Name: Janela estabilizada para imagem intravital do pâncreas murino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Aprenda a técnica SWIP para imagem intravital de alta resolução do pâncreas murino, permitindo estudos longitudinais de adenocarcinoma e pancreatite. Este método estabiliza o tecido para visualização subcelular in vivo.

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A Evelyn Lipper Charitable Foundation, o Gruss-Lipper Biophotonics Center, o Integrated Imaging Program for Cancer Research, uma bolsa NIH T-32 (CA200561) e um programa de pesquisa de câncer pancreático do Departamento de Defesa (PCARP) concedem PA210223P1.

Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos para o uso de animais vertebrados, incluindo a aprovação prévia pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina Albert Einstein (IACUC).
1. Passivação de janelas
NOTA: A passivação do aço inoxidável limpa o metal de contaminantes e cria uma fina camada de óxido que aumenta muito a biocompatibilidade do metal com os tecidos moles, mesmo além do titânio16.
<ol><li>Inicie o processo de passivação lavando as esquadrias ópticas com uma solução de detergente enzimaticamente ativa a 1% (p/v).</li>
	<li>Submergir as armações em uma solução de hidróxido de sódio a 5% (p/v) a 70 °C por 30 min dentro de um frasco de vidro.</li>
	<li>Retire as armações e enxágue-as com água deionizada.</li>
	<li>Mergulhe as armações em uma solução de ácido cítrico a 7% (p/v) a 55 °C por 10 min dentro de um novo frasco de vidro.</li>
	<li>Retire as armações e enxágue-as com água deionizada novamente.</li>
	<li>Repita o passo 1.2 e, finalmente, lave as esquadrias das janelas com água deionizada uma última vez.</li>
</ol>2. Preparo para implante de tumor ou cirurgia de janela
NOTA: Para estudos de tumores pancreáticos, as células tumorais devem ser implantadas e permitir que cresçam em tumores evidentes. Para visualizar as células tumorais in vivo, recomenda-se o uso de células geneticamente alteradas para expressar proteínas fluorescentes, como a Dendra2. O uso de rótulos de proteínas fluorescentes brilhantes atenuará possíveis problemas com a autofluorescência tecidual. Outras potenciais proteínas fluorescentes, corantes e modelos de camundongos fluorescentes codificados geneticamente que podem ser utilizados têm sido discutidos em outros estudos17,18. Para evitar a contaminação do campo operatório, realize o procedimento cirúrgico em uma capela ou gabinete de fluxo laminar e garanta que áreas distintas sejam usadas para preparação, cirurgia e recuperação.
<ol><li>Antes da cirurgia, esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos em autoclave e, se necessário, usar um esterilizador de esferas quentes para procedimentos subsequentes. Certifique-se de que a cirurgia emprega uma técnica apenas de pontas.</li>
	<li>Ligue a almofada cirúrgica aquecida e o esterilizador de contas e aguarde que atinja a temperatura de operação adequada. A temperatura da almofada de aquecimento deve ser monitorada com um termômetro de superfície para evitar possíveis queimaduras. Coloque um pano estéril sobre a almofada de aquecimento se a temperatura não puder ser adequadamente controlada. NOTA: A temperatura corporal durante procedimentos curtos (≤20 min), como tumor e implante de janela, é minimamente afetada durante o uso de um coxim cirúrgico aquecido. No entanto, períodos mais longos de anestesia, como durante imagens de lapso de tempo prolongado, exigem que o mouse seja colocado em uma câmara aquecida para manter a temperatura corporal.</li>
	<li>Anestesiar o camundongo com isoflurano a 5% em câmara de anestesia.</li>
	<li>Passo crítico: Abaixe a anestesia para 2% quando o rato estiver inconsciente. Monitorar cuidadosamente o nível de anestesia e os sinais vitais do mouse (por exemplo, usando um oxímetro de pulso)19.</li>
	<li>Coloque uma pequena gota de lubrificante ocular em cada olho do rato para evitar o ressecamento da córnea.</li>
	<li>Antes da cirurgia, aplique creme depilatório generosamente no abdome superior esquerdo para remover os pelos. Após 20 s, use papel higiênico umedecido para limpar firmemente o cabelo e creme depilatório. Repita o processo conforme necessário até que todos os cabelos sejam removidos da área cirúrgica.</li>
