Name: Transformação de raízes pilosas de soja para análise da função gênica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Aprenda a transformação de raízes pilosas de soja para análise da função gênica usando Glycine max. Este método permite estudar múltiplos genes simultaneamente e otimizar estratégias de engenharia antes da transformação estável.

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Esta pesquisa foi financiada pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) número de concessão RGPIN-2020-06111 e por uma generosa doação de Brad Lace. Gostaríamos de agradecer a Wayne Parrott (University of Georgia) pela K599 Agrobacterium e pelo protocolo preliminar, e ao Nakagawa & Hachiya lab (Shimane University) pelos vetores vazios pGWB2, pGWB6 e pANDA35HK.

NOTA: Recomenda-se que todas as etapas do processo sejam conduzidas em condições estéreis.
1. Esterilização de sementes de soja
<ol><li>Em um gabinete de biossegurança, coloque 16-20 sementes redondas de soja Williams 82 em estado puro (ou seja, sem rachaduras ou manchas) em um tubo de centrífuga de 50 mL.</li>
	<li>Adicione 30 mL de álcool isopropílico a 70%, agite suavemente por 30 s e, em seguida, decante o álcool.</li>
	<li>Agitar suavemente as sementes com 30 mL de água sanitária a 10% por 10 s e deixar as sementes permanecerem na solução por 5 min à temperatura ambiente (TR, 25 °C). Após 5 min, escorra a água sanitária.</li>
	<li>Repita o agitar três vezes com 30 mL de H 2 O ultrapuro estéril por1 min por enxágue e descarte o H2O entre cada enxágue.</li>
	<li>Colocar as sementes esterilizadas em papel filtro saturado com 5 mL de germinação e meio de co-cultivo (GC) (líquido de meia resistência em autoclave Murashige e meio Skoog [MS] com 1% de sacarose [pH = 5,8] e, em seguida, adicionar 2,5 mL/L de vitaminas) em placas de Petri estéreis.</li>
	<li>Colocar as placas no escuro a RT (25 °C) durante 3 dias antes de transferir as placas a 22 °C sob 16 h de luzes fluorescentes T5 branco-frias (100 μE m-2·s-1) durante 4 dias para permitir que as sementes germinem. OBS: Descarte as sementes que estão enrugadas ou rachadas. As melhores sementes são aquelas grandes e uniformemente amarelas. Esterilizar pelo menos o dobro do número de sementes necessárias para o experimento para selecionar sementes de boa qualidade, pois algumas sementes podem não ser ideais devido a danos, doenças ou falha na germinação.</li>
</ol>2. Infecção de cotilédones com K599
NOTA: Use vetores da série pGWB, pois sua seleção dupla garante a integração genômica de todo o de T-DNA. A eletroporação foi utilizada para transformar um vetor binário que abriga o gene de interesse em A. rhizogenes pRi265918.
<ol><li>Com base na sequência do plasmídeo18 de A. rhizogenes pRi2659, projetamos primers para detectar o gene do plasmídeo Ti VirD2 (VirD2 forward: 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'; VirD2 reverso: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; Tamanho esperado da amplificação: 221 pb). Após a transformação, teste as colônias de Agrobacterium para a retenção de VirD2 por reação em cadeia da polimerase (PCR) usando um Kit de PCR (ver Tabela de Materiais). Ciclo de PCR: 94 °C por 3 min; 35 ciclos (94 °C por 1 min, 58 °C por 30 seg, 72 °C por 1 min); e 72 °C por 10 min.</li>
	<li>Após a seleção da colônia de A. rhizogenes que contém tanto VirD2 quanto o gene de interesse (GOI), coloque algumas em placas de meio Luria-Bertani (LB) contendo os antibióticos apropriados (50 mg/L) para o plasmídeo de interesse e incube durante a noite a 30 °C. Se utilizar espectinomicina, adicionar uma concentração de 100 mg/L.</li>
