Name: Fabricação e encapsulamento de esferoides tumorais em hidrogéis de polietilenoglicol para estudo de interações esferóide-matriz (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprenda a fabricar e encapsular esferoides tumorais em hidrogéis de polietilenoglicol para estudar interações esferóide-matriz. Este método rápido e de baixo custo não requer equipamento especializado.

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Este trabalho foi financiado por fundos iniciais fornecidos à Dra. Silviya P Zustiak pela Saint Louis University, bem como por uma bolsa semente do Henry and Amelia Nasrallah Center for Neuroscience da Saint Louis University concedida à Dra. Silviya P Zustiak.

Fabricação seguida de encapsulamento 3D de esferoides tumorais em hidrogéis PEG

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<li>Shin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate-marine+collagen-agarose+composite+hydrogels+as+matrices+for+biomimetic+3D+cell+spheroid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Alginate-marine collagen-agarose composite hydrogels as matrices for biomimetic 3D cell spheroid formation.</a> RSC Advances. 6 (52), 46952-46965 (2016).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Modelos esferoides tumorais multicelulares baseados em hidrogel estão sendo cada vez mais desenvolvidos para avançar nas descobertas terapêuticas do câncer11,13,29. Eles são benéficos porque emulam parâmetros-chave do microambiente tumoral de forma controlada e, apesar de sua complexidade, são mais simples e baratos de usar do que os modelos in vivo, e muitos são compatíveis com tecnologias de rastreamento de alto rendimento. Os...