	<li>Injetar 10 μL de buprenorfina (0,1 mg/kg) diluídos em 90 μL de PBS por via subcutânea para garantir analgesia pré-operatória.</li>
</ol>3. Implante de tumor de pâncreas
<ol><li>Preparar alíquotas de células tumorais na concentração desejada (com base no tempo de duplicação de células tumorais). Coloque a suspensão celular em uma seringa de insulina e mantenha-a no gelo. Para seguir esse protocolo, utilizar10 6 células tumorais KPC singênicas 20 suspensas em no máximo 50 μL de PBS, seguindo o protocolo de injeção ortotópica adaptado de Erstad etal.21 NOTA: Esta linhagem celular injetada nesta concentração produziu rotineiramente tumores palpáveis ou apropriadamente grandes por 10-14 dias. Subclones dessa linhagem celular e de outras linhagens de células pancreáticas precisariam ser avaliados quanto a concentrações e prazos apropriados para produzir tumores de tamanho adequado).</li>
	<li>Lave as mãos usando sabão antisséptico.</li>
	<li>Antes de cada nova cirurgia, coloque novas luvas estéreis.</li>
	<li>Transfira o mouse para o capuz cirúrgico estéril e coloque-o em decúbito lateral parcial direito.</li>
	<li>Fixe os membros com fita adesiva de papel. NOTA: O uso adequado dos instrumentos é importante durante todo o procedimento. Exemplos de como segurar pinças, tesouras Castroviejo e a ferramenta de captação a vácuo são mostrados na Figura 2A-C.</li>
	<li>Esterilizar o abdome com antisséptico (Figura 2D).</li>
	<li>Certifique-se de que o animal está totalmente anestesiado realizando um teste de pinça dos dedos.</li>
	<li>Realizar incisão subcostal esquerda de 10 a 15 mm na pele com pinça e tesoura de Castroviejo (Figura 2E).</li>
	<li>Controle a hemostasia com cotonetes ou cautério quando/quando necessário.</li>
	<li>Divida cuidadosamente o músculo subjacente com pinça e tesoura de Castroviejo para entrar no peritônio (Figura 2F).</li>
	<li>Usando cotonetes estéreis, exteriorizar atraumaticamente o pâncreas e o baço.</li>
	<li>Jogue o pâncreas para fora para que não haja dobras (Figura 2G).</li>
	<li>Identificar o local de injeção do tumor desejado no corpo ou cauda do pâncreas (longe dos vasos sanguíneos).</li>
	<li>Passo crítico: Após o posicionamento cuidadoso do pâncreas, utilizar pinça para dar tensão ao tecido e inserir a ponta da seringa de insulina, com o bisel voltado para cima, no local desejado do pâncreas a uma profundidade de 4-5 mm (Figura 2H).</li>
	<li>Injete lentamente a solução de células tumorais. Procure uma pequena bolha que confirme o sucesso da injeção (Figura 2I).</li>
	<li>Retornar cuidadosamente o pâncreas para o abdome sem perturbar a bolha de injeção de células tumorais (Figura 2J).</li>
	<li>Com fio absorvível de polidioxanona 5-0, fechar-se primeiro a camada muscular e, em seguida, a pele com pontos interrompidos (Figura 2K-N).</li>
	<li>Cubra a incisão com cola de cianoacrilato (Figura 2O) e, em seguida, devolva o rato a uma gaiola limpa sob uma lâmpada de aquecimento para recuperação. Administrar antibióticos em água potável para prevenir a infecção. Monitore os ratos e permita que eles se recuperem completamente da cirurgia. NOTA: Os antibióticos são administrados conforme exigido pelo protocolo da IACUC. Todos os animais são alojados individualmente.</li>
	<li>Deixe o tumor se desenvolver por 10-14 dias até que seja palpável através da parede abdominal.</li>
</ol>4. Cirurgia da janela do pâncreas
<ol><li>Quando os animais estiverem prontos para exames de imagem, inicie a cirurgia de implante de janela. Para começar, lave as mãos com sabão antisséptico.</li>
	<li>Antes de cada nova cirurgia, coloque luvas estéreis frescas.</li>
	<li>No banco cirúrgico aquecido, colocar o mouse em decúbito lateral direito para expor o abdome esquerdo.</li>
	<li>Ancorar os membros anteriores e posteriores do mouse ao estágio cirúrgico aquecido cranial e caudalmente usando fita adesiva de papel. Verifique se o baço (abaixo da pele) é visível dentro do campo cirúrgico (Figura 3A).</li>
	<li>Para manter a esterilidade, desembale todos os instrumentos cirúrgicos no capô.</li>
	<li>Desinfete o local cirúrgico esfregando a pele do rato com uma generosa aplicação de antisséptico.</li>
