Name: Protocolo Otimizado para Geração de Células Funcionais Secretoras de Insulina Pancreáticas a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Aprenda a diferenciação direcionada de células-tronco pluripotentes humanas em células beta produtoras de insulina. Este protocolo de seis etapas gera aglomerados funcionais que secretam insulina em resposta à glicose, com aplicações terapêuticas para diabetes.

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Ines Cherkaoui foi apoiada por uma bolsa de estudos da Diabetes UK (BDA 18/0005934) para a GAR, que também agradece ao Wellcome Trust for an Investigator Award (212625/Z/18/Z), UKRI MRC por uma bolsa do Programa (MR/R022259/1), Diabetes UK for Project grant (BDA16/0005485), CRCHUM para fundos de start-up, Innovation Canada por um John R. Evans Leader Award (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) para uma subvenção de projeto, e CIHR, JDRF para uma concessão de equipe (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). Camille Dion e Dr. Harry Leitch por sua ajuda com a geração e cultura de hiPSCs humanos, a instalação de organoides do NIHR Imperial BRC (Biomedical Research Centre), Londres.

Diferenciando células-tronco pluripotentes humanas em células β pancreáticas

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<li>Sui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Cell+Replacement+in+mice+using+human+Type+1+diabetes+nuclear+transfer+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">β-Cell Replacement in mice using human Type 1 diabetes nuclear transfer embryonic stem cells.</a> Diabetes. 67 (1), 26-35 (2018).</li>
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<li>Sui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+replication+fork+speed+promotes+pancreatic+endocrine+differentiation+and+controls+graft+size%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size.</a> JCI Insight. 6 (5), 141553(2021).</li>
<li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+cellular+identity+during+human+in+vitro+%CE%B2-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation.</a> Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).</li>
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<li>Finch, P. W., Rubin, J. S., Miki, T., Ron, D., Aaronson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+KGF+is+FGF-related+with+properties+of+a+paracrine+effector+of+epithelial+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth.</a> Science. 245 (4919), 752-755 (1989).</li>
</ol>

