Name: Metabolômica Direcionada Baseada em Cromatografia Gasosa e Espectrometria de Massas de Amostras de Corais Duros (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprenda a realizar metabolômica direcionada por GC-MS em corais duros, separando tecido do hospedeiro e células de Symbiodiniaceae. Este método revela interações metabólicas do holobionte coralino para estudos de resiliência.

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J.L.M. foi apoiado por uma bolsa de pesquisa do Chanceler da UTS.

Perfil de metabólitos de amostras de coral duro usando GC-MS

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

A separação do hospedeiro e do simbionte é fácil e rapidamente alcançável através de centrifugação simples, e os resultados aqui mostram que a separação das frações pode fornecer informações valiosas indicativas de contribuições específicas dos membros do holobionte, o que pode contribuir para a análise funcional da saúde dos corais. Em corais adultos, a síntese lipídica é realizada primariamente pelo simbionte algal residente 40, que fornece lipídios (por exemplo, triacilgliceróis e fosfolipídios)41 e ácidos gr...

Metabólitos representam os produtos finais dos processos celulares, e a metabolômica - o estudo do conjunto de metabólitos produzidos por um determinado organismo ou ecossistema - pode fornecer uma medida direta do funcionamento do organismo1. Isso é particularmente crítico para explorar ecossistemas, interações simbióticas e ferramentas de restauração, já que o objetivo da maioria das estratégias de manejo é preservar (ou restaurar) funções específicas de serviços ecossistêmicos2. Os recifes de coral são um ecossistema aquático que demonstra o valor potencial da metabolômica para elucidar interações simbióticas e ligar as respostas fisiológicas dos corais aos impactos em nível de comunidade e ecossistema3. A aplicação de cromatografia gasosa de alto rendimento-espectrometria de massas (GC-MS) é especialmente valorizada devido à sua capacidade de analisar rapidamente uma ampla gama de classes de metabólitos simultaneamente com alta seletividade e sensibilidade, fornecer rápida identificação de compostos quando bibliotecas espectrais estão disponíveis e fornecer um alto nível de reprodutibilidade e precisão, com um custo relativamente baixo por amostra.
Os corais são holobiontes constituídos pelo animal coral, endossimbiontes dinoflagelados fotossintéticos (família: Symbiodiniaceae4) e um microbioma complexo 5,6. De modo geral, a aptidão do holobionte é mantida principalmente através da troca de pequenas moléculas e elementos para apoiar o funcionamento metabólico de cada membro 7,8,9,10. As abordagens metabolômicas têm se mostrado especialmente poderosas para elucidar as bases metabólicas da especificidade da simbiose9,11, a resposta clareadora ao estresse térmico 7,8,12,13, as respostas à doença 14, as respostas à exposição à poluição 15, a fotoaclimatação 16 e a sinalização química 17 em corais, além de auxiliar na descoberta de biomarcadores 18,19. Além disso, a metabolômica pode fornecer confirmação valiosa das conclusões inferidas a partir de técnicas baseadas em DNA eRNA9,20. Há, portanto, considerável potencial para o uso de metabolômicas para avaliar a saúde recifal e desenvolver ferramentas para a conservação recifal3, como por meio da detecção de biomarcadores metabólicos de estresse18,19 e para examinar o potencial de estratégias de manejo ativo, como subsídios nutricionais21.
Separar as células hospedeiras e simbiontes e analisar seus perfis metabólicos de forma independente, em vez de juntos como o holobionte, pode fornecer mais informações sobre as interações do parceiro, estados fisiológicos e metabólicos independentes e potenciais mecanismos moleculares de adaptação 11,12,22,23,24. Sem separar o coral e Symbiodiniaceae, é quase impossível elucidar a contribuição e o metabolismo de corais e/ou Symbiodiniaceae de forma independente, exceto com reconstrução complexa do genoma e modelagem metabólica25, mas isso ainda não foi aplicado à simbiose coral-dinoflagelado. Além disso, tentar extrair informações sobre o metabolismo individual do hospedeiro ou simbionte algal do perfil de metabólitos do holobionte pode levar a interpretações errôneas.
Por exemplo, até recentemente, acreditava-se que a presença de ácidos graxos poli-insaturados C18:3n-6, C18:4n-3 e C16 em extratos de tecidos de coral e holobionte era derivada do simbionte algal, pois os corais eram assumidos como não possuindo as desaturases ωx essenciais para a produção de ácidos graxos ômega-3 (ω3); no entanto, evidências genômicas recentes sugerem que múltiplos cnidários têm a capacidade de produzir PUFA ω3 de novo e biossintetizar PUFA ω3 de cadeia longa26. A combinação de GC-MS com marcação isotópica estável (por exemplo, 13 C-bicarbonato, NaH 13CO 3) pode ser usada para rastrear o destino do carbono fotossinteticamente fixado através de redes metabólicas holobiont de coral sob condições de controle e em resposta a estressores externos27,28. No entanto, um passo crítico no rastreamento do destino de 13 C é a separação do tecido coral das células de algas - só então a presença de um composto marcado com 13C na fração hospedeira do coral pode ser inequivocamente atribuída como um metabólito derivado de Symbiodiniaceae translocado para o coral ou um produto a jusante de um composto marcado translocado. Essa técnica demonstrou seu poder ao desafiar a suposição de longa data de que o glicerol é a forma primária na qual a fotossíntese é translocada do simbionte para o hospedeiro29, bem como elucidar como o fluxo nutricional entre parceiros muda durante o clareamento27,28 e em resposta a espécies incompatíveis de Symbiodiniaceae11.
Embora a decisão de separar tecidos seja impulsionada principalmente pela questão de pesquisa, a praticidade, a confiabilidade e os potenciais impactos metabólicos dessa abordagem são importantes a serem considerados. Aqui, nós fornecemos métodos detalhados e demonstrados para a extração de metabólitos do holobionte, bem como as frações separadas do hospedeiro e do simbionte. Nós comparamos os perfis de metabólitos do hospedeiro e simbionte independentemente e como esses perfis se comparam com o perfil de metabólitos holobiontes.