	<li>Certifique-se de que o animal está totalmente anestesiado realizando um teste de pinça dos dedos.</li>
	<li>Passo crítico: Levantar a pele do quadrante superior esquerdo do abdome com pinça e fazer uma incisão circular de ~10 mm na pele e musculatura com tesoura de Castroviejo (Figura 3B,C).</li>
	<li>Controle o sangramento e mantenha a hemostasia usando cotonetes ou cautério, quando necessário.</li>
	<li>Localize o pâncreas, que está preso ao baço, e identifique a direção em que o pâncreas está deitado dentro da incisão para decidir onde o ponto cruzado de suporte deve ser colocado.</li>
	<li>Usando sutura de seda 5-0, coloque o primeiro ponto no local desejado na camada muscular. Empate este final com 3-5 nós. (Figura 3D,E)</li>
	<li>Continue a costurar diretamente através da incisão. Corte e deixe uma cauda de ~5 cm (Figura 3F).</li>
	<li>Repetir os passos 4.11 e 4.12 perpendicularmente ao primeiro ponto (Figura 3G,H).</li>
	<li>Passo crítico: Levante e posicione suavemente o pâncreas sobre o ponto cruzado (Figura 3I,J). Tome cuidado para não danificar o pâncreas durante a manipulação.</li>
	<li>Passo crítico: Com fio de seda 5-0, realizar um ponto bolsa-corda a ~1 mm do orifício, circunferencialmente, entrelaçando a pele e a camada muscular (Figura 3K).</li>
	<li>Posicione a moldura da janela de modo que as bordas da incisão circular fiquem assentadas dentro do sulco da janela (Figura 3L).</li>
	<li>Aperte a janela implantada amarrando firmemente a seda 5-0.</li>
	<li>Carregar 100 μL de adesivo líquido de cianoacrilato na seringa de 1 mL.</li>
	<li>Seque o tecido aplicando um fluxo delicado de ar comprimido por ~10 s.</li>
	<li>Aperte a moldura da janela por sua borda externa com pinça e levante-a suavemente para garantir a separação do pâncreas da superfície inferior da moldura da janela.</li>
	<li>Etapa crítica: Dispensar uma fina camada de adesivo líquido de cianoacrilato ao longo do recesso da janela (Figura 3M). Certifique-se de não obter nenhum do adesivo no tecido do pâncreas.</li>
	<li>Usando captadores a vácuo, levante a tampa de 5 mm.</li>
	<li>Coloque cuidadosamente a tampa dentro do recesso no centro da moldura da janela óptica. Segure com leve pressão, permitindo que o adesivo de cianoacrilato se ajuste (~25 s).</li>
	<li>Separe a tampa dos captadores a vácuo usando pinças.</li>
	<li>Apertar as suturas de ponto cruzado para fixar o pâncreas confortavelmente à lamínula (Figura 3N,O). Nota: Não aperte demais o ponto cruz, pois pode causar danos e isquemia ao pâncreas.</li>
	<li>Corte as extremidades da sutura.</li>
	<li>Retire a fita do mouse.</li>
	<li>Desligue o vaporizador de isoflurano.</li>
	<li>Deslocar o rato para uma gaiola limpa ou diretamente para o microscópio intravital.</li>
	<li>Alojar os animais individualmente após a cirurgia de janela e monitorá-los até a recuperação completa.</li>
	<li>As imagens são então realizadas em microscópio multifóton bilaser, como descrito anteriormente 22,23,24 Para longas sessões de imagem, o camundongo é colocado em uma câmara aquecida para manter a temperatura corporal e fornecido com fluidos de suporte de acordo com os padrões da IACUC.</li>
</ol>5. Tratamento com Ceruleína para a indução de pancreatite
<ol><li>Para investigar o início da pancreatite, tratar camundongos saudáveis com cerúleina após a implantação do SWIP. Certifique-se de que os ratos estão em jejum durante 14-18 h e recebem água ad libitum antes da administração de ceruleína.</li>
	<li>Injetar 50 μg/kg de ceruleína em 100 μL de 1x DPBS estéril por via intraperitoneal a intervalos de 1 h para até oito injeções. Administrar um volume equivalente de 1x DPBS isoladamente, injetado intraperitonealmente, aos camundongos controle.</li>
	<li>Após a aquisição de imagem, sacrificar os camundongos 24 h após a primeira injeção por deslocamento cervical de acordo com os padrões da IACUC.</li>
	<li>Realizar exames de imagem em microscópio multifóton bilaser conforme descrito anteriormente22,23,24. Para longas sessões de imagem, coloque o mouse em uma câmara aquecida para manter a temperatura corporal e fornecer-lhe fluidos de suporte de acordo com os padrões da IACUC.</li>
</ol>