Os esferoides tumorais têm emergido como ferramentas úteis in vitro no estudo da etiologia, patologia e responsividade a drogasdo câncer 1. Tradicionalmente, esferoides têm sido cultivados em condições como placas de baixa adesão ou biorreatores, onde a adesão célula-célula é favorecida em relação à adesão célula-superfície2. No entanto, é hoje reconhecido que, para recapitular o microambiente tumoral com mais fidelidade, modelos esferoides in vitro devem capturar tanto as interações célula-célula quanto célula-matriz. Isso levou vários grupos a projetar arcabouços, como hidrogéis, onde esferoides podem ser encapsulados 3,4. Tais modelos esferoides baseados em hidrogel permitem a elucidação de interações célula-célula e célula-matriz sobre vários comportamentos celulares, tais como viabilidade, proliferação, tronco ou responsividade à terapia3.
Aqui, descrevemos um protocolo para encapsulação de esferoides de glioblastoma em hidrogéis de polietilenoglicol (PEG). Existem vários relatos na literatura de encapsulamento esferoide de células de glioblastoma em hidrogéis. Por exemplo, esferoides foram formados encapsulando células U87 em hidrogéis de PEG decorados com um ligante adesivo RGDS e reticulados com um peptídeo enzimaticamente clivável para determinar o efeito da rigidez do hidrogel no comportamento celular5. Células U87 também foram formadas em outros hidrogéis à base de PEG ou ácido hialurônico para expandir a população de células-tronco cancerígenas6 ou explorar mecanismos mediados pela matriz de resistência à quimioterapia 7,8,9. Esferoides de glioblastoma também têm sido encapsulados em hidrogéis de gelatina para estudar o crosstalk entre micróglia e células cancerosas e seu efeito na invasão celular10. Em geral, tais estudos têm demonstrado a utilidade de modelos in vitro baseados em hidrogel na compreensão da patologia do glioblastoma e na elaboração de tratamentos.
Além disso, existem diferentes métodos para a fabricação de esferoides tumorais e encapsulamento de hidrogel11. Por exemplo, células dispersas poderiam ser semeadas em hidrogéis e deixadas formar esferoides ao longo do tempo 5,12. Uma desvantagem de tal método é a polidispersidade dos esferoides formados, o que poderia levar a respostas celulares diferenciais. Para produzir esferoides uniformes, as células poderiam ser encapsuladas em microgéis e cultivadas por longos períodos até invadirem e remodelarem o gel13, ou as células poderiam ser depositadas em géis moldados com "furos" esféricos e deixadas agregar14. A desvantagem desses métodos é sua relativa complexidade, a necessidade de um gerador de gotículas ou outros meios para formar microgéis ou os "buracos" no gel, e o tempo que leva para os esferoides crescerem e amadurecerem. Alternativamente, os esferoides poderiam ser pré-formados em micropoços 9,15,16 ou em placas suspensas17,18 e então encapsulados em hidrogel, semelhante à técnica aqui descrita. Esses métodos são mais simples e podem ser feitos de uma forma de maior rendimento. Curiosamente, tem sido demonstrado que o método de formação de esferoides pode afetar comportamentos de células esferoides, tais como expressão gênica, proliferação celular ou responsividade a drogas19,20.
Aqui, enfocamos o glioblastoma por se tratar de um tumor sólido cujo ambiente nativo é a matriz cerebral macia e nanoporosa21, que pode ser mimetizada por um hidrogel macio e nanoporoso. O glioblastoma também é o câncer cerebral mais letal para o qual não há cura disponível22. Entretanto, o protocolo aqui descrito pode ser utilizado para o encapsulamento de esferoides representando qualquer tumor sólido. Optou-se por utilizar hidrogéis de PEG que são formados através de uma reação de adição tipo Michael23. O PEG é um hidrogel sintético, não degradável e biocompatível, inerte e serve como andaime e suporte físico celular, mas não suporta a ligação celular23. A adesividade celular pode ser adicionada separadamente via amarração de proteínas inteiras ou ligantes adesivos24, e a degradabilidade pode ser adicionada através de modificações químicas da cadeia polimérica do PEG ou reticulantes hidrolítica ou enzimaticamente degradáveis25,26. Isso permite que as propriedades bioquímicas sejam ajustadas independentemente das propriedades mecânicas ou físicas do hidrogel, o que poderia ser vantajoso no estudo das interações célula-matriz. A química de gelificação do tipo Michael é seletiva e ocorre em condições fisiológicas; Assim, permite o encapsulamento esferoide simplesmente misturando os esferoides com a solução precursora de hidrogel.
De modo geral, a metodologia aqui apresentada tem várias características notáveis. Primeiro, fabricar esferoides tumorais em uma montagem multipoço é eficiente, rápido e o custo dos materiais necessários é baixo. Em segundo lugar, os esferoides são produzidos em grandes lotes em uma variedade de tamanhos com baixa polidispersidade. Finalmente, apenas materiais disponíveis comercialmente são necessários. A utilidade da metodologia é ilustrada pela exploração do efeito das propriedades do substrato na viabilidade das células esferoides, circularidade e tronco celular.