	<li>Use uma ponta de pipeta P200 para raspar um comprimento de ~1,5 cm da Agrobactéria K599 das placas LB e ressuspender as células em 1 mL de tampão fosfato (PB; 0,01 M Na2HPO4, 0,15 M NaCl, pH 7,5).</li>
	<li>Diluir o Agrobacterium em esterilizados, ultrapuros H2O (v/v = 1:1) e acetoseringona (AS; estoque de 100 mM em dimetilsulfóxido [DMSO], v/v = 1:1000). Medir a absorbância utilizando um tubo de cubeta a uma densidade óptica de 600 nm (OD600). A faixa ótima esperada está entre 0,5 e 0,8.</li>
	<li>Em um gabinete de biossegurança, mergulhe um bisturi esterilizado na solução K599 Agrobacterium e faça vários cortes de 1 mm de profundidade ao longo da superfície interna (lado adaxial, plano) do cotilédone. Durante a inoculação, utilizar pinça esterilizada para estabilizar o cotilédone.</li>
	<li>Coloque cerca de 6-8 cotilédones cortados lateralmente em uma placa de Petri contendo papel de filtro saturado com meio GC com AS. NOTA: Para preparar 6 placas, 50 mL de meio GC e 50 μL de 100 mM AS para atingir uma concentração final de 100 μM é suficiente.</li>
	<li>Incubar as placas em TR (25 °C) durante 3 dias sob fotoperíodo de 16 h (~65 μE).</li>
	<li>Transferir os cotilédones infectados para placas de crescimento radicular piloso (HRG) (autoclave de meia força MS com 3% de sacarose [pH = 5,8] e 2,6 g/L de Gelzan, em seguida adicionar 2,5 mL/L de mistura de vitaminas e 500 mg/L de timentin). NOTA: Houve alguns problemas com timentin de alguns fornecedores alternativos, dos quais o K599 não foi eliminado. Recomenda-se o uso de placas de placa de Petri mais altas (100 mm x 25 mm) para o meio HRG.</li>
	<li>Incubar as placas de HRG a 22 °C em uma câmara de crescimento com os parâmetros ajustados para 100 μE de luz em um fotoperíodo de 16 h até que raízes primárias com raízes secundárias de 2-3 cm de comprimento sejam observadas (~3-4 semanas).</li>
</ol>3. Seleção e colheita de RHs
<ol><li>Colher raízes primárias (5-7 cm de comprimento) que crescem a partir do calo e contêm raízes secundárias (2-3 cm de comprimento) usando um bisturi estéril e pinças. Transfira para a seleção placas HRG contendo os antibióticos apropriados. Deixe os HRs crescerem por mais 5 dias nas placas HRG de seleção. NOTA: Kanamicina (50 mg/L), higromicina (50 mg/L) ou fosfinotricina (10 mg/L) são normalmente usados para seleção. Para vetores de expressão, pGWB2 é usado para superexpressão, pANDA35HK é usado para silenciamento de RNAi, pGWB6 é usado para localização subcelular e pMDC7 é usado para expressão induzível.</li>
	<li>No dia 5, colher HRs transgênicas com raízes secundárias de 3 a 6 cm de comprimento. Se observarmos proteínas fluorescentes, as raízes secundárias têm pouca autofluorescência. Se estiver realizando elicitor ou tratamentos químicos, corte as raízes secundárias em pedaços de 1 cm e coloque ~100 mg em ágar HRG em uma pilha. Em seguida, saturar as estacas com 80 μL do tratamento adequado e deixar as placas incubarem em TR (25 °C).</li>
	<li>Após o tempo de tratamento desejado, prossiga com extrações de RNA ou metabólito.</li>
	<li>Para o RNA, seque rapidamente as raízes em um papel toalha esterilizado e colete-as diretamente em um tubo de microcentrífuga de 2 mL.</li>
	<li>Sele imediatamente a parte superior do tubo usando parafilme, faça dois pequenos furos usando pinças pontiagudas e submerja os tubos em nitrogênio líquido. Liofilizar durante 3 dias e, em seguida, armazenar as amostras a -80 °C. NOTA: É essencial selecionar HRs que são brancos. Após 5 dias de crescimento na placa seletiva, as HRs transgênicas permanecerão brancas, mas as raízes não transgênicas ficarão marrons.</li>
</ol>