Imagem pancreática murina usando janela estabilizada implantada

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<li>Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+microcartography+and+subcellular+imaging+of+tumor+angiogenesis%3A+a+novel+platform+for+translational+angiogenesis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research.</a> Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).</li>
<li>Shanja-Grabarz, X., Coste, A., Entenberg, D., Di Cristofano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time%2C+high-resolution+imaging+of+tumor+cells+in+genetically+engineered+and+orthotopic+models+of+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">Real-time, high-resolution imaging of tumor cells in genetically engineered and orthotopic models of thyroid cancer.</a> Endocrine-Related Cancer. 27 (10), 529-539 (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

O protocolo SWIP descrito aqui fornece um método aprimorado de estabilização do tecido pancreático utilizando uma técnica de cesto de ponto cruzado. As janelas de imagem abdominais precoces (AIWs) permitiram imagens intravitais (IVI) de órgãos internos do abdome, mas não limitaram adequadamente o movimento de tecidos moles, como o pâncreas. Em resposta, Park e col. desenvolveram uma janela de imagem do pâncreas (PIW) que incorpora uma prateleira metálica horizontal e permite uma melhor estabilização do tecido pancreático...

As doenças pancreáticas benignas e malignas são potencialmente fatais, com lacunas consideráveis no entendimento de sua fisiopatologia. A pancreatite, inflamação do pâncreas, é a terceira maior causa de internações e readmissões hospitalares relacionadas a doenças gastrointestinais nos EUA e está associada a substancial morbidade, mortalidade e carga socioeconômica1. Classificado como a terceira causa de morte relacionada aocâncer2, o adenocarcinoma ductal do pâncreas (ADP) é responsável pela maioria das neoplasias malignas pancreáticas3 e prenuncia uma baixa taxa de sobrevida em 5 anos de apenas 11%2. A principal causa de mortalidade relacionada ao câncer no ADP é a sobrecarga metastática. Infelizmente, a maioria dos pacientes apresenta doença metastática. Portanto, compreender a dinâmica das metástases no ADP é uma necessidade crítica não atendida no campo da pesquisa em câncer.
Os mecanismos subjacentes à inflamação e à cascata metastática do pâncreas são pouco compreendidos. Um dos principais contribuintes para essa lacuna no conhecimento é a incapacidade de observar a dinâmica celular pancreática in vivo. A observação direta dessas dinâmicas celulares promete desvendar alvos críticos para alavancar e melhorar o diagnóstico e o tratamento de pessoas com doença pancreática.
A imagem intravital (IVI) é uma técnica de microscopia que permite aos pesquisadores visualizar e estudar processos biológicos em animais vivos em tempo real. O IVI permite a visualização direta e de alta resolução da dinâmica intracelular e microambiental in vivo e dentro do ambiente nativo do processo biológico em questão. Portanto, a IVI permite a observação in vivo de processos patológicos e saudáveis.