<table><tbody><tr><td>70% de etanol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>LC22210-4</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Cônicos</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 Poços Ultra Placas de Fixação Ultra Baixa</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 35 mm</td><td>Amazon</td><td>706011</td><td></td></tr><tr><td>Poli(etilenoglicol)-acrilato de 4 braços (4 braços PEG-Ac; 10 kDa)</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-10K-5g</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Cônicas</td><td>Fisher Scinetific</td><td></td><td></td>3181345107</tr><tr><td>AggreWell 400 de 6 poços</td><td>StemCell Technologies, Vancouver, Canadá</td><td>34421</td><td>Micropoços piramidais quadrados&nbsp;</td></tr><tr><td>solução de enxágue antiaderente</td><td>StemCell Technologies, Vancouver, Canadá</td><td>Cat #: 07010</td><td></td></tr><tr><td>Ácido aspártico-arginina-cisteína-glicina-valina-prolina-metionina-serina-metionina-arginina-glicina-cisteína-arginina- ácido aspártico (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptídeo</td><td>Genic Bio, Xangai, China</td><td>n / a</td><td>Síntese personalizada</td></tr><tr><td>Capa de fumaça química</td><td>KEWAUNEE</td><td>99151</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de Membrana de Porão Corning Matrigel, LDEV Grátis&nbsp;</td><td>Detergente</td> para <td>matriz de membrana de porão</td><td>Corning 356234</td></tr><tr><td>- Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>Surfactante não iônico</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas descartáveis (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)</td> <td>Fisher Scinetific</td><td>1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL (FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>HyClone</td><td>SH30073-03</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Formaldeído 37%</td> Placas de Vidro <td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Slumpys</td><td></td><td>GBS4100SFSL</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Transferência de Vidro</td><td>Fisher Scinetific</td><td>5 3/4": 1367820A, 9":136786B</td><td></td></tr><tr><td>Glicina-Arginina-Cisteína-Ácido Aspártico-Arginina-Glicina-Ácido Aspártico-Serina (GRCD-RGDS) peptídeo</td><td>Genic Bio, Shanghai, China</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitômetro</td> de síntese personalizada <td>Bright-Line</td><td>383684</td><td></td></tr><tr><td>Solução hidrofóbica - Repel Silano&nbsp;</td><td>Incubadora GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NUAIRE</td><td>NU-8500</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Invertido (Axiovert 25)</td><td>Zeiss</td><td>663526</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>D1125</td><td></td></tr><tr><td>Leica Confocal SP8</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Luz e Fluorescente (Axiovert 200M)</td> <td>Zeiss</td><td>3820005619</td><td></td></tr><tr><td>Micro tubos de centrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>2 mL: Software de Microscópio 02681258</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>AxioVision Rel. 4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>Nestin Alexa Fluor 594&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23927</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM&nbsp;</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x), pH 7,4</td><td>HyClone</td><td>SH30256,01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670046</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Aid</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>P-76864</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta (1&ndash; 200 &micro; L, 101&ndash; 1000 &micro; L)</td> <td>Pipetas</td> de Transferência Descartáveis Padrão <td>de 2707509</td><td></td></tr><tr><td>Plástico</td><td>Fisher Scientific Fisher Scientific</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Barcos de Pesagem de Plástico (100 mL)</td> <td>Amazon&nbsp;</td><td>mdo-azoc-1030</td><td></td></tr><tr><td>poli(etilenoglicol)-ditiol (PEG-diSH; 3.4 kDa)</td><td>Laysan Bio</td><td>SH-PEG-SH-3400-5g</td><td></td></tr><tr><td>Polidimesiloxano (PDMS) [Kit de Elastômero Slygard 182]</td><td>Elsworth Adhesives</td><td>3097358-1004</td> Luvas de Exame Livres de <td>Pó de Polidimetilsiloxano</td></tr><tr><td></td><td>Quest</td><td>92897</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio, 1 mg/mL soln aquoso.&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AAJ66584AB</tr><tr><td>RPMI-1640 Médio (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30027-02</td><td></td></tr><tr><td>Espaçadores de silicone - Folha de silicone, 0,5 mm de espessura/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR-S-0.5</td><td></td></tr><tr><td>SOX2 Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Capuz de Cultura de Tecidos Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-365823</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolamina, &ge; 99,0% (GC)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>U-87 MG células de glioblastoma humano</td><td>American Type Culture Collection&nbsp;</td><td>HTB-14</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação e encapsulamento de esferoides tumorais em hidrogéis de polietilenoglicol para estudo de interações esferóide-matriz

Tumor Spheroid Fabrication and Encapsulation in Polyethylene Glycol Hydrogels for Studying Spheroid-Matrix Interactions