Produção de alta eficiência de raízes pilosas de soja transgênica

<ol><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transformation+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Optimization of Agrobacterium-mediated transformation in soybean.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 246(2017).</li>
<li>Elhady, A., Hallmann, J., Heuer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiosis+of+soybean+with+nitrogen+fixing+bacteria+affected+by+root+lesion+nematodes+in+a+density-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Symbiosis of soybean with nitrogen fixing bacteria affected by root lesion nematodes in a density-dependent manner.</a> Scientific Reports. 10, 1619(2020).</li>
<li>Huang, X. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizosphere+interactions%3A+root+exudates%2C+microbes%2C+and+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Botany%22%5BJournal%5D)">Rhizosphere interactions: root exudates, microbes, and microbial communities.</a> Botany. 92 (4), 267-275 (2014).</li>
<li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+genetic+transformation+and+applications+in+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation and applications in citrus.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 1039094(2022).</li>
<li>Hwang, H. -H., Yu, M., Lai, E. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+plant+transformation%3A+biology+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22The+Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated plant transformation: biology and applications.</a> The Arabidopsis Book. 15, e0186(2017).</li>
<li>Gutierrez-Valdes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+cultures-a+versatile+tool+with+multiple+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 33(2020).</li>
<li>Ono, N. N., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiplicity+of+hairy+root+cultures%3A+prolific+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The multiplicity of hairy root cultures: prolific possibilities.</a> Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).</li>
<li>Kereszt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+soybean+to+study+root+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology.</a> Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soybean+hairy+roots+produced+in+vitro+by+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Crop+Journal%22%5BJournal%5D)">Soybean hairy roots produced in vitro by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation.</a> The Crop Journal. 6 (2), 162-171 (2018).</li>
<li>Song, J., Tóth, K., Montes-Luz, B., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soybean+hairy+root+transformation%3A+a+rapid+and+highly+efficient+method%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soybean hairy root transformation: a rapid and highly efficient method.</a> Current Protocols. 1 (7), e195(2021).</li>
<li>Fattahi, F., Shojaeiyan, A., Palazon, J., Moyano, E., Torras-Claveria, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl-%CE%B2-cyclodextrin+and+coronatine+as+new+elicitors+of+tropane+alkaloid+biosynthesis+in+Atropa+acuminata+and+Atropa+belladonna+hairy+root+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Methyl-β-cyclodextrin and coronatine as new elicitors of tropane alkaloid biosynthesis in Atropa acuminata and Atropa belladonna hairy root cultures.</a> Physiologia Plantarum. 172 (4), 2098-2111 (2021).</li>
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<li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+hairy+root+transformation+for+gene+functional+and+gene+editing+analysis+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation for gene functional and gene editing analysis in soybean.</a> Plant Methods. 17 (1), 73(2021).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Durante a última década, o método HR da soja tem sido desenvolvido como uma poderosa ferramenta para estudar genes envolvidos na fixação de nitrogênio 22,23, tolerância ao estresse biótico e abiótico 24,25 e vias biossintéticas de metabólitos 26,27. O conhecimento de como as plantas produzem metabólitos traz uma infinidade de benefícios para a pro...