As modalidades contemporâneas de imagem de corpo inteiro, como RM, PET e TC, oferecem excelentes visões de órgãos inteiros e podem revelar patologias, mesmo antes do início dos sintomasclínicos4. Eles são incapazes, no entanto, de atingir resolução de célula única ou revelar os estágios iniciais da doença-pancreatite ou malignidade.
Pesquisas anteriores utilizaram IVI de resolução unicelular para observar doenças benignas e malignas de tumores cutâneos5,6, mama7, pulmão8, fígado9, cérebro 10 epâncreas11, levando a insights sobre mecanismos de progressão da doença12. No entanto, o pâncreas murino apresenta obstáculos significativos para alcançar a resolução unicelular usando IVI, principalmente devido à sua localização visceral profunda e alta complacência. Além disso, é um órgão ramificado e difusamente distribuído dentro do mesentério que se conecta ao baço, intestino delgado e estômago, dificultando o acesso. O tecido também é altamente sensível ao movimento causado pelo peristaltismo adjacente e pela respiração. A minimização do movimento do pâncreas é essencial para a microscopia de resolução unicelular, pois artefatos de movimento de até alguns mícrons podem borrar e distorcer as imagens, impossibilitando o rastreamento da dinâmica de células individuais13.
Para a realização da IVI, uma janela de imagem abdominal (AIW) deve ser implantada cirurgicamente 9,11. Para implantar o AIW cirurgicamente, uma moldura de janela metálica é suturada na parede abdominal. Em seguida, o órgão de interesse é fixado ao quadro com adesivo de cianoacrilato. Embora isso seja suficiente para alguns órgãos internos rígidos (por exemplo, fígado, baço, tumores rígidos), as tentativas de obtenção de imagens do pâncreas murino saudável são comprometidas pela estabilidade lateral e axial subótima, devido à textura compatível e à arquitetura complexa do tecido14. Para resolver essa limitação, Park et al.14 desenvolveram uma janela de imagem projetada especificamente para o pâncreas saudável. Esta Janela de Imagem do Pâncreas (PIW) minimiza a influência do movimento intestinal e da respiração, incorporando uma prateleira metálica horizontal dentro da moldura da janela, logo abaixo da lamínula, estabilizando o tecido e mantendo seu contato com o vidro da tampa. Embora o PIP ofereça maior estabilidade lateral, observamos que essa janela ainda demonstra desvio axial e, adicionalmente, impede a obtenção de imagens de grandes tumores sólidos devido ao estreito espaço entre a plataforma metálica e o lamínulo15.
Para resolver essas limitações, desenvolvemos o Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP), uma janela de imagem implantável capaz de obter imagens estáveis a longo prazo do pâncreas saudável e doente (Figura 1)15. Aqui, fornecemos um protocolo abrangente para o procedimento cirúrgico usado para implantar o SWIP. Embora o objetivo primário tenha sido estudar os mecanismos dinâmicos envolvidos na metástase, este método também pode ser utilizado para explorar vários aspectos da biologia e patologia do pâncreas.

