Name: Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico em um processador de células automatizado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Aprenda a fabricar células T CAR em sistema fechado semiautomatizado para imunoterapia clínica. Este método oferece flexibilidade, reduz custos e permite personalização do protocolo computadorizado.

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Os autores gostariam de agradecer as contribuições de vários indivíduos e organizações para este trabalho. O Laboratório de Terapia Celular e Gênica e o Laboratório de Estudos Translacionais e Correlativos da Penn forneceram assistência valiosa com o desenvolvimento de processos e preparação para submissões de IND. Melissa Varghese e Amanda DiNofia contribuíram para o processo de desenvolvimento e preparação para as submissões de IND que fundamentam este manuscrito. Este trabalho foi apoiado por uma Bolsa de Aceleração da Terapia Celular e Gênica Colaborativa do Hospital Infantil da Filadélfia. Os autores também gostariam de agradecer à Miltenyi Biotec por seu apoio técnico e de pesquisa. A Figura 1 é coberta pelos direitos autorais © 2023 Miltenyi Biotec B.V. & Co. Todos os direitos reservados.

Processador automatizado para fabricação de células CAR-T em escala clínica

<ol><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+children+and+young+adults+with+B-cell+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Shah, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+anti-CD20%2C+anti-CD19+CAR+T+cells+for+relapsed+B+cell+malignancies%3A+A+phase+1+dose+escalation+and+expansion+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bispecific anti-CD20, anti-CD19 CAR T cells for relapsed B cell malignancies: A phase 1 dose escalation and expansion trial.</a> Nature Medicine. 26 (10), 1569-1575 (2020).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+humanized+CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29-modified+T+cells+in+children+and+young+adults+with+relapsed%2Frefractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficacy of humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells in children and young adults with relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 128 (22), 217(2016).</li>
<li>Mock, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+manufacturing+of+CAR-T+cells+for+adoptive+immunotherapy+using+CliniMACS+Prodigy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Automated manufacturing of CAR-T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy.</a> Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).</li>
<li>Fernández, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP-compliant+manufacturing+of+NKG2D+CAR+memory+T+cells+using+CliniMACS+Prodigy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">GMP-compliant manufacturing of NKG2D CAR memory T cells using CliniMACS Prodigy.</a> Frontiers in Immunology. 10 (10), 2361(2019).</li>
<li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed-system+manufacturing+of+CD19+and+dual-targeted+CD20%2F19+chimeric+antigen+receptor+T+Cells+using+CliniMACS+Prodigy+device+at+an+academic+medical+center%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T Cells using CliniMACS Prodigy device at an academic medical center.</a> Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).</li>
<li>Zhang, W., Jordan, K. R., Schulte, B., Purev, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clinical+grade+CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+produced+using+automated+CliniMACS+prodigy+system%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Design%2C+Development+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of clinical grade CD19 chimeric antigen receptor T cells produced using automated CliniMACS prodigy system.</a> Drug Design, Development and Therapy. 12 (12), 3343-3356 (2018).</li>
<li>Abou-El-Enein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+manufacturing+of+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).</li>
<li>Miltenyi Biotec. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CliniMACS+Prodigy+User+Manual%22">CliniMACS Prodigy User Manual</a>. , https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_h0fd9i4al17q32uhfuf4h7lu25?content-disposition=inline (2021).</li>
<li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+manufacturing+of+non-activated+potent+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).</li>
<li>U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Chemistry%2C+manufacturing%2C+and+control+%28CMC%29+information+for+human+gene+therapy+investigational+new+drug+applications+%28INDs%29+guidance+for+industry%22">Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drug applications (INDs) guidance for industry</a>. , https://www.fda.gov/media/113760/download (2020).</li>
<li>U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Considerations+for+the+development+of+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+products+draft+guidance+for+industry%22">Considerations for the development of chimeric antigen receptor (CAR) T cell products draft guidance for industry</a>. , https://www.fda.gov/media/156896/download (2022).</li>
</ol>

S.K., S.G. e Y.W. receberam apoio de pesquisa da Miltenyi Biotec.

A terapia com células CAR-T tem emergido como uma abordagem de tratamento promissora para células B e outras neoplasias. No entanto, os métodos tradicionais de fabricação de células CAR-T têm várias limitações, como alto custo, produção intensiva em mão-de-obra e etapas abertas que aumentam o risco de contaminação. Recentemente, várias plataformas semi-automatizadas, incluindo o Miltenyi CliniMACS Prodigy (o "processador"), surgiram para resolver essas limitações. O processo de transdução de células T (TCT), integrado ao...