O sucesso da diferenciação das hPSCs em células β pancreáticas depende da otimização de todos os aspectos da cultura de rotina e da passagem das hPSCs selecionadas. Isso inclui garantir que a linhagem celular tenha cariótipo normal, seja negativa para infecção por micoplasma e esteja livre de genomas de plasmídeos ou vetores virais. Além disso, ao usar hiPSCs, é importante evitar o uso da passagem mais antiga, que ainda está passando por reprogramação, para experimentos piloto. Esses experimentos devem ser conduzidos em pequena escala para identificar a linha hPSC com melhor potencial de diferenciação e o número ótimo de passagens.
Outros parâmetros que podem influenciar a eficiência da diferenciação incluem a qualidade do meio de células-tronco utilizado, a densidade de revestimento e o número de passagens 10,12. Esse protocolo foi otimizado para maximizar a eficiência da diferenciação, garantindo que todos os parâmetros relevantes sejam otimizados10.
Meios de diferenciação com formulações específicas são usados em cada estágio para apoiar a diferenciação de hPSCs em células-β. A activina A e um agonista Wnt são usados no meio de diferenciação para iniciar a transição para as células definitivas da endoderme. Durante a fase primitiva do tubo intestinal, o KGF é adicionado ao meio para promover maior diferenciação em células β15, e essa inclusão de KGF é mantida do 6º ao 8º dia, diferindo do protocolo original de Sui, Egli, et al.10. Durante a fase de progenitor pancreático, a composição específica do meio é otimizada para aumentar a expressão do fator de transcrição Pdx1. Isso é obtido com o uso de uma alta concentração de ácido retinóico (AR), KGF e LDN193189, que inibe a via da proteína morfogenética óssea (BMP)8. À medida que a diferenciação progride para o estágio endócrino, o meio de cultura é modificado para regular negativamente a sinalização de Notch. Isso é conseguido incorporando-se XXI, um inibidor da γ-secretase, juntamente com T3 (hormônio tireoidiano), AR e RepSox, um inibidor da via Activin/BMP/TGF-β8. Esta combinação específica de compostos é usada para promover a diferenciação de progenitores pancreáticos em progenitores endócrinos. Finalmente, para otimizar o processo de diferenciação direta, a afidicolina (APH) é introduzida durante a diferenciação de progenitores pancreáticos em progenitores endócrinos. Essa adição de HAP visa aumentar ainda mais a diferenciação β-célula, e representa uma modificação distinta do protocolo inicial proposto por Sui, Egli, et al.10,11.
Durante o processo de diferenciação, é crucial monitorar a densidade celular e evitar a sobreconfluência, pois isso pode dificultar a diferenciação adequada. Culturas de alta densidade podem manter alta expressão de Oct4, inibindo a diferenciação para endoderme definitivo. A remoção do inibidor de ROCK durante a primeira etapa de lavagem é essencial para iniciar a diferenciação e permitir que o estado pluripotente das hPSCs seja alterado. O uso de um marcador de fluorescência, como o Mel1 INS-GFP com GFP integrado ao locus da insulina, facilita a avaliação do progresso da diferenciação nos estágios progenitor pancreático e β-célula, auxiliando experimentos a jusante14.
O protocolo atual de diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em células pancreáticas β semelhantes tem demonstrado variabilidade na eficiência entre diferentes linhagens de hPSC10. Além disso, as células semelhantes a β resultantes exibem imaturidade funcional em comparação com ilhotas pancreáticas humanas, mostrando menor secreção de insulina por célula. Para resolver melhor essa limitação, a maturação in vivo de células semelhantes à β pode ser alcançada pelo transplante de organoides das ilhotas em modelos animais durante os estágios finais de diferenciação 6,7.
Apesar dessas limitações, a diferenciação das hPSCs em células β pancreáticas tem potencial significativo em relação aos métodos existentes 8,9,10. Esta técnica permite produzir um grande número de células semelhantes a células β que respondem à glicose e expressam marcadores de células β (Pdx1 e Nkx6.1, ver Figura 2). Isso é feito sem as limitações éticas, técnicas e de origem associadas ao uso de ilhotas pancreáticas humanas. Além disso, essa técnica tem potencial para ser aplicada à medicina personalizada, uma vez que células β específicas do paciente podem ser geradas para testes de drogas e modelagem dedoenças4,6,7. A técnica também pode ter aplicações futuras no tratamento do diabetes que envolva a perda ou disfunçãodas células β pancreáticas4,6,7.

