redes de microtúbulos acionadas por cinesina.

Foram realizadas varreduras volumétricas de esferas de 1 μm embebidas em goma gelana. A Figura 14 mostra as projeções de intensidade máxima das varreduras volumétricas escriturosas ao longo das direções x, y e z.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig14.jpg"> Figura 14: Imagem volumétrica de esferas fluorescentes de 1 μm em goma gelana. Projeções de intensidade máxima de varreduras volumétricas escriturosas são mostradas. Barras de escala = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig14large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Demonstramos o uso do microscópio de lâmina de luz de objetiva única para caracterizar redes de citoesqueleto reconstituídas através da realização de varreduras volumétricas de amostras de asters de microtúbulos. Em resumo, microtúbulos estabilizados com taxol marcados com rodamina foram polimerizados a partir de dímeros reconstituídos por GTP; em seguida, após a polimerização, clusters motores de cinesina à base de estreptavidina foram misturados em amostras juntamente com ATP para concentrações finais de microtúbulos de 6 μM, dímeros de cinesina 0,5 μM e ATP 10 mM. Extensos protocolos e guias para a preparação de microtúbulos estabilizados com taxol e clusters motores de cinesinas podem ser encontrados nos sites do Mitchson Lab e do DogicLab25,26. As amostras foram pipetadas suavemente em lâminas de microscópio, seladas e deixadas descansar por 8 h antes da obtenção de imagens para permitir que a atividade motora cessasse de modo que as amostras atingissem um estado estrutural estável que se assemelhasse a ásteres.
Estudos de sistemas de citoesqueleto reconstituído empregam mais frequentemente microscopia confocal ou de epifluorescência para obtenção de imagens de filamentos marcados. No entanto, ambas as técnicas são limitadas em sua capacidade de obter imagens de amostras 3D densas27. Embora muito progresso tenha sido feito na pesquisa de matéria ativa baseada em citoesqueleto in vitro, restringindo as amostras a serem quase 2D28,29, as redes de citoesqueleto são inerentemente 3D, e muitos esforços atuais estão na compreensão dos efeitos que só podem surgir em amostras 3D29,30, criando assim uma necessidade de imagens 3D de alta resolução.
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig15.jpg"> Figura 15: Facilitação da visualização 3D de amostras reconstituídas do citoesqueleto por microscopia óptica de objetivo único. (A) Imagens de asters de microtúbulos fluorescentes adquiridas em microscópio confocal de varredura a laser Leica DMi8. As imagens mostram diferentes planos de um z-scan. Barra de escala = 30 μm. (B) Imagens desconvolvidas de uma varredura volumétrica realizada na configuração de folha de luz de objetivo único da mesma amostra. Barra de escala = 30 μm. A área da imagem com costura corresponde ao FoV utilizável (caixa amarela) demonstrado na Figura 13B. Enquanto o confocal se destaca na obtenção de imagens de planos únicos perto da lamínula, a densidade da amostra fluorescente introduz complicações ao obter imagens em planos mais altos devido ao sinal adicional vindo de abaixo do plano da imagem. A folha de luz contorna esse problema iluminando apenas o plano da imagem, permitindo assim imagens uniformemente nítidas em diferentes planos em z. Abreviaturas: SOLS = folha luminosa de objetivo único; FoV = campo de visão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig15large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Na Figura 15, demonstramos a imagem volumétrica de uma rede de microtúbulos reconstituída contraída em estruturas aster-like por aglomerados motores de cinesina. Como mostrado em pesquisas anteriores 28,31, essas estruturas 3D tendem a crescer densas em direção ao centro, resultando em regiões brilhantes de fluorescência que são predominantes no sinal. Em planos de imagem próximos à lamínula (nível z baixo), a microscopia confocal (Figura 15A) pode resolver filamentos únicos ao redor da periferia da aster, com fundo adicional em direção ao centro devido a sinais de fluorescência fora de foco vindos de cima. No entanto, mover alguns mícrons em z reduz rapidamente a qualidade das imagens devido às seções densas fora de foco do aster serem predominantes no sinal no plano da imagem. A iluminação monoplanar da folha de luz (Figura 15B) elimina os sinais fora de foco das partes densas do aster acima e abaixo do plano de imagem, permitindo assim uma qualidade de imagem comparável entre os planos. A capacidade da folha de luz de produzir dados de varredura volumétrica confiáveis e de alta qualidade abre a possibilidade de visualizar e caracterizar fenômenos 3D em sistemas de citoesqueleto reconstituídos.

Este protocolo descreve em detalhes como construir um microscópio de fluorescência de lâmina de luz de objetiva única e seu uso para visualizar redes de citoesqueleto.

Projeto e Construção de um Microscópio de Fluorescência de Lâmina de Luz Personalizável, de Objetiva Única para a Visualização de Redes de Citoesqueleto

Reconstituted cytoskeleton composites have emerged as a valuable model system for studying non-equilibrium soft matter. The faithful capture of the ...