A transferência adotiva de células T projetadas para expressar um receptor de antígeno quimérico (CAR) tem demonstrado notável eficácia no tratamento de pacientes com neoplasias malignas refratárias de células B 1,2,3,4,5. No entanto, os métodos tradicionais de fabricação de células CAR-T são trabalhosos, demorados e exigem técnicos altamente treinados para realizar etapas altamente especializadas. Por exemplo, o processo tradicional de fabricação de um produto autólogo de células CAR-T envolve centrifugação por gradiente de densidade, elutriação ou separação magnética para enriquecer células T, ativação e transdução com um vetor viral em um frasco estéril e expansão em um biorreator antes da colheita e formulação. Vários sistemas têm surgido recentemente que visam automatizar parcialmente esse processo. Por exemplo, o Miltenyi CliniMACS Prodigy (doravante denominado "processador") é um dispositivo de processamento celular automatizado que pode executar muitas dessas etapas de forma automatizada 6,7,8,9. Uma discussão aprofundada dos métodos de fabricação CAR-T tradicionais e automatizados é apresentada em um artigo de revisão recente10.
O processador se baseia na funcionalidade do CliniMACS Plus, um dispositivo médico aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA para o processamento de células progenitoras hematopoiéticas. O processador inclui uma unidade de cultivo de células que permite a lavagem, o fracionamento e o cultivo automatizados de células (Figura 1). O processo de transdução de células T (TCT) é um programa predefinido dentro do dispositivo do processador que replica amplamente a fabricação manual de células CAR-T. O TCT permite o processamento de células personalizáveis usando uma interface gráfica do usuário (a "Matriz de Atividade", Figura 2). Como o processador automatiza muitas etapas e consolida a funcionalidade de vários dispositivos em uma máquina, ele exige menos treinamento e habilidades especializadas de solução de problemas dos tecnólogos. Como todas as etapas são executadas dentro de um conjunto de tubos fechados e de uso único, o processador pode ser operado em instalações com infraestrutura de tratamento de ar menos rigorosa do que seria considerado aceitável para um processo de fabricação aberto. Por exemplo, estamos operando o processador em uma instalação certificada como classe ISO 8 (comparável à classe C da UE).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig01.jpg"> Figura 1: Fabricação de células CAR-T utilizando o sistema de transdução de células T. Mostrado é o processador com o conjunto de tubos instalado. O conjunto de tubos permite conectar outros componentes, como sacos contendo tampão de processamento, meio de cultura e vetor lentiviral via soldagem estéril. Uma vez que o produto de leucaferese é adicionado ao saco de aplicação, ele pode ser rotulado com contas de seleção de células T, passado através da coluna de separação e, em seguida, transferido para o saco de reaplicação. As células selecionadas são então direcionadas para a unidade de cultivo do instrumento para cultura e ativadas com o reagente de ativação (ver Tabela de Materiais). O produto final é coletado no saco de célula alvo. Durante todo o processo, é possível retirar amostras para controle de qualidade de forma asséptica. Números cinzas dentro de círculos representam as válvulas numeradas no processador que direcionam o caminho do líquido através do conjunto de tubos. Reproduzido com permissão de 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig02.jpg"> Figura 2: Matriz de atividades. Após a seleção e ativação da célula T, o restante do processo de fabricação da célula CAR-T é totalmente personalizável. As atividades podem ser adicionadas ou excluídas e agendadas para o dia e hora apropriados, e o volume de cultura após a atividade pode ser especificado (Volume). Por exemplo, a atividade de transdução foi configurada para começar às 10:00 AM no Dia 1, e o volume de cultura no final da atividade foi definido como 100 mL. A Matriz de Atividades pode ser editada durante todo o período de cultivo. O status do processo pode ser monitorado na tela integrada do dispositivo de processamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O objetivo deste manuscrito é fornecer um passo a passo detalhado da fabricação de células CAR-T usando o processador e, adicionalmente, fornecer orientação sobre os testes em processo e de liberação do produto que provavelmente serão exigidos pelos reguladores para aprovar uma aplicação experimental de novo medicamento (IND). O protocolo apresentado permanece próximo da abordagem recomendada pelo fornecedor e é o protocolo subjacente para o IND 28617, que está atualmente sendo avaliado em um ensaio clínico de fase I/II iniciado por um investigador de um único centro. Este estudo tem como objetivo determinar a segurança e eficácia do uso deste processador na fabricação de células CAR-T autólogas CD19-dirigidas humanizadas para pacientes com leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA-B) ou linfoma linfoblástico de linhagem B (L-BLY) [NCT05480449]. O estudo começou em setembro de 2022 e está planejado para inscrever até 89 pacientes com idades entre 0 e 29 anos com LLA-B ou B-Lly. Relatamos alguns resultados de fabricação do ensaio no manuscrito.