As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) têm a capacidade única de se diferenciar em vários tipos celulares, tornando-as uma alternativa viável às células-β pancreáticas humanas1. Essas hPSCs são categorizadas em dois tipos: células-tronco embrionárias (hESCs), derivadas do blastocisto2, e células pluripotentes induzidas (hiPSCs), geradas pela reprogramação direta de célulassomáticas3. O desenvolvimento de técnicas para diferenciar hPSCs em células-β tem implicações importantes tanto para a pesquisa fundamental quanto para a prática clínica 1,4. O diabetes mellitus é uma doença crônica que afeta >400 milhões de pessoas em todo o mundo e resulta da incapacidade do organismo de regular a glicemia devido ao mau funcionamento ou perdade células β pancreáticas5. A disponibilidade limitada de células das ilhotas pancreáticas para transplante tem dificultado o desenvolvimento de terapias de substituição celular para o diabetes 2,4,6,7. A capacidade de gerar células secretoras de insulina responsivas à glicose usando hPSCs serve como um modelo celular útil para estudar o desenvolvimento e a função das ilhotas humanas. Ele também pode ser usado para testar potenciais candidatos terapêuticos para o tratamento do diabetes em um ambiente controlado. Além disso, as hPSCs têm o potencial de produzir células das ilhotas pancreáticas geneticamente idênticas ao paciente, reduzindo o risco de rejeição imunológica após o transplante 2,4,7.
Nos últimos anos, houve avanços significativos no refinamento dos protocolos de cultura e diferenciação de hPSC, resultando em aumento da eficiência e reprodutibilidade do processo de diferenciação no sentido degerar células β pancreáticas8,9.
O protocolo a seguir descreve os estágios essenciais da diferenciação dirigida das células β pancreáticas. Envolve a regulação de vias de sinalização celular específicas em momentos distintos. Baseia-se no protocolo desenvolvido por Sui L. et al.10 (2018) para a geração de hPSCs em células β pancreáticas. O protocolo foi ajustado às atualizações recentes de Sui L. et al.11 (2021), já que a pesquisa mais recente enfatiza a importância do uso do tratamento com afidicolina (APH) para aumentar a diferenciação de células β. O protocolo atual inclui a adição de HPA ao meio durante as etapas posteriores do processo. Além disso, modificações foram feitas na composição do meio durante os estágios iniciais de diferenciação em relação ao protocolo inicial. Uma mudança notável é a adição do Fator de Crescimento de Queratinócitos (KGF) no Dia 6 e continuando até o Dia 8. O fator de crescimento de queratinócitos (KGF) é introduzido do 6º ao 8º dia, o que difere ligeiramente do protocolo inicial10, onde o KGF não foi incluído no meio estágio 4.
O primeiro e essencial passo na geração de células semelhantes a células β é a diferenciação direta das hPSCs em endoderme definitivo (DE), uma camada germinativa primitiva que dá origem ao revestimento epitelial de vários órgãos, incluindo o pâncreas. Após a formação do ED, as células sofrem diferenciação no tubo intestinal primitivo, que é seguido pela especificação do destino posterior do intestino anterior. O intestino anterior posterior então se desenvolve em células progenitoras pancreáticas, que têm o potencial de se diferenciar em todos os tipos celulares do pâncreas, incluindo as células endócrinas e exócrinas. A etapa subsequente do processo envolve progenitores endócrinos pancreáticos dando origem às células secretoras de hormônios encontradas nas ilhotas de Langerhans. Ao final, o processo de diferenciação atinge seu estágio final produzindo células pancreáticas β tipo células pancreáticas totalmente funcionais9,10. É importante ressaltar que esse processo é complexo e muitas vezes requer otimização das condições de cultura, como fatores específicos de crescimento e componentes da matriz extracelular, para melhorar a eficiência e a especificidade dadiferenciação9,10. Além disso, a geração de células funcionais semelhantes a células β a partir de hPSCs in vitro ainda é um grande desafio. A pesquisa em andamento concentra-se em melhorar os protocolos de diferenciação e melhorar a maturação e a função das células-βresultantes9.
Neste protocolo, o uso de dissociação celular suave durante a cultura e passagem de hPSCs é essencial para manter a viabilidade e pluripotência celular, melhorando significativamente a eficiência da diferenciação em células-β pancreáticas. Além disso, cada meio específico de estágio foi meticulosamente otimizado seguindo o protocolo desenvolvido por Sui L. et al.10 para promover um alto rendimento de células secretoras de insulina em grupos que se assemelham muito à ilhota humana.