<table><tbody><tr><td>Solução de 1% (p/v) de detergente ativo enzimático</td><td>Alconox</td><td>Inc NA</td><td>Detergente aniônico concentrado com enzimas protease para limpeza manual e ultrassônica</td></tr><tr><td>Solução de 5% (p/v) de hidróxido de sódio</td><td>Reagente de passivação</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td></tr><tr><td>5 mm de vidro</td><td>de cobertura Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>72296-05</td><td>Lamínulas de Vidro Redondas&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução a 7% (p/v) de ácido cítrico</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>251275</td><td>Reagente de passivação</td></tr><tr><td>28G 1 mL BD Seringa de insulina</td><td>BD</td><td>329410</td><td>Seringa para injeção celular</td></tr><tr><td>Baytril 100 (enrofloxacina)</td> <td>Bayer (Santa Cruz Biotechnology)</td> <td>sc-362890Rx</td><td>Antibiótico</td></tr><tr><td>Lâmpada de calor de montagem em bancada</td><td>McMaster-Carr</td><td>3349K51</td><td>Lâmpada de calor</td></tr><tr><td>Buprenorfina 0,3 mg / mL</td><td>Covetrus América do Norte</td><td>059122</td><td>Buprenorfina Tesoura Curva de Analgesia</td></tr><tr><td>Castroviejo</td><td>World Precision Instruments</td><td>WP2220</td><td>Tesoura para cortar tecido</td></tr><tr><td>C57BL/6J Mouse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664&nbsp;</td><td>Rato C57BL/6J</td></tr><tr><td>Solução de clorexidina</td><td>Durvet</td><td>7-45801-10258-3</td><td>Solução desinfetante de clorexidina</td></tr><tr><td>Recipiente de ar comprimido</td><td>Falcon</td><td>DPSJB-12</td><td>Ar comprimido para secagem de tecido</td></tr><tr><td>Acrilato de ciano - Gel Superglue</td><td>Staples</td><td>234790-6</td><td>Cola para a pele</td></tr><tr><td>Acrilato de ciano - Grampos de supercola líquida</td><td></td><td>LOC1647358</td><td>Cola de lamínula</td></tr><tr><td>DPBS 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>DPBS para injeções de ceruleína/células</td></tr><tr><td>Kit de Cauterização Gemini</td><td>Caneta de Cauterização 726067 Aparelho Harvard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Germinador 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER&nbsp; 5287-120V</td><td>Esterilizador de Contas</td></tr><tr><td>Graefe Micro Dissecante Fórceps; Serrilhada; Ligeira curva; Largura da ponta de 0,8 mm; 4" Comprimento</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5135&nbsp;</td><td>Pinça de Micro Dissecação Graefe</td></tr><tr><td>Microscópio de imagem</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Ver Entenberg et al. 2011 [27]</td></tr><tr><td>Software de imagem</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Ver Entenberg et al. 2011 [27]</td></tr><tr><td>Isoethesia (isoflurano)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50033</td><td>Isoflurano Anestesia</td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&nbsp;</td><td>Lenços umedecidos Kim</td></tr><tr><td>Fita de laboratório</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dissecação de mouse</td> de fita de laboratório <td>World Precision Instruments</td><td>MOUSEKIT</td><td>Instrumentos cirúrgicos</td></tr><tr><td>Sensor de oxímetro de pulso de pata de rato</td><td>Kent Scientific Corpo</td><td>MSTAT Sensor-MSE</td><td>Oxímetro de pulso</td></tr><tr><td>Mouse Surgisuite</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-M04</td><td>Plataforma aquecida</td></tr><tr><td>Nair Depilação Loção</td><td>Amazon</td><td>B001RVMR7K</td><td>Loção Depilatória</td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>TechAir</td><td>OX TM</td><td>Oxygen</td></tr><tr><td>PERMA-HAND Suturas de Seda Trançadas Pretas, ETHICON Tamanho 5-0</td><td>VWR</td><td>95056-872</td><td>Sutura de Seda</td></tr><tr><td>Tamponada com Solução Salina 1x</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Sistema PhysioSuite</td> Kent <td>Scientific</td><td>PhysioSuite</td><td>Plataforma Aquecida Controlador</td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>008897</td><td>Eye Lubricant</td></tr><tr><td>Puritan Nonsterile Cotton Tipped Swabs&nbsp;</td><td>Cotonetes de Algodão</td> <td>Fisher Scientific</td><td>867WCNOGLUE</td></tr><tr><td>SHARP Precision Barrier Tips, Para P-100, 100 &micro; L</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P1125</td><td>100 &micro; L Pontas de Pipeta</td></tr><tr><td>Isotiocianato de Tetrametilrodamina&ndash; Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1287-500MG</td><td>Etiqueta Vascular</td></tr><tr><td>Placa de fixação</td><td>de janela NA</td><td>NA</td><td>Placa feita à medida para colocação de janela na platina do microscópio. A placa é feita de 0,008 em calço de aço inoxidável. Para as dimensões da placa, consulte Entenberg et al., 2018 [8].</td></tr><tr><td>Caixilharia NA</td><td></td><td>NA</td><td>A janela é composta por uma estrutura de aço com uma abertura central que aceita uma lamínula de 5 mm. Uma ranhura de 1,75 mm ao redor da circunferência da armação fornece espaço para a aderência do músculo peritoneal e das camadas da pele. Ver Entenberg et al., 2018 [8].</td></tr></tbody></table>