Gostaríamos de ressaltar que, embora o manuscrito seja apresentado como um protocolo com etapas a serem seguidas, ele deve ser considerado um ponto de partida para que outros comecem a otimizar seu próprio processo de fabricação de células CAR-T. Uma lista não abrangente de possíveis variações do protocolo apresentado inclui: uso de células T frescas em vez de criopreservadas como material de partida; usar um método diferente de enriquecimento de células T ou omiti-lo completamente; usando diferentes meios e coquetéis de citocinas, como IL7/IL15 em vez de IL2; variar a concentração de soro AB humano ou omiti-la completamente; temporização da transdução; utilizando transduções "multi-hit"; variação da agitação, dos volumes das culturas e do horário de alimentação; utilizando diferentes métodos de transferência genética, incluindo a eletroporação de ácidos nucleicos ou vetores não lentivirais; utilizar outro tampão de formulação final e/ou crioprotetor; e infundir células CAR-T frescas em vez de criopreservando para infusão em um momento posterior. Essas variações podem ter um impacto significativo na composição celular e potência do produto terapêutico.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Etapa geral do processo</td>
			<td>Dia do Processo</td>
			<td colspan="4">Detalhes Técnicos</td>
		</tr><tr><td>Enriquecimento Celular</td>
			<td rowspan="2">Dia 0</td>
			<td colspan="4">Seleção de células T CD4+/CD8+</td>
		</tr><tr><td>Ativação Celular</td>
			<td colspan="4">Semeadura e ativação de cultura de células T</td>
		</tr><tr><td>Transdução de células</td>
			<td>Dia 1</td>
			<td colspan="4">Transdução lentiviral (volume de cultura de 100 mL)</td>
		</tr><tr><td rowspan="12">Expansão Celular (seguida de formulação celular)</td>
			<td>Dia 2</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr><tr><td>Dia 3</td>
			<td colspan="4">Lavagem de Cultura (1 ciclo); Agitador ativado; Volume de cultura aumenta para 200 mL</td>
		</tr><tr><td>Dia 4</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr><tr><td>Dia 5</td>
			<td colspan="4">Ração (50 mL); O volume de cultura atinge o volume final de 250 mL</td>
		</tr><tr><td>Dia 6</td>
			<td colspan="4">Amostra em processo; Troca de mídia (-125 mL / +125 mL)</td>
		</tr><tr><td>Dia 7</td>
			<td colspan="4">Troca de meios (-150 mL / +150 mL) ou Harvest</td>
		</tr><tr><td>Dia 8</td>
			<td colspan="4">Amostra em processo; Troca de meios (-150 mL / +150 mL) ou Harvest</td>
		</tr><tr><td>Dia 9</td>
			<td colspan="4">Troca de meios (-180 mL / +180 mL) ou Harvest</td>
		</tr><tr><td>Dia 10</td>
			<td colspan="4">Amostra em processo; Troca de meios (-180 mL / +180 mL) ou Harvest</td>
		</tr><tr><td>Dia 11</td>
			<td colspan="4">Troca de meios (-180 mL / +180 mL) ou Harvest</td>
		</tr><tr><td>Dia 12</td>
			<td colspan="4">Troca de meios (-180 mL / +180 mL) ou Harvest</td>
		</tr><tr><td>Dia 13</td>
			<td colspan="4">Colheita</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Cronograma e visão geral do processo. Esta tabela resume as etapas do processo de TCT empregadas em um ensaio clínico atual [NCT05480449]. O processo inicia-se com o enriquecimento de células T por seleção CD4+/CD8+, semeadura da cultura e ativação no Dia 0, seguido de transdução no Dia 1. As células descansam por 48 h, seguida de lavagem com cultura, aumento do volume de cultura para 200 mL e agitação com mecanismo de agitação. No dia 6, a primeira amostra em processo é coletada. As células são colhidas quando estão disponíveis células suficientes para pelo menos três doses completas de células CAR-T (5 × 10 6 células CAR-T/kg se o paciente tiver &lt;50 kg, caso contrário, 2,5 × 108 células CAR-T) e testes de controle de qualidade (~2 × 106 células CAR-T); ou quando a cultura atinge um total de 4-5 x 109 células. Abreviações: TCT = transdução de células T; CAR-T = células T do receptor de antígeno quimérico; MACS = classificação de células ativadas por magnetismo.