O encapsulamento tridimensional (3D) de esferoides é crucial para replicar adequadamente o microambiente tumoral para um ótimo crescimento celular. Aqui, projetamos um modelo in vitro de glioblastoma 3D para encapsulamento esferoide para mimetizar o microambiente extracelular tumoral. Primeiro, formamos moldes de micropoços piramidais quadrados usando polidimetilsiloxano. Esses moldes de micropoços foram então usados para fabricar esferoides tumorais com tamanhos rigidamente controlados de 50-500 μm. Uma vez formados, os esferoides foram colhidos e encapsulados em hidrogéis à base de polietilenoglicol (PEG). Os hidrogéis de PEG são uma plataforma versátil para encapsulamento esferoide, pois as propriedades do hidrogel, como rigidez, degradabilidade e adesividade celular, podem ser ajustadas independentemente. Aqui, usamos um hidrogel macio representativo (~8 kPa) para encapsular esferoides de glioblastoma. Finalmente, um método para coloração e imagem de esferoides foi desenvolvido para obter imagens de alta qualidade via microscopia confocal. Devido ao núcleo esferoide denso e à periferia relativamente escassa, a obtenção de imagens pode ser difícil, mas o uso de uma solução de clareamento e corte óptico confocal ajuda a aliviar essas dificuldades de imagem. Em resumo, mostramos um método para fabricar esferoides uniformes, encapsula-los em hidrogéis de PEG e realizar microscopia confocal nos esferoides encapsulados para estudar o crescimento esferoide e várias interações célula-matriz.

Plataformas de triagem de fármacos baseadas em esferoides para estudar os efeitos quimioterápicos são cada vez mais procuradas devido à ênfase na modulação do microambiente tumoral sobre o encapsulamento esferoide em biomateriais replicantes de tecido nativo. Aqui desenvolvemos um método para preparação de esferoides tumorais multicelulares e posterior encapsulamento e imageamento em hidrogel 3D. Os esferoides são preparados em moldes de micropoços (Figura 3A,B), que resultam em esferoides c...

Aqui, apresentamos um protocolo que permite a fabricação rápida, robusta e barata de esferoides tumorais seguida de encapsulamento em hidrogel. É amplamente aplicável, pois não requer equipamentos especializados. Seria particularmente útil para explorar interações matriz-esferóide e construir modelos in vitro de fisiologia ou patologia tecidual.

Fabricação e encapsulamento de esferoides tumorais em hidrogéis de polietilenoglicol para estudo de interações esferóide-matriz

Three-dimensional (3D) encapsulation of spheroids is crucial to adequately replicate the tumor microenvironment for optimal cell growth.  Here, we ...

Nosso laboratório concentra-se em projetar modelos in vitro de hidrogel para encapsulamento de esteroides de glioblastoma para mimetizar o microambiente extracelular tumoral. O substrato efetivo, propriedades mecânicas e bioquímicas sobre a viabilidade de células esteroides, circularidade, estanque e espalhamento são investigados com tais modelos. Os desafios experimentais atuais no desenvolvimento de módulos tumorais giram em torno de um desejo de complexidade para mimetizar todos os aspectos do microambiente tumoral para relevância fisiológica, e também um desejo de simplicidade para tornar o modelo acessível, robusto, de baixo custo, fácil de usar e compatível com abordagens de rastreamento multiplex.Apresentamos um protocolo que permite a fabricação rápida, robusta e de baixo custo de esteroides tumorais e encapsulamento em hidrogéis feitos para mimetizar o microambiente tumoral. O modelo não requer nenhum equipamento especializado. Será particularmente útil para explorar interações da matriz esteroide na construção de modelos de fisiologia ou patologia tecidual in vitro.Compreender as interações entre as células cancerosas de glioblastoma e seu microambiente pode encorajar o desenvolvimento de novas terapias para melhor tratar esse câncer. Além disso, o desenvolvimento de um modelo in vitro para o câncer de glioblastoma pode aumentar o desenvolvimento desse modelo para outras doenças oncológicas.

tumor-spheroid-fabrication-encapsulation-polyethylene-glycol

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Fonte: Guyon, J., et al. Um modelo esferóide 3D para glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)O vídeo demonstra a geração de um modelo esferóide tridimensional de invasão de células tumorais. Os esferóides são formados a partir de células tumorais cerebrais humanas e incorporados em uma matriz de colágeno. As células tumorais na periferia esferóide adotam um fenótipo invasivo, secretando proteases para degradar o colágeno e avançando para invadir a matriz circundante.

Geração de um modelo esferóide tridimensional de invasão de células tumorais

-Tracking microrheology partícula pode ser usada para quantificar de forma não destrutiva e espacialmente mapear as alterações nas propriedades mecânicas da matriz extracelular em modelos de tumor em 3D.