janela estabilizada para imagem intravital do pâncreas murino

Stabilized Window for Intravital Imaging of the Murine Pancreas

A fisiologia e fisiopatologia do pâncreas são complexas. Doenças do pâncreas, como pancreatite e adenocarcinoma pancreático (ADP), apresentam alta morbidade e mortalidade. A imagem intravital (IVI) é uma técnica poderosa que permite a obtenção de imagens de alta resolução de tecidos em estados saudáveis e doentes, permitindo a observação em tempo real da dinâmica celular. A IVI do pâncreas murino apresenta desafios significativos devido à natureza visceral profunda e complacente do órgão, o que o torna altamente propenso a danos e artefatos de movimento. 
Descreve-se aqui o processo de implantação do Stabilizado Window para Intravital imageamento do pâncreas Pmurino (SWIP). O SWIP permite IVI do pâncreas murino em estados normais saudáveis, durante a transformação do pâncreas saudável para pancreatite aguda induzida por ceruleína, e em estados malignos, como tumores pancreáticos. Em conjunto com células geneticamente marcadas ou a administração de corantes fluorescentes, o SWIP permite a medição da dinâmica de célula única e subcelular (incluindo migração de célula única e coletiva), bem como imagens seriadas da mesma região de interesse durante vários dias. 
A capacidade de capturar a migração de células tumorais é de particular importância, pois a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer no ADP é a carga metastática esmagadora. A compreensão da dinâmica fisiológica das metástases no ADP é uma necessidade crítica não atendida e crucial para melhorar o prognóstico dos pacientes. Em geral, o SWIP fornece melhor estabilidade de imagem e expande a aplicação de IVI no pâncreas saudável e doenças malignas do pâncreas.

A Figura 1, adaptada de Du et al.15, mostra imagens de um filme de IVI com lapso de tempo do pâncreas murino. Alguma movimentação tecidual pode ser observada dentro do período inicial de sedimentação (primeira hora de exame, Figura 1A). No entanto, com a continuidade dos exames de imagem após esse período de sedimentação (&gt;75 min), observamos um aumento da estabilidade lateral e axial (Figura 1B). A compar...

Apresentamos um protocolo para o implante cirúrgico de uma janela óptica de demora estabilizada para imagens de resolução subcelular do pâncreas murino, permitindo estudos seriados e longitudinais do pâncreas sadio e doente.

Janela estabilizada para imagem intravital do pâncreas murino

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have ...

Empregando imagens intravitais de alta resolução e um método aprimorado de estabilização do pâncreas, pretendemos melhorar a compreensão da dinâmica fisiológica do adenocarcinoma pancreático, pancreatite e pâncreas saudável. Essa abordagem possibilita abordar lacunas no entendimento fisiopatológico, potencialmente avançando estratégias de tratamento para essas condições de alto risco. A imagem intravital com resolução de célula única tem iluminado a fisiologia e os mecanismos de progressão da doença em vários tecidos.No entanto, o pâncreas apresenta desafios únicos devido à sua localização profunda, complacência e suscetibilidade a artefatos de movimento, dificultando o acesso efetivo para observação tanto para condições benignas quanto malignas. Nossa técnica SWIP melhora a estabilização do pâncreas murino em comparação com janelas de imagem abdominais anteriores. O quadro de design exclusivo apresenta linhas gravadas para o uso de microcartografia, o que permite a relocalização consistente da região em várias sessões de imagem.Isso facilita a medição da dinâmica subcelular ao longo de dias, fornecendo insights valiosos. O protocolo SWIP permite imagens intravitais estáveis, de alta resolução e de célula única do pâncreas murino em estados normais e doentes. É especialmente benéfico para imagens 3D e 4D prolongadas, oferecendo insights sobre interações celulares e mecanismos de doenças.Valiosa para desvendar a fisiologia e patologia pancreática, esta técnica visualiza células únicas e seu contexto in vivo.

stabilized-window-for-intravital-imaging-of-the-murine-pancreas

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo demonstra o procedimento para implantar uma janela de imagem pancreática para separar o pâncreas dos intestinos para imagens longitudinais de alta resolução com lapso de tempo da microestrutura do pâncreas.