<table><tbody><tr><td>12 x 75 tubos de borosilicato</td><td>Charles River</td><td>TL1000</td><td></td></tr><tr><td>20 mL Saco de Reagente</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-631</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Cônico de 50 mL</td><td>Fisher</td><td>05-539-10</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Transferência de 150 mL</td><td>Fenwal</td><td>4R2001</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Transferência de 2.000 mL</td><td>Fenwal</td><td>4R2041</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>BDB559925</tr><tr><td>Preparação de Álcool</td><td>Tyco/Saco de Saúde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acesso</td><td>Medline</td><td>2300E-0500</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APC-Vio770 REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-643</td><td></td></tr><tr><td>CD19 CAR Reagente de Detecção Biotina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-129-550</td><td></td></tr><tr><td>CD19 PE</td><td>BD</td><td>555413</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC</td><td>BD</td><td>340440</td><td></td></tr><tr><td>CD4 VioBright FITC REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-229</td><td></td></tr><tr><td>CD45 VioBlue REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-637</td><td></td></tr><tr><td>CD8 APC-Vio770 REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-681</td><td></td></tr><tr><td>Contas de Referência de Celômetro 10um</td><td>Nexcelom</td><td>B10-02-020</td><td></td></tr><tr><td>Contas de Referência de Celômetro 15um</td><td>Nexcelom</td><td>B15-02-010</td><td></td></tr><tr><td>Contas de Referência de Celômetro 5um</td><td>Nexcelom</td><td>B05-02-050</td><td></td></tr><tr><td>Slides de Celômetro</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-002</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS CD4 GMP MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>276-01</td><td>O reagente CD4</td></tr><tr><td>CliniMACS CD8 GMP MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>275-01</td><td>O reagente CD8</td></tr><tr><td>CliniMACS PBS/EDTA Tampão</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-201</td><td>O tampão</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Origen</td><td>CP-10</td><td></td></tr><tr><td>Saco de Congelamento 50 mL</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>200-074-400</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de Congelamento, 1,8 mL</td><td>Nunc</td><td>12565171N</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de Congelamento, 4,5 mL</td><td>Nunc</td><td>12565161N</td><td></td></tr><tr><td>Soro AB Humano</td><td>Vale Biomédico</td><td></td><td>Estéril albumina de soro humano filtrada, inativada calor</td></tr><tr><td>25%</td><td>Grifols</td><td>68516-5216-1</td><td></td></tr><tr><td>albumina de soro humano 5%</td><td>Grifols</td><td>68516-5214-1</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humano de recombinação de MACS PBF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-148</td><td>As citocinas</td></tr><tr><td>MACS GMP T Cell TransAct</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>200-076-202</td><td>o reagente de ativação</td></tr><tr><td>MycoSeq Mycoplasma Kit de Detecção</td><td>Life Technologies</td><td>4460623</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas, Agulhas Hipodérmicas 14G</td><td>Medline</td><td>SWD200573</td><td></td></tr><tr><td>, Pontas de Pipeta SlideSafe 18G</td><td>BD</td><td>B-D305918</td><td></td></tr>, <tr><td>2-200 &mu; L,</td> pontas <td>Eppendorf</td><td>022492209</td><td></td>Pipet embaladas individualmente</tr><tr><td>, 50-1000 &mu; L, embaladas individualmente</td><td>Eppendorf</td><td>022492225</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 10 mL</td><td>Fisher</td><td>13-678-27F</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 25 mL</td><td>Fisher</td><td>13-675-30</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 5 mL</td><td>Fisher</td><td>13-678-27E</td><td></td></tr><tr><td>Plasmalyte-A</td><td>Baxter</td><td>2B2544X</td><td>A solução eletrolítica</td></tr><tr><td>Conjunto de Tubos Prodigy TS520</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076- 600</td><td>O conjunto de tubos</td></tr><tr><td>Sterile Field</td><td>Medline</td><td>NON21001</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin PE-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-793</td><td></td></tr><tr><td>Seringa 1 mL</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Seringa 10 mL</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>Seringa 3 mL</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Seringa 30 mL</td><td>BD 302832</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa 50 mL</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>TexMACS GMP Médio</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-306</td><td>O Adaptador</td></tr> de <tr><td>Amostragem Tripla</td> Média <td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-609</td><td></td></tr><tr><td>Vetor Viral</td><td>CHOP Núcleo de Vetor Clínico</td><td></td><td>huCART19</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Segurança Biológica Armário</td><td>The Baker Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Auto 2000</td><td>Nexcelom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Prodigy</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>200-075-301</td><td>O processador</td></tr><tr><td>Taxa Controlada Freezer</td><td>Planer/Kryosave</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endosafe nexgen-PTS150K</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mettler Balance</td><td>Mettler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Refrigerada</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Refrigerada</td><td>Fisher Sci</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCD Soldador de Tubos Estéreis</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sebra Seladora de Tubos</td><td>Sebra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Varitherm</td><td>Barkey</td><td></td><td>O dispositivo de descongelamento a seco</td></tr><tr><td>XN-330 Analisador de Hematologia</td><td>Sysmex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação de células t do receptor de antígeno quimérico em um processador de células automatizado