<table><tbody><tr><td>Tubo de Microcentrífuga TubeOne de 1,5 mL Placa</td> de Cultura de Células <td>de 6 poços Starlabs</td><td>S1615-5500</td><td></td></tr><tr>Placa<td>de 6 poços</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>165218</td><td></td></tr><tr><td>AggreWell 400&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34425</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Glucagon&nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G2654-100UL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Insulina&nbsp;</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NKX6.1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-49672SS</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PDX1&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab84987</td><td></td></tr><tr><td>Aphidicolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4487</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50X), sem soro&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino Albumina, livre de ácidos graxos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Livre de cálcio/magnésio D-PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Ciclopamina-KAAD</td><td>Calbiochem</td><td>239804</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose, BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato dissódico, anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94046-100ML-DMEM</td><td></td></tr> <tr><td>mais GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10566016</td><td>Para Meio de Lavagem 2: DMEM mais GlutaMAX 1% PS.&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Epredi SuperFrost Plus Lâminas de adesão</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270098</td><td></td></tr><tr><td>Gamma-Secretase Inhibitor XX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J64904</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free Fator de Crescimento Reduzido Basement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413302</td><td>Geltrex 1:1 em meio DMEM/F-12 frio para fornecer uma diluição final de 1:100.</td></tr><tr><td>Cobaia anti-cobaia de cabra, Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21435</td><td></td></tr><tr><td>Cobaia anti-cabra, Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150187</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-rato de cabra, Alexa Fluor 633</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21052</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Tampão HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Tricloridrato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Proteína Recombinante Humana FGF-7 (KGF)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0094</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de hidrogênio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>295426</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Barreira hidrofóbica PAP Pen</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG4582</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0559-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272-500G</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound 118 mL</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1180</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tablets, solução salina tamponada com fosfato, Fisher BioReagents</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (PS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific,</td> <td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Proteína EGF humana recombinante</td><td>R & D Systems</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>Vidros de cobertura retangulares, 22&vezes; 50 mm</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>RepSox (Cloridrato)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72394</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Suplemento&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61870036</td><td>para meio de lavagem 1: RPMI 1640 mais GlutaMAX 1% PS.</td></tr><tr><td>Shandon Immu-mount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de sódio anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Endoderme&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>StemFlex Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3349401</td><td>Descongele o Suplemento StemFlex durante a noite a 4&deg; C, transfira qualquer líquido residual do frasco de suplemento para o meio basal StemFlex.</td></tr><tr><td>Ácido Retinoico All-Trans Stemolecule</td><td>Reprocell</td><td>04-0021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tormona da tireoide 3 (T3)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Solução azul de tripano, 0,4%</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypL Express (1X)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Placa aderente ultrabaixa para cultura de suspensão</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>38071</td><td></td></tr><tr><td>Água Destilada UltraPure DNase/RNase-Free</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Dicloridrato)&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Zinco</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Z4750</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo otimizado para geração de células funcionais secretoras de insulina pancreáticas a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Optimized Protocol for Generating Functional Pancreatic Insulin-secreting Cells from Human Pluripotent Stem Cells

As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) podem se diferenciar em qualquer tipo de célula, tornando-as uma excelente fonte alternativa de células-β pancreáticas humanas. As hPSCs podem ser células-tronco embrionárias (hESCs) derivadas do blastocisto ou células pluripotentes induzidas (hiPSCs) geradas diretamente de células somáticas usando um processo de reprogramação. Aqui um protocolo baseado em vídeo é apresentado para delinear as condições ideais de cultura e passagem para hPSCs, antes de sua diferenciação e subsequente geração de células pancreáticas produtoras de insulina. Essa metodologia segue o processo de seis estágios para diferenciação dirigida a células β, em que as hPSCs se diferenciam em endoderme (DE) definitiva, tubo intestinal primitivo, destino do intestino anterior, progenitores pancreáticos, progenitores endócrinos pancreáticos e, finalmente, células β pancreáticas. Vale ressaltar que essa metodologia de diferenciação leva um período de 27 dias para gerar as células-β pancreáticas humanas. O potencial de secreção de insulina foi avaliado através de dois experimentos, que incluíram imunomarcação e secreção de insulina estimulada por glicose.