Nosso trabalho visa avançar no conhecimento sobre a relação entre a dinâmica do trabalho trans, a estrutura local e as propriedades mecânicas em materiais distantes do equilíbrio. A visualização de materiais distantes do equilíbrio, como redes de citoesqueleto, requer a capacidade de obter imagens de amostras tridimensionais densas com qualidade de imagem comparável em todo o volume da amostra, ao mesmo tempo em que causa danos mínimos por meio do fotoclareamento, uma tarefa tecnicamente desafiadora para a qual a microscopia de fluorescência é mais adequada. Os sistemas de microscópio de fluorescência fornecem excelentes capacidades de seccionamento óptico, o que permite a obtenção de imagens dessas amostras espessas e tridimensionais para longas escalas de tempo com o mínimo de fotoclareamento.Em particular, o sistema de folha de luz de objetivo único que apresentaremos é compatível com as amostras tradicionais montadas em slides, tornando-o uma ferramenta muito versátil. A esmagadora maioria dos guias de folha de luz de objetivo único são escritos para usuários com ampla experiência em óptica. Para tornar a configuração complexa de estilo de folha de luz de objetivo único mais acessível, este guia detalhado fornece etapas que um usuário com um curso de óptica de nível básico pode seguir.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Em muitas situações biológicas e clínicas, é vantajoso para estudar os processos celulares como eles evoluem no seu microambiente nativa. Aqui, descrevemos a montagem e uso de um microscópio de baixo custo de fibra óptica que pode fornecer imagens em tempo real em cultura de células, estudos em animais e estudos clínicos do paciente.

De alta resolução de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imagem

Imagens microscópicas de vida das células endoteliais expressando GFP-actina permite a caracterização de mudanças dinâmicas em estruturas do citoesqueleto. Ao contrário das técnicas que utilizam amostras fixadas, este método fornece uma avaliação detalhada das mudanças temporais no citoesqueleto de actina nas mesmas celas antes, durante e depois de vários estímulos físicos, farmacológicos, ou inflamatórias.

Estudo do citoesqueleto de actina em Live Células Endoteliais Expressando GFP-Actina

Este protocolo descreve a configuração de uma folha de microscópio de luz e sua implementação para imagem in vivo de C. elegans embriões.

Configurando um Microscópio folha de luz simples para<em&gt; Em Toto</em&gt; Imagem de<em&gt; C. elegans</em&gt; Desenvolvimento

Um módulo para microscopia de iluminação plano único (SPIM) está descrito que é facilmente adaptado a um microscópio de campo amplo invertido e optimizado para culturas de células de 3-dimensionais. A amostra está localizado dentro de um capilar rectangular, e através de um sistema de microfluidos corantes fluorescentes, agentes farmacêuticos ou de drogas pode ser aplicada em pequenas quantidades.

Único plano Iluminação Módulo e Abordagem Micro-capilar por um microscópio Wide-campo

A preparação de bicamadas lipídicas planares com suporte de vidro funcionalizadas por proteínas, determinação da mobilidade de proteínas e medição de densidades de proteínas é mostrada aqui. Um roteiro para a construção de um microscópio de reflexão interna total com redução de ruído é delineado, o que permite visualizar fluorocromos residentes em uma única camada com alta resolução espaço-temporal.

Bicamadas única molécula de microscopia de fluorescência em Planar Apoiado

Aqui, descrevemos uma abordagem de microscopia de folha clara para visualizar o infiltrado de leucócitos CD45 + cardíacos em um modelo murino de miocardite fulminante asséptica, que é induzida pelo tratamento de toxina diftônica intratraqueal de ratos CD11c.DTR.

Visualização Quantitativa de Infiltrado de Leucócitos em um Modelo Murino de Miocardite Fulminante por Microscopia de Folha de Luz

Imagiologia da morfogénese de embriões de insectos com microscopia de fluorescência com base em folha de luz tornou-se o estado da arte. Este protocolo descreve e compara três técnicas de montagem apropriadas para os embriões Tribolium castaneum, introduz dois novos feitos sob linhagens transgênicas bem adequado para imagens ao vivo, discute controles essenciais de qualidade e indica limitações experimentais atuais.

Luz Folha com base em microscopia de fluorescência de Vida ou fixados e corados<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Os embriões

Aqui, descrevemos um protocolo para a visualização de projeção dos neurônios motores e arborização do axônio em embriões de rato transgénicos Hb9::GFP . Depois de imunocoloração para os neurônios motores, usamos a microscopia de fluorescência folha de luz aos embriões de imagem para posterior análise quantitativa. Este protocolo é aplicável a outros processos de navegação do neurônio no sistema nervoso central.

Visualização do axônio Motor navegação e quantificação do axônio arborização em embriões de rato usando microscopia de fluorescência folha de luz

Este estudo utiliza uma técnica de microscopia (LSFM) de fluorescência de luz-folha de iluminação dupla face combinada com compensação óptica para estudar o coração murino.

Microscopia de fluorescência de luz-folha para o estudo do coração murino

Uma instrução detalhada é descrita em como construir um altamente inclinado varrido telha (HIST) microscópio e seu uso para a imagem latente de único-molécula.

Um guia para construir um altamente inclinado varreu o microscópio de telha para a imagem latente de único-molécula campo de visão alargado

A microscopia de fluorescência à base de folha de luz é a ferramenta mais valiosa na biologia do desenvolvimento. Um grande problema em estudos comparativos é a variância ambiente. Nosso protocolo descreve uma estrutura experimental para imagens ao vivo simultâneas de múltiplos espécimes e, portanto, aborda essa questão de forma pró-ativa.

Imagens ao vivo simultâneas de embriões múltiplos de insetos em microscópios de fluorescência baseados em folha de luz da amostra

Aprenda a construir um microscópio de fluorescência de lâmina de luz de objetiva única para visualizar redes de citoesqueleto em amostras tridimensionais densas. Este método minimiza o foto-branqueamento e permite imagens de alta qualidade em profundidade.

Projeto e Construção de um Microscópio de Fluorescência de Lâmina de Luz Personalizável, de Objetiva Única para a Visualização de Redes de Citoesqueleto (Vídeo) | JoVE Journal

Projeto e Construção de um Microscópio de Fluorescência de Lâmina de Luz Personalizável, de Objetiva Única para a Visualização de Redes de Citoesqueleto

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