Instalação da janela de imagem intravital pancreática em modelo de camundongo: uma janela de imagem pancreática integrada para imagens in vivo de lapso de tempo da microestrutura do pâncreas murino

Neste vídeo, descrevemos a imagem intravital do pâncreas de um camundongo através de uma janela estabilizada para visualização de longo prazo da dinâmica celular.

Imagem intravital: um método para observação em nível celular do pâncreas de camundongo através de uma janela de imagem estabilizada

A imagem in vivo de alta resolução do pâncreas foi facilitada com a janela de imagem intravital pancreática.

Visualização de nível celular longitudinal estabilizada do pâncreas em um modelo murino com uma janela de imagem intravital pancreática

Uma abordagem é aqui apresentada para imagens intravitais de longo prazo usando janelas de silicone opticamente claras que podem ser coladas diretamente ao tecido/órgão de interesse e à pele. Essas janelas são mais baratas e mais versáteis do que outras atualmente utilizadas no campo, e a inserção cirúrgica causa inflamação e angústia limitadas aos animais.

Imagem intravital longitudinal através de janelas de silicone claras

Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para realizar imagens de célula única de alta resolução de longo prazo do pulmão intacto em tempo real usando uma janela de imagem estabilizada a vácuo.

De longo prazo de alta resolução Intravital Microscopia no pulmão com um vácuo estabilizado Janela de imagem

Nós descrevemos um método que utiliza a irradiação periférica direcionada para induzir comportamento à fadiga, como em ratos. A dose de irradiação não letal selecionado leva a uma redução de uma semana em atividade de execução roda voluntária.

Um mouse modelo de fadiga induzida por irradiação periférica

Este protocolo descreve um método recentemente estabelecido para a entrega do vírus para a próstata murino. Usando tecnologia CRISPR/Cas9, superexpressão do gene ou entrega de recombinase Cre, a técnica permite ortotópico alteração da expressão gênica e implementa um modelo de romance do rato para câncer de próstata.

Entrega de vírus de CRISPR guias de próstata murino para alteração do Gene

Tumores de bexiga murino são induzidas com carcinógeno nitrosamina N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) (BBN). Geração de tumor de bexiga é heterogênea; Portanto, uma avaliação correcta da carga do tumor é necessária antes de randomização para tratamento experimental. Aqui nós apresentamos um protocolo de MRI, rápido e confiável para avaliar o estágio e o tamanho do tumor.

Ressonância magnética avaliação dos tumores de bexiga murino induzida por substância cancerígena

Aqui nós descrevemos um método para a imagem latente high-resolution do multifotônica do tempo-lapso de pilhas do tumor cerebral antes e depois da intervenção cirúrgica invasora (por exemplo, biópsia) dentro do mesmo animal vivo. Este método permite estudar o impacto destes procedimentos cirúrgicos invasivos no comportamento migratório, invasivo e proliferativo das células tumorais em um único nível de células.

Imagem latente longitudinal de intravital do comportamento da pilha do tumor cerebral em resposta a uma biópsia cirúrgica invasora

Este protocolo esboça um método rápido para gerar simultaneamente culturas do melanócito e do fibroblasto da pele de 0-4 ratos velhos do dia. Estas culturas primárias podem ser mantidas e manipuladas in vitro para estudar uma variedade de processos fisiologicamente relevantes, incluindo biologia celular da pele, pigmentação, cicatrização de feridas e melanoma.

Geração rápida de culturas de melanócitos e fibroblastos de Murina primária

Aprenda a técnica SWIP para imagem intravital de alta resolução do pâncreas murino, permitindo estudos longitudinais de adenocarcinoma e pancreatite. Este método estabiliza o tecido para visualização subcelular in vivo.

Janela estabilizada para imagem intravital do pâncreas murino

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