Medição Longitudinal de Matriz Extracelular Rigidez em 3D tumorais modelos com o uso de rastreamento de partículas Microrheology

Aqui, descrevemos um protocolo rápido e flexível para a formação de esferoides de células 3D por meio da agregação celular. Isso é facilmente adaptado a vários tipos de células e é adequado para uso em uma variedade de aplicações, incluindo ensaios de migração celular, invasão ou anoikis, e para imagens e quantificação de interações célula-matriz.

Um Método celular agregação eficiente e flexível para 3D Spheroid Produção

Este protocolo descreve a fabricação de microcryogels elástica 3D se integrando microfabrication com tecnologia cryogelation. Durante o carregamento com células, microtissues 3D são gerados, que pode ser facilmente injetado em vivo para facilitar a terapia regenerativa ou montadas em matrizes para em vitro triagem de drogas de alto rendimento.

Microtissues 3D para terapia regenerativa injetável e triagem de drogas de alto rendimento

Desenvolvemos um modelo de câncer de mama heterogênea consistindo de células de tumor e fibroblasto imortalizadas incorporadas em um bioink de alginato/gelatina de bioprintable. O modelo recapitula o microambiente do tumor na vivo e facilita a formação de esferoides tumor multicelulares, produzindo insights sobre os mecanismos de condução tumorigênese.

Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D em Vitro sistemas modelo induzem a formação de esferoide de célula

O microambiente tumoral é uma parte essencial do crescimento e invasão do câncer. Para imitar a progressão da carcinoma, uma matriz humana biologicamente relevante é necessária. Este protocolo introduz uma melhoria para in vitro o ensaio tridimensional da invasão do esferóide aplicando uma matriz leiomyoma-baseada humana. O protocolo também introduz uma análise de invasão de células baseada em computador.

Matriz tumor-baseada inteiramente humana no ensaio tridimensional da invasão de spheroid

Aqui, descrevemos um ensaio de invasão fácil de usar para glioblastoma. Este ensaio é adequado para células-tronco de glioblastoma. Uma macro Fiji para fácil quantificação de invasão, migração e proliferação também é descrita.

Um modelo esferóide 3D para glioblastoma

A abordagem apresentada avalia simultaneamente a invasão de células cancerígenas em ensaios esferoides 3D e citotoxicidade de células T. Esferoides são gerados em um elenco multi-microwell livre de andaimes. A cocultura e a incorporação na matriz de colágeno tipo I são realizadas dentro do mesmo dispositivo que permite monitorar a invasão de células cancerígenas e a citotoxicidade mediada por células T.

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

Modelos in vitro abrangentes que recapitulem fielmente a doença humana relevante estão em falta. O presente estudo apresenta a criação e cultura de spheróides tumorais tridimensionais (3D), uma ferramenta in vitro confiável para estudar a interação tumor-estrommal no carcinoma hepatocelular humano.

Um modelo esferoide tridimensional para investigar a interação tumoral-estroma em carcinoma hepatocelular

O presente estudo descreve metodologias para cultivo, congelamento, descongelamento, processamento, coloração, marcação e exame de esferoides e organoides inteiros sob vários microscópios, enquanto permanecem intactos em um hidrogel dentro de um dispositivo multiuso.

Cultura, congelamento, processamento e imagem de organoides e esferoides inteiros ainda em um hidrogel

Este artigo demonstra um método padronizado para a construção de esferoides tumorais tridimensionais. Uma estratégia para observação esferoide e análise de aprendizagem profunda baseada em imagens usando um sistema de imagem automatizado também é descrita.

Geração de esferoides tumorais 3D para estudos de avaliação de fármacos

Aprenda a fabricar e encapsular esferoides tumorais em hidrogéis de polietilenoglicol para estudar interações esferóide-matriz. Este método rápido e de baixo custo não requer equipamento especializado.

Fabricação e encapsulamento de esferoides tumorais em hidrogéis de polietilenoglicol para estudo de interações esferóide-matriz

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