<table><tbody><tr><td>100% de metanol de grau LC</td><td>Merck</td><td>439193</td> tubos de microcentrífuga <td>essenciais de grau LC de</td></tr><tr><td>2 mL, PP</td><td>Eppendorf</td><td>30121880</td><td>Polipropileno oferece alta resistência a produtos químicos, estresse mecânico e temperaturas extremas</td></tr><tr><td>Cromatógrafo gasoso Shimadzu 2030</td><td>Shimadzu</td><td>GC-2030</td><td></td></tr><tr><td>710-1180 &micro; m contas de vidro lavadas com ácido</td><td>Merck</td><td> G1152</td><td>Este tamanho é ideal para quebrar as células Symbiodiniaceae</td></tr><tr><td>AOC-6000 Plus Amostrador automático multifuncional</td><td>Reagente Shimadzu</td><td>AOC6000</td><td></td></tr><tr><td>Bradford</td><td>Merck</td><td>B6916</td><td>Qualquer reagente colorimétrico de proteína é aceitável</td></tr><tr><td>Pistola de ar comprimido</td><td>Ozito</td><td>6270636</td><td>Design semelhante aceitável. Ter um encaixe para encaixar uma ponta de 1 mL é fundamental.</td></tr><tr><td>&nbsp; Coluna DB-5 com coluna de 0,25 mm de diâmetro interno e 1 &micro; m espessura do filme</td><td>Agilent</td><td>122-5013</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td><td>Merck</td><td>RTC000098</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol-6-13C e/ou 13C5&ndash; 15N Valina</td><td>Merck</td><td>605514/ 600148</td><td>Um ou ambos os padrões internos podem ser adicionados ao metanol.</td></tr><tr><td>Placa de fundo plano de 96 poços</td><td>Merck</td><td>CLS3614</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cintilação de vidro</td><td>Merck</td><td>V7130</td><td>20 mL, com vedação não plástica</td></tr><tr><td>Immunoglogin G</td><td>Merck</td><td>56834</td><td>se não estiver disponível, a albumina de soro bovino é aceitável</td></tr><tr><td>Primer</td><td></td><td>v4</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td></td><td>v4.1.2</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu LabSolutions Software</td> <td>Insight</td><td>v3.6</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Merck</td><td>S5881</td><td>Pellets para fazer 1 M solução</td></tr><tr><td>tidyverse</td><td></td><td>v1.3.1</td><td>R pacote</td></tr><tr><td>TissueLyser LT</td><td>Qiagen</td><td>85600</td><td>Ou</td></tr><tr><td>similar TQ8050NX espectrômetro de massa quadrupolo triplo</td><td>Shimadzu</td><td>GCMS-TQ8050 NX</td><td></td></tr><tr><td>UV-96 placa de poço</td><td>Greiner</td><td>M3812</td><td></td></tr><tr><td>Saco de amostra Whirl-Pak Saco</td> de coleta de amostras <td>Merck</td><td>WPB01018WA</td><td>; Tamanho: grande o suficiente para abrigar um fragmento de coral de ~ 5 cm, mas não muito grande para que a água seja muito espalhada</td></tr></tbody></table>

metabolômica direcionada baseada em cromatografia gasosa e espectrometria de massas de amostras de corais duros