A soja (Glycine max) está entre as culturas mais valiosas na agricultura. Possui milhares de usos comerciais e industriais, como alimentos, ração animal, óleo e como fonte de matéria-prima para a fabricação1. Sua capacidade de formar uma relação simbiótica com microrganismos fixadores de nitrogênio do solo, nomeadamente rizóbios, eleva ainda mais a importância do estudo da genética dasoja2. Por exemplo, o ajuste fino das propriedades de fixação de nitrogênio em raízes de soja pode levar à redução das emissões de carbono e reduzir significativamente as necessidades de fertilizantes nitrogenados3. Assim, o entendimento da genética que controla aspectos da biologia radicular da soja, em particular, tem amplas aplicações na agricultura e na indústria. Considerando esses benefícios, é importante ter um protocolo confiável para analisar a função dos genes da soja.
Agrobacterium tumefaciens é talvez a ferramenta mais comumente usada para transformação genética de plantas, pois tem a capacidade de integrar DNA DE TRANSFERÊNCIA (T-DNA) no genoma nuclear de muitas espécies vegetais. Quando a Agrobacterium infecta uma planta, ela transfere o plasmídeo indutor de tumor (Ti) para o cromossomo hospedeiro, levando à formação de um tumor no local da infecção. A transformação mediada por Agrobacterium tem sido amplamente utilizada há décadas para análise funcional de genes e modificação de características de culturas4. Embora qualquer gene de interesse possa ser prontamente transferido para células hospedeiras através da transformação mediada por A. tumefaciens, este método tem várias desvantagens; É demorado, caro e requer ampla experiência para muitas espécies de plantas, como a soja. Embora algumas variedades de soja possam ser transformadas pela abordagem do nó cotiledonar utilizando A. tumefaciens, a ineficiência dessa abordagem requer a necessidade de uma tecnologia alternativa de transformação genética que seja rápida e altamente eficiente 4,5. Mesmo um não especialista pode usar este método de transformação de raiz pilosa (HR) mediada por Agrobacterium rhizogenes para superar essas desvantagens.
A transformação da RH é uma ferramenta relativamente rápida, não só para analisar a função gênica, mas também para aplicações biotecnológicas, como a produção de metabólitos especializados e química fina, e glicoproteínas bioativascomplexas6. A produção de HRs de soja não requer grande especialização, pois podem ser geradas pela lesão das superfícies dos cotilédones, seguida da inoculação com Agrobacterium rhizogenes7. A. rhizogenes expressa genes de virulência (Vir) codificados por seu plasmídeo Ti que transferem, carregam e integram seu segmento de T-DNA no genoma de células vegetais e, ao mesmo tempo, estimulam o crescimento ectópico de raízes8.
Comparado a outros sistemas de expressão gênica de soja, como biolistics ou transformação baseada em A. tumefaciens de cultura de tecidos, células e órgãos, o sistema de expressão de HR apresenta várias vantagens. Em primeiro lugar, as HRs são geneticamente estáveis e produzidas rapidamente em meios livres de hormônios 1,9,10. Além disso, as HRs podem produzir metabólitos especializados em quantidades equivalentes ou superiores às raízes nativas11,12. Essas vantagens fazem dos HRs uma ferramenta biotecnológica desejável para espécies vegetais incompatíveis com A. tumefaciens ou que necessitam de condições especiais de cultura de tecidos para formar tecidos compatíveis. O método HR é uma abordagem eficiente para analisar interações proteína-proteína, localização subcelular de proteínas, produção de proteínas recombinantes, fitorremediação, mutagênese e efeitos genômicos amplos usando o sequenciamento de RNA13,14,15. Também pode ser utilizado para estudar a produção de metabólitos especializados que têm valor na indústria, incluindo as gliceolinas, que medicam a defesa da soja contra o importante patógeno microbiano Phytophthora sojae e têm impressionantes atividades anticâncer e neuroprotetoras em humanos16,17.
Este relato demonstra um protocolo fácil e eficiente para produzir HRs de soja. Em comparação com métodos anteriores de transformação da HR, este protocolo proporciona uma melhora significativa (33%-50%) na taxa de formação de FC por pré-triagem de transformadores de A. rhizogenes para a presença do plasmídeo Ti antes da inoculação de cotilédones de soja. Nós demonstramos a aplicabilidade deste protocolo através da transformação de vários vetores binários que superexpressam ou silenciam genes de fatores de transcrição de soja.