O protocolo descrito neste trabalho oferece uma abordagem altamente eficiente para diferenciar células β do tipohPSCs 10. Esse processo utiliza um sistema de cultura 2D que é facilmente escalável, possibilitando seu uso em diversos cenários experimentais, como diferenciação de aprendizagem, projetos e laboratórios menores e testes-piloto para avaliar o potencial de diferenciação de uma linha iPSC.
É essencial caracterizar as propriedades funcionais de células β diferenciadas em ilhotas para obter informações sobre a homeostase da glicose. Isso é tipicamente obtido por meio de vários experimentos, como imunomarcação para marcadores de células β e expressão de insulina, bem como ensaios de secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS), que testam a função das ilhotas em resposta a baixas e altas concentrações de glicose12,13. As células-β possuem genes de assinatura, incluindo Nkx2-2, Pdx1, Nkx6-1 e Neurod1, que são críticos para estabelecer e manter a identidade β-célula9. Técnicas de imunomarcação são valiosas para investigar a expressão e localização de proteínas dentro de cortes teciduais. A imunomarcação para marcadores de células β pode avaliar os níveis de expressão dos principais marcadores de linhagem pancreática, fornecendo informações sobre a fidelidade e otimização do processo de diferenciação para aplicações específicas 9,12.
Neste estudo, a linha de repórteres Mel1 InsGFP/w (Mel1 INS-GFP)14 hESC foi usada para diferenciar clusters compreendendo diferentes tipos celulares, incluindo células β semelhantes àquelas encontradas em ilhotas nativas humanas. A Figura 2 deste trabalho apresenta achados significativos quanto à eficiência e acurácia do processo de diferenciação. Os resultados demonstram um alto enriquecimento de células que expressam insulina dentro da linhagem pancreática, e essas células exibem secreção de insulina estimulada por glicose. Isso indica a geração bem-sucedida de células funcionais do tipo β através do processo de diferenciação.
As células diferenciadas foram estimuladas com baixas e altas concentrações de glicose, e os resultados do GSIS mostraram que os aglomerados derivados das células Mel1 funcionaram de forma semelhante às ilhotas em sua resposta de secreção de insulina à glicose. Os clusters derivados de Mel1 foram encontrados para secretar 100 vezes mais insulina em resposta a altas concentrações de glicose em comparação com baixas concentrações de glicose. Especificamente, o conteúdo de insulina foi de 0,003 ± 0,002% a 3,3 mM de glicose baixa e de 0,236 ± 0,197% a 16,7 mM de glicose alta.
Os clusters derivados das hESCs Mel1 INS-GFP foram submetidos a análises adicionais para determinar sua composição e funcionalidade, além do ensaio GSIS. Especificamente, a expressão de genes de assinatura de células β e a presença de diferentes tipos celulares dentro dos clusters foram investigadas. Os resultados mostraram que a linhagem pancreática obtida a partir desse processo é altamente enriquecida em células insulino-positivas, indicando um alto nível de sucesso no processo de diferenciação das hESCs em células β-like. Além disso, a expressão de genes de assinatura, como Nkx6.1 e Pdx1, importantes para o estabelecimento e manutenção de identidades de células β, foi examinada. A análise revelou que aproximadamente 25% e 40% das células expressaram Nkx6.1 e Pdx1, respectivamente, fornecendo evidências adicionais de que os clusters continham células diferenciadas semelhantes a β (média de células Nkx6.1+ por cluster 24,9% ± 6,2%, n=9 clusters, células Pdx1+ 40,2% ± 6,2%, n=9, MEV, Figura 2). Além disso, os clusters continham outros tipos celulares, como células positivas para glucagon, que representavam cerca de 15% da população celular total. Essas células são tipicamente encontradas em células alfa de ilhotas nativas de Langerhans, sugerindo que os aglomerados se assemelham muito às ilhotas humanas em termos de composição celular.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65530/65530fig01.jpg"> Figura 1: Diferenciação das hPSCs em relação às células β pancreáticas. (A) Representação esquemática da diferenciação dirigida in vitro de hPSCs em células-β pancreáticas, que envolve seis estágios sucessivos: indução definitiva da endoderme, formação primitiva do tubo intestinal, especificação do destino posterior do intestino anterior, geração de progenitores pancreáticos, formação de progenitores endócrinos pancreáticos e, finalmente, diferenciação de células β pancreáticas. A diferenciação pancreática de células β utiliza etapas-chave do desenvolvimento das ilhotas humanas, com a regulação de vias de sinalização celular específicas em momentos específicos. B27: Suplemento B-27; Ri: inibidor de proteína quinase associado ao rho ou inibidor de ROCK; T3: hormônio tireoidiano; KGF: proteína humana KGF / FGF-7; RepSox: inibidor da via Activina/Nodal/TGF-β; Inibe a ALK5; AR: Ácido retinóico; ZS: sulfato de zinco; HNF: heparina não fracionada; XX: inibidor da gama-secretase XX; APH: afidicolina; EGF: fator de crescimento epidérmico; LDN: Inibidor de BMP III, LDN-212854; Ciclo: Ciclopamina- KAAD. (B) Imagens da morfologia celular captadas em vários estágios de diferenciação de células-tronco pluripotentes para células-β pancreáticas. A primeira imagem mostra células-tronco pluripotentes humanas no primeiro dia de diferenciação (monocamada de HPSCs). (C) No 11º dia, as células encontram-se na fase progenitora pancreática. Barra de escala de 100 μm. (D) No dia 12, formam-se aglomerados nos micropoços da placa de 6 poços após a dissociação das células na fase progenitora pancreática. (E) No dia 13, os cachos estão em uma placa de 6 poços de baixa fixação. Barra de escala de 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65530/65530fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65530/65530fig02.jpg"> Figura 2: Clusters obtidos a partir de relatórios diferenciados Mel1 InsGFP/w hESC linha14 foram avaliados para a presença de células produtoras de insulina expressando marcadores de maturidade de células β. (A) Imagens de imunofluorescência dos aglomerados foram capturadas de cortes criomold (5 μm) usando microscopia confocal de disco giratório, que revelou a predominância de células produtoras de insulina (aproximadamente 60%) em relação às células produtoras de glucagon (aproximadamente 15%) (n=9 clusters, aproximadamente 18.000 células, MEV). (B) Imagens de imunofluorescência dos aglomerados foram obtidas a partir de cortes criômold (5 μm) usando microscopia confocal de disco giratório, que mostrou o predomínio de células produtoras de insulina co-expressando os marcadores pancreáticos de células β Nkx6.1 (n=9 clusters, aproximadamente 18.000 células). (C) O contador de células ImageJ macro, projetado especificamente para a imunomarcação de marcadores, foi empregado para determinar a porcentagem de células positivas para insulina, glucagon e células β positivas para células Nkx6.1 e células positivas para marcadores de células β Pdx1. (D) Avaliou-se a secreção de insulina estimulada por glicose dos clusters derivados de Mel1 InsGFP/w hESC, que exibiu um aumento de 100 vezes em resposta à estimulação de glicose elevada (glicose 16,7mM) nos clusters diferenciados (n=9, EPM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65530/65530fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Resumo da composição da mídia para diferenciação direcionada. Esta tabela fornece um resumo da composição do meio usado para cada dia/estágio de diferenciação dirigida sobre a matriz e o meio de células-tronco, juntamente com o tampão de secreção de insulina estimulado por glicose. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65530/Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Este artigo apresenta um protocolo para diferenciação dirigida e análise funcional de células semelhantes a células β. Descrevemos as condições e passagens ideais de cultura para células-tronco pluripotentes humanas antes de gerar células pancreáticas produtoras de insulina. A diferenciação em seis estágios progride desde a formação definitiva da endoderme até células funcionais semelhantes às células β que secretam insulina em resposta à glicose.