Chimeric Antigen Receptor T Cell Manufacturing on an Automated Cell Processor

As células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) representam uma abordagem imunoterapêutica promissora para o tratamento de várias doenças malignas e não malignas. As células CAR-T são células T geneticamente modificadas que expressam uma proteína quimérica que reconhece e se liga a um alvo de superfície celular, resultando na morte da célula-alvo. Os métodos tradicionais de fabricação de células CAR-T são trabalhosos, caros e podem trazer o risco de contaminação. O CliniMACS Prodigy, um processador de células automatizado, permite a fabricação de produtos de terapia celular em escala clínica em um sistema fechado, minimizando o risco de contaminação. O processamento ocorre de forma semiautomática sob o controle de um computador e, assim, minimiza o envolvimento humano no processo, o que economiza tempo e reduz a variabilidade e os erros.
Este manuscrito e vídeo descrevem o processo de transdução de células T (TCT) para a fabricação de células CAR-T usando este processador. O processo de TCT envolve enriquecimento, ativação, transdução de células T CD4+/CD8+ com vetor viral, expansão e colheita. Usando a Matriz de Atividades, uma funcionalidade que permite ordenar e cronometrar essas etapas, o processo de TCT pode ser personalizado extensivamente. Fornecemos um passo a passo da fabricação de células CAR-T em conformidade com as Boas Práticas de Fabricação atuais (cGMP) e discutimos os testes de liberação necessários e os experimentos pré-clínicos que darão suporte a uma aplicação de Novo Medicamento Investigacional (IND). Demonstramos a viabilidade e discutimos as vantagens e desvantagens do uso de um processo semiautomático para a fabricação clínica de células CAR-T. Finalmente, descrevemos um ensaio clínico em andamento iniciado por pesquisadores que tem como alvo malignidades pediátricas de células B [NCT05480449] como um exemplo de como esse processo de fabricação pode ser aplicado em um ambiente clínico.

Os resultados das três primeiras séries de fabricação do CAR-T do ensaio NCT05480449 são apresentados a seguir na Tabela 3. O material de partida, o vetor, as citocinas de cultura e as concentrações séricas de AB foram mantidos consistentes para cada corrida. Os produtos foram colhidos no 7º ou 8º dia. O crescimento celular médio diário foi de 46% (aumento na contagem total de células), indicando que o processo de TCT foi efetivo em promover a expansão celular. Estes resultados sugerem que o processador ...

Este artigo detalha o processo de fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico para uso clínico, especificamente usando um processador de células automatizado capaz de realizar transdução viral e cultivo de células T. Fornecemos recomendações e descrevemos armadilhas que devem ser consideradas durante o processo de desenvolvimento e implementação de um ensaio clínico de fase inicial.

Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico em um processador de células automatizado

Chimeric antigen receptor (CAR)-T cells represent a promising immunotherapeutic approach for the treatment of various malignant and non-malignant ...