<table><tbody><tr><td>Acetosiringona</td><td>Cayman</td><td>23224</td><td></td></tr><tr><td>Alvejante</td><td>lavo</td><td>21124</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Biorreagentes Fisher</td><td>195679</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan</td><td>Phytotech</td><td>HYY3251089A</td><td></td></tr><tr><td>Higromicina</td><td>Phytotech</td><td>HHA0397050B</td><td></td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>Fisher 206462</td><td></td><td></td></tr> <tr>química<td>Kanamicina</td><td>Phytotech</td><td>SQS0378007G</td><td></td></tr><tr><td>LB em pó</td><td>Biorreagentes Fisher</td><td>200318</td><td></td></tr><tr><td>MS em pó</td><td>Caisson labs</td><td>2210001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher biorreagentes</td><td>194171</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher químico</td><td>192946</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri</td><td>Fisherbrand</td><td>08-757-11</td><td>100 mm x 25 mm</td></tr><tr><td>Fosfinotricina</td><td>Cedarlane</td><td>P034-250MG</td><td></td></tr><tr><td>REDExtract-N-Amp Kit de PCR</td><td>Sigma</td><td>R4775</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Bioshop</td><td>2D76475</td><td></td></tr><tr><td>Timentin</td><td>Caisson labs</td><td>12222002</td><td></td></tr><tr><td>Vitaminas</td><td>Caisson</td><td>labs 2211010</td><td></td></tr></tbody></table>

transformação de raízes pilosas de soja para análise da função gênica

Soybean Hairy Root Transformation for the Analysis of Gene Function

A soja (Glycine max) é uma cultura valiosa na agricultura que tem milhares de usos industriais. As raízes de soja são o principal sítio de interação com micróbios de solo que formam simbiose para fixar nitrogênio e patógenos, o que torna as pesquisas envolvendo genética de raízes de soja de importância primordial para melhorar sua produção agrícola. A transformação genética de raízes pilosas (HRs) de soja é mediada pela linhagem Agrobacterium rhizogenes NCPPB2659 (K599) e é uma ferramenta eficiente para estudar a função gênica em raízes de soja, levando apenas 2 meses do início ao fim. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado que descreve o método para superexpressar e silenciar um gene de interesse em HRs de soja. Essa metodologia inclui a esterilização de sementes de soja, a infecção de cotilédones com K599 e a seleção e colheita de HRs geneticamente transformados para isolamento de RNA e, se necessário, análises de metabólitos. O rendimento da abordagem é suficiente para estudar simultaneamente vários genes ou redes e pode determinar as estratégias de engenharia ótimas antes de se comprometer com abordagens de transformação estável de longo prazo.

Os resultados representativos são provenientes dos dados publicados19,20. Os resultados da PCR de colônia (cPCR) da K599 transformada Agrobacterium são mostrados na Figura 1. Como indicado pelas colônias positivas na Figura 1, o gene de interesse foi detectado por PCRc (Figura 1A). No entanto, um terço a metade das colônias foram negativas para a pesquisa do gene <e...

Apresentamos um protocolo para a produção de raízes pilosas de soja transgênica de alta eficiência.

Transformação de raízes pilosas de soja para análise da função gênica

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with ...

Nosso método de transformação de raízes pilosas de soja é suficiente para estudar simultaneamente as funções de vários genes ou redes, e pode determinar as estratégias de engenharia ótimas antes de se comprometer com abordagens de transformação estável de longo prazo. A transformação de raízes pilosas da soja é uma ferramenta útil para a análise da função gênica em plantas de soja. As tecnologias atualmente utilizadas incluem edição do genoma CRISPR-Cas9, interferência de RNA, transcriptômica e proteômica e tecnologias de imagem.O grande desafio na era dos modelos de genômica funcional é analisar a função de inúmeros genes. A maioria dos genes é poligênica, sendo alcançada pela interação de muitos genes. Nosso protocolo de raiz peluda facilitará a análise da função gênica com rendimento suficiente, para que as redes poligênicas possam começar a ser compreendidas.Estabelecemos a importância do plasmídeo Ti em cepas de agrobacterium rhizogene. Verificamos que, sem a triagem para o plasmídeo Ti, aumentou o risco de o cotilédones de soja transformado não produzir corantes. Como resultado, a triagem para o plasmídeo tornou-se uma etapa vital antes da transformação.Em comparação com outr

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Bioengineering

Bioengenharia

As análises de expressão do promotor são cruciais para melhorar a compreensão da regulação gênica e a spatiotemporal expressão de genes-alvo. Aqui apresentamos um protocolo para identificar, isolar e clonar um promotor da planta. Além disso, descrevemos a caracterização do promotor nódulo específicos nas raízes peludo feijão comum.