Protocolo Otimizado para Geração de Células Funcionais Secretoras de Insulina Pancreáticas a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Human pluripotent stem cells (hPSCs) can differentiate into any kind of cell, making them an excellent alternative source of human pancreatic ...

Alcançar uma eficiência alta e consistente no processo de diferenciação para converter células-tronco pluripotentes em células beta humanas é um desafio notável. Esse desafio é influenciado pela precisão e consistência com que o experimentador segue o protocolo. Além disso, a quantidade de células beta obtidas em cada experimento é bastante variável, o que pode resultar na redução da função das células beta ao longo de vários experimentos.No contexto da pesquisa de células beta de leptina alta em diabetes, a disponibilidade de doadores de ilhós cadavéricos é bastante limitada. Consequentemente, o uso de células-tronco beta diferenciadas está oferecendo um suprimento ilimitado e abundante de células secretoras de insulina. A diferenciação de células beta é um avanço fundamental em nosso campo, oferecendo inúmeros benefícios.Ele nos permite explorar o desenvolvimento e a função das células beta, levando a uma compreensão mais profunda das causas do diabetes e da disfunção das células beta. Nosso objetivo é utilizar esta técnica para nossas pesquisas com foco na genética do diabetes. Nosso objetivo primário é focar na mutação de certos genes que podem influenciar as células beta e a função dos ilhós.Assim, esse protocolo facilitará o acesso a ilhós humanos derivados de células-tronco pré-potentes com mutações de interesse.