Gas Chromatography-Mass Spectrometry-Based Targeted Metabolomics of Hard Coral Samples

Abordagens baseadas em cromatografia gasosa e espectrometria de massas (GC-MS) provaram ser poderosas para elucidar a base metabólica da simbiose cnidário-dinoflagelado e como os corais respondem ao estresse (isto é, durante o branqueamento induzido pela temperatura). O perfil de metabólitos em estado estacionário do holobionte do coral, que compreende o hospedeiro cnidário e seus micróbios associados (Symbiodiniaceae e outros protistas, bactérias, arqueias, fungos e vírus), tem sido aplicado com sucesso sob condições ambientais e de estresse para caracterizar o estado metabólico holístico do coral.
No entanto, para responder às questões que envolvem as interações simbióticas, é necessário analisar os perfis de metabólitos do hospedeiro coral e seus simbiontes algais de forma independente, o que só pode ser alcançado pela separação física e isolamento dos tecidos, seguido de extração e análise independentes. Embora a aplicação da metabolômica seja relativamente nova no campo dos corais, os esforços sustentados de grupos de pesquisa resultaram no desenvolvimento de métodos robustos para analisar metabólitos em corais, incluindo a separação do tecido hospedeiro dos corais e dos simbiontes algais.
Este artigo apresenta um guia passo-a-passo para a separação de holobiontes e a extração de metabólitos para análise de CG-EM, incluindo os principais passos de otimização para consideração. Demonstramos como, uma vez analisado independentemente, o perfil combinado de metabólitos das duas frações (coral e Symbiodiniaceae) é semelhante ao perfil do todo (holobionte), mas separando os tecidos, também podemos obter informações importantes sobre o metabolismo e as interações entre os dois parceiros que não podem ser obtidas do todo isoladamente.

Todos os dados produzidos durante este trabalho estão disponíveis nas informações complementares.
Separação simbionte hospedeiro
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65628/65628fig01.jpg"> Figura 1: Configuração e validação da separação dos tecidos hospedeiros dos corais e das células de Symbiodiniaceae. (A) A configura...

Aqui, apresentamos a extração e preparação de metabólitos polares e semipolares de um holobionte de coral, bem como tecido hospedeiro coral separado e frações celulares de Symbiodiniaceae, para análise por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas.

Metabolômica Direcionada Baseada em Cromatografia Gasosa e Espectrometria de Massas de Amostras de Corais Duros

Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based approaches have proven to be powerful for elucidating the metabolic basis of the ...

Como acontece com todos os organismos, os corais dependem de nutrição superlativa para crescer e construir recifes para imunidade e reprodução e para suportar as mudanças nas condições ambientais. Mas sabemos muito pouco sobre a nutrição ideal para corais em condições normais ou em mudança, e como cada membro do holobiont coral contribui para esse estado nutricional. Os corais são holobiontes compostos pelo hospedeiro e vários microrganismos simbióticos.Estes incluem Symbiodiniaceae, protistas, bactérias, vírus e fungos. A aptidão do holobiont depende das interações metabólicas entre esses membros. Por exemplo, Symbiodiniaceae fornecem fotossíntese para apoiar o metabolismo do hospedeiro e ajudá-lo a se adaptar às condições de mudança.Para entender essa parceria crucial, precisamos estudar a composição química e metabólica de cada parceiro separadamente. Esses achados demonstraram que mais informações poderiam ser obtidas separando-se as frações hospedeiro e simbionte para análise metabólica. No entanto, a decisão de analisar frações separadas versus o holobionte é, em última análise, regida pela questão de pesquisa.Assim, nos casos em que a análise do holobionte é preferível, fornecemos uma metodologia para extrações do metabólito do holobionto e sugestões para obter o máximo de informações possível durante a análise. Os métodos utilizados neste estudo abrem novos caminhos para a pesquisa. Estes incluem revelar potenciais biomarcadores, identificar metabólitos chave durante estágios de vida específicos ou condições de estresse, compreender as vantagens de se associar a certas espécies e explorar interações dentro do holobionte.Pesquisas futuras se concentrarão na aplicação dos protocolos aqui estabelecidos a diversas áreas de pesquisa, incluindo a detecção de biomarcadores com aplicações na conservação e restauração de recifes de coral. Esta metodologia também pode ser aplicada onde a separação de frações não é possível para outras medidas fisiológicas. Por exemplo, ao analisar as emissões de metabólitos voláteis das colônias de corais.

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Research

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Biology

Biologia

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