Análise do promotor de planta: Identificação e caracterização de raiz nódulo promotor específico no feijão comum

Desenvolvemos um protocolo simples e eficiente para a preparação de grandes quantidades de protoplastas de soja estudar mecanismos complexos regulatórios e sinalização em células vivas.

Um método simples para o isolamento de aplicativo para análises de expressão de Gene transiente e protoplastas de soja

Descrevemos um método de indução de raízes peludas pela transformação mediada pelo Agrobacterium rhizogenesno trigo-sarraceno tartary(Fagopyrum tataricum). Isso pode ser usado para investigar funções genéticas e produção de metabólitos secundários em trigo sarraceno tartary, ser adotado para qualquer transformação genética, ou usado para outras plantas medicinais após a melhoria.

Indindo Raízes Peludas por Agrobacterium rhizogenes-Transformação Mediada em Trigo-Buck Tartary(Fagopyrum tataricum)

Aqui, apresentamos o protocolo detalhado de um método de transformação em uma etapa mediado por Agrobacterium tumefaciens para produzir plantas compostas.

Um Método Eficiente e Reprodutível para Produção de Compósitos por Transformação de Raízes Pelosas à Base de Agrobacterium rhizogenes

O protocolo descreve indução de raízes pilosas utilizando hastes primárias de inflorescência de Arabidopsis e hipocótilos de Brassica napus . As raízes pilosas podem ser cultivadas e usadas como explantes para regenerar plantas transgênicas.

Transformação e regeneração de raízes pilosas em Arabidopsis thaliana e Brassica napus

Este é um passo-a-passo mostrando o objetivo, funcionamento e resultados representativos do espectrômetro de força gravitacional romance.

Demonstrar os usos do Spectrometer Novel Força Gravitacional para esticar e Medida Proteínas fibrosas

Este artigo fornece um protocolo para o cultivo de mudas de Arabidopsis no RootChip, uma plataforma microfluídica imagem que combina controle automatizado das condições de crescimento com acompanhamento raiz microscópica e FRET baseado em medição de níveis de metabólitos intracelulares.

Time-lapse imagens de fluorescência de crescimento de raiz Arabidopsis com Manipulação acelerada do meio root usando o RootChip

Um protocolo para a análise de nanopartículas de seguimento (NTA) e de alto rendimento de citometria de fluxo para avaliar as nanopartículas poliméricas entrega de genes é descrito. NTA é utilizada para caracterizar a distribuição do tamanho de partícula das nanopartículas e a distribuição de partículas por plasmídeo. De alto rendimento de citometria de fluxo permite a avaliação da eficácia de transfecção quantitativo para uma biblioteca de biomateriais de entrega de genes.

Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

Este protocolo avaliados eléctrico Cell-substrato impedância de detecção, um método para gravar e analisar o espectro de impedância de células aderentes, para a quantificação da ligação da célula, a proliferação, a motilidade, e as respostas celulares a estímulos farmacológicos e tóxicos. Detecção de permeabilidade endotelial e avaliação de célula-célula e célula-substrato contatos são enfatizadas.

Elétrica Cell-substrato impedância Sensing para a quantificação do endotelial Proliferação, Barreira Function, e Motilidade

A interferência de RNA fita dupla (dsRNAi) técnica é empregada para baixo-regular a coenzima A redutase cinamoil milho gene (ZmCCR1) para diminuir o teor de lignina da planta. A lignina sub-regulação da parede da célula é visualizada por meio de análises microscópicas e quantificada pelo método de Klason. São analisadas as mudanças de composição em hemicelulose e celulose cristalina.

A lignina Down-regulação da<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi e Klason Análise lignina

Aprenda a transformação de raízes pilosas de soja para análise da função gênica usando Glycine max. Este método permite estudar múltiplos genes simultaneamente e otimizar estratégias de engenharia antes da transformação estável.

Transformação de raízes pilosas de soja para análise da função gênica

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