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Research

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Biology

Biologia

O presente estudo descreve uma abordagem diferenciada dirigida em induzir a diferenciação de pâncreas de células estaminais embrionárias humanas. De grande importância é a constatação de que células endoteliais co-cultura maturação media de células-tronco embrionárias humanas derivadas progenitores pâncreas em células que expressam insulina.

Células endoteliais em co-cultura Maturação media de células estaminais humanas embrionárias a células pancreáticas produtoras de insulina em uma abordagem diferenciada Direção

Aqui, descrevemos um método para a purificação de células-tronco embrionárias humanas diferenciadas que estão comprometidos para a endoderme definitiva para a melhoria das aplicações a jusante e outras diferenciações.

Um método rápido e eficiente para a purificação de células da endoderme Gerado de células estaminais embrionárias humanas

Aqui nós descrevemos um protocolo de 4 estágios para diferenciar as células-tronco embrionárias humanas para NKX6-1 + progenitoras pancreáticas in vitro. Este protocolo pode ser aplicado a uma variedade de linhas de células estaminais pluripotentes humanas.

Diferenciação eficiente dos Pluripotent Stem Cells para NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Progenitores pancreáticas

Este protocolo descreve detalhadamente a geração de células-tronco livre pegada pluripotentes induzidas (iPSCs) de células do pâncreas humanas em condições de livre de alimentador, seguido pela edição usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas e caracterização de modificado clones de célula única.

Eficiente geração e edição de IPSCs livre de alimentador de células pancreáticas humanas utilizando o sistema CRISPR-Cas9

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar insulina expressando 3D pancreatoids murino de progenitores pancreático flutuantes e10.5 dissociada e a mesênquima associada.

Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em proteína de pâncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) células para a geração de linhagens pancreáticas baseiam no crescimento não-colônia tipo monocamada de dissociou células únicas. Este método é adequado para produzir células hPSC-derivado homogêneas, a manipulação genética e rastreio.

Eficiente geração de pâncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ Posterior Foregut/pancreático progenitores de hPSCs em culturas de adesão

Este protocolo apresenta uma comparação entre dois protocolos de indução diferentes para diferenciar células-tronco de polpa dentária humana (hDPSCs) em relação a linhagens pancreáticas in vitro: o protocolo integrativo e o protocolo não integrativo. O protocolo integrativo gera mais células produtoras de insulina (IPCs).

In vitro Indução de células-tronco de polpa dentária humanas em direção a linhagens pancreáticas

O presente protocolo descreve um método aprimorado para aumentar a co-expressão dos fatores de transcrição PDX1 e NKX6.1 em progenitores pancreáticos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em monocamadas planares. Isto é conseguido reabastecendo a matriz fresca, manipulando a densidade celular e dissociando as células endodérmicas.

Diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em precursores de células beta pancreáticas em um sistema de cultura 2D

A diferenciação de células-tronco em ilhotas fornece uma solução alternativa ao tratamento convencional do diabetes e à modelagem da doença. Descrevemos um protocolo detalhado de cultura de células-tronco que combina um kit de diferenciação comercial com um método previamente validado para auxiliar na produção de ilhotas derivadas de células-tronco secretoras de insulina em um prato.

Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Humanas em Aglomerados de Ilhotas Produtoras de Insulina

Fornecemos um protocolo minimamente invasivo para o transplante intramuscular de ilhéus de células-tronco pancreáticas derivadas de células-tronco humanas em camundongos imunodeficientes, para implantação in vivo e análise posterior.

Transplante Intramuscular de Células Endócrinas Pancreáticas Derivadas de Células-Tronco Humanas Pluripotentes em Camundongos

Aprenda a diferenciação direcionada de células-tronco pluripotentes humanas em células beta produtoras de insulina. Este protocolo de seis etapas gera aglomerados funcionais que secretam insulina em resposta à glicose, com aplicações terapêuticas para diabetes.

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