A vantagem do nosso protocolo é que ele é um sistema semi-automatizado, fechado e que ainda oferece flexibilidade. As etapas trabalhosas são substituídas pela automação, que é executada por um computador e, como é executada por um computador, o usuário pode personalizar seu protocolo. Isso também é feito em sistema fechado.Descobrimos que o tipo de laboratórios de células-tronco que estão comumente presentes em hospitais têm a capacidade de produzir células CAR-T de grau clínico a um custo significativamente menor do que as alternativas comerciais. Pensamos que nosso processo poderia ser facilmente adaptado para tornar as células CAR-T específicas para outros alvos, e também para fabricar outros tipos de terapias celulares e gênicas. Nossa equipe está pronta para explorar outros alvos de células CAR-T e novas terapias gênicas.Em uma escala mais ampla, as terapias celulares e gênicas estão se expandindo rapidamente, e estamos entusiasmados em continuar a apoiar e inovar neste campo empolgante.

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Este vídeo demonstra uma técnica para fabricar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) ex vivo. As células T humanas são incubadas com esferas magnéticas revestidas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, juntamente com um meio suplementado com interleucina-2 (IL-2), levando à ativação e proliferação de células T. Vetores lentivirais transgênicos são introduzidos, permitindo que o RNA transgênico se integre ao genoma do hospedeiro e expresse o transgene. Isso resulta nas células T...

Uma técnica ex vivo para fabricar células T receptoras de antígeno quimérico

O objetivo deste protocolo é fabricar células T de grau clínico específicas para patógenos usando um dispositivo de enriquecimento celular de segunda geração automatizado de bancada que incorpora um sistema fechado de captura de citocinas e não requer equipe dedicada ou uso de uma instalação GMP. As células T específicas do citomegalovírus pp65 geradas podem ser administradas diretamente aos pacientes.

As células T de enriquecimento de células automatizado de citomegalovírus específico-para aplicações clínicas usando o Sistema de captura de citocinas

Descrevemos um sistema quantitativo de ensaio de citolíse in vitro em tempo real para avaliar a potência das células T do receptor de antígeno quimérico que visam células tumorais líquidas e sólidas. Este protocolo pode ser estendido para avaliar outras células efetores imunes, bem como tratamentos combinados.

Um ensaio de potência em tempo real para células T do receptor de antígeno quimérico visando células cancerosas sólidas e hematológicas

Descrevemos uma abordagem para gerar de forma confiável células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e testar sua diferenciação e função in vitro e in vivo.

Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) para imunoterapia adotiva

Este protocolo descreve o processo de transdução de células T humanas primárias com um gene de interesse, garantindo a compatibilidade com as normas de Boas Práticas de Fabricação (BPF).

Um procedimento compatível com GMP para a geração de células T modificadas por genes

Esse protocolo agiliza a produção de vetores retrovirais e a transdução de células T murinas, facilitando a geração eficiente de células CAR-T em camundongos.

Geração Eficiente de Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Murino (CAR)-T

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho simplificado para gerar e testar células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Geração de células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano

Este protocolo descreve as etapas essenciais para o cultivo das células T primárias, incluindo seu isolamento, ativação, expansão e transfecção transitória por eletroporação de mRNA. Além disso, é proposto um fluxo de trabalho e um painel de anticorpos para análise citométrica de fluxo do fenótipo, marcadores de ativação, viabilidade e expressão do receptor de antígeno quimérico (CAR).

Isolamento, cultivo e transfecção transitória de células T humanas primárias para gerar células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR)

A alta taxa de transferência de plataforma, desenvolvimento, fabricação automatizada de células da linha para a produção de proteínas terapêuticas é descrito. Implementação de BD Sorter celular FACS Aria, CloneSelect Imager e TECAN Freedom EVO sistema de manipulação de líquidos tem demonstrado capacidade de processamento aumentou significativamente no desenvolvimento de linhagem de células com melhor qualidade de células de linha e alta reprodutibilidade.

Uma plataforma de alta capacidade automatizada para o Desenvolvimento de linhagens celulares para a fabricação de proteínas Therapeutics

Este protocolo permite uma para identificar factores que modulam a massa de células funcional de beta para encontrar potenciais alvos terapêuticos para o tratamento da diabetes. O protocolo é constituído por um método simplificado para avaliar a replicação de ilhotas e função das células beta em ilhéus isolados de ratos após a manipulação da expressão do gene com adenovírus.

Avaliação de replicação e função das células beta no Adenovirally transduzidas isoladas ilhotas de roedores

Aprenda a fabricar células T CAR em sistema fechado semiautomatizado para imunoterapia clínica. Este método oferece flexibilidade, reduz custos e permite personalização do protocolo computadorizado.

Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico em um processador de células automatizado

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