Name: Purificação por Afinidade de uma Enzima Fibrinolítica de Sipunculus nudus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Aprenda a purificação por afinidade de enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus usando cromatografia com arginina ou lisina. Este método simples e eficiente facilita aplicações biotecnológicas e pesquisas em bioquímica.

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Esta pesquisa foi financiada pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Cidade de Xiamen (3502Z20227197) e pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Fujian (No. 2019J01070, No.2021Y0027).

1. Preparo
<ol><li>Tratamento da amostra<ol><li>Dissecar cuidadosamente S. nudus fresco (100 g) e coletar o intestino e seu líquido interno.</li>
		<li>Adicionar 300 mL de tampão Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) para homogeneização (1.000 rpm, 60 s).</li>
		<li>Congelar-descongelar o homogeneizado 3x.</li>
		<li>Centrifugar a amostra (10,956 × g, 0,5 h, 4 °C) e recolher o sobrenadante. Conservar a amostra a 4 °C até nova utilização.</li>
	</ol></li>
	<li>Precipitação proteica<ol><li>Misture o sobrenadante com uma solução saturada de sulfato de amónio (nove volumes) e deixe repousar durante 12 h a 4 °C. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui e continuado mais tarde.</li>
		<li>Centrífuga (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) para obtenção do precipitado proteico; armazená-lo a 4 °C para uso posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Ressuspensão proteica<ol><li>Ressuspender o precipitado proteico com 30 mL de tampão Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4). Conservar esta solução de proteína bruta a 4 °C para utilização posterior.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cromatografia de afinidade
<ol><li>Filtração de soluções<ol><li>Filtrar a solução de proteína bruta através de uma membrana filtrante de 0,22 μm. Conservar esta amostra a 4 °C para utilização posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Embalagem em coluna<ol><li>Embalar a coluna de cromatografia de afinidade de matriz de arginina-agarose e a coluna de cromatografia de afinidade de matriz de lisina-agarose carregando uma quantidade adequada de meio de matriz de lisina-agarose e meio de matriz de arginina-agarose em colunas vazias de cromatografia de 5 mL. NOTA: A coluna pode ser armazenada a 2-8 °C, com a matriz imersa em tampão de armazenamento (etanol 20%).</li>
	</ol></li>
	<li>Purificação de afinidade<ol><li>Equilibrar a coluna de cromatografia de afinidade com ddH2O primeiro (1 mL/min, 10 volumes de coluna), seguido por tampão Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, 1 mL/min, volumes de 5 colunas).</li>
		<li>Carregar a amostra de solução proteica na coluna pré-equilibrada (1 mL/min, volume de 1/3 de coluna). NOTA: O volume de carregamento da amostra depende da concentração de sFE.</li>
		<li>Lavar a coluna com tampão Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, cinco volumes de coluna).</li>
		<li>Eluir a coluna com NaCl de 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M e 0,65 M (1 mL/min, cinco volumes de coluna) sucessivamente.</li>
		<li>Procure o pico de eluição que deve aparecer na eluição de NaCl 0,15 M e, em seguida, colete as frações em tubos de 5 mL.</li>
		<li>Concentrar a amostra de eluição utilizando um filtro ultracentrífugo de 3 kD (3,944 × g, 1,5 h, 4 °C). Conservar esta amostra a -80 °C para utilização posterior.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Avaliação da pureza
<ol><li>Preparação de gel de poliacrilamida em gel de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE)<ol><li>Preparar o gel SDS-PAGE de acordo com o método de Laemmli utilizando gel concentrado a 5% e gel de separaçãoa 12% 13.</li>
	</ol></li>
	<li>Eletroforese<ol><li>Misturar a amostra (15 μL) com 5x tampão de carregamento de proteína SDS-PAGE (1/4 volume), aquecer em água fervente por 5 min, carregar no gel SDS-PAGE e passar o gel a 80 V, 60 mA por 1,5 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise<ol><li>Após a eletroforese, corar o gel com um Silver Stain Kit, de acordo com o protocolo do fabricante, e observar o gel corado usando um sistema de imagem quimioluminescente.</li>
		<li>Analise a pureza da proteína-alvo utilizando a seguinte fórmula: pureza da proteína-alvo = valor da intensidade da proteína-alvo/valor da intensidade da proteína total.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Avaliação da atividade fibrinolítica
<ol><li>Preparo da placa de fibrina<ol><li>Preparar a solução de fibrinogênio misturando 25 mg de fibrinogênio com 1,25 mL de solução salina fisiológica.</li>
		<li>Preparar a solução de trombina misturando completamente 100 U de trombina com 1,05 mL de soro fisiológico.</li>
		<li>Preparar a solução de agarose adicionando 0,5 g de agarose a 22,5 ml de tampão Tris-HCl (0,02 mol/L, pH 7,4). Misturar e aquecer a solução de agarose a 100 °C até dissolver completamente.</li>
		<li>Arrefecer a solução de agarose até cerca de 50 °C e adicionar a solução de fibrinogénio. Em seguida, adicione imediatamente a solução de trombina, misture-os rapidamente e despeje-os em uma placa de cultura de 60 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Carregamento<ol><li>Perfurar poços de 3 mm nas placas de fibrina preparadas usando uma broca estéril e encher os poços com amostras de 10 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise<ol><li>Após 18 h de incubação a 37 °C, medir a atividade fibrinolítica calculando o tamanho de suas zonas de degradação. Atividade fibrinolítica = (tamanho da zona da amostra/ tamanho da zona da uroquinase) x 100 U. Tamanho da zona = diâmetro x diâmetro. OBS: Tampão fisiológico salino, proteína bruta (amostra obtida no protocolo passo 1.3.1) e uroquinase foram utilizados para o controle branco, negativo e positivo, respectivamente. Em comparação com a uroquinase, observamos que a atividade fibrinolítica do FE purificado foi de ~19.200 U/mL.</li>
	</ol></li>
</ol>

Purificação de uma enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus via cromatografia de afinidade

<ol><li>Rosell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients+with+COVID-19+have+elevated+levels+of+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+activity+that+is+associated+with+severity+and+mortality-brief+report%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).</li>
<li>Schultz, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombosis+and+thrombocytopenia+after+ChAdOx1+nCoV-19+vaccination.+The+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England.</a> Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).</li>
<li>von Kaulla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urokinase-induced+fibrinolysis+of+human+standard+clots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots.</a> Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).</li>
<li>Van de Werf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+thrombolysis+with+tissue-type+plasminogen+activator+in+patients+with+evolving+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).</li>
<li>Schaller, J., Gerber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmin-antiplasmin+system%3A+structural+and+functional+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).</li>
<li>Ge, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+antithrombotic+protease+from+marine+worm+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023(2018).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+novel+fibrinolytic+enzyme+from+culture+supernatant+of+Pleurotus+ostreatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).</li>
<li>Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starase%3A+A+bi-functional+fibrinolytic+protease+from+hepatic+caeca+of+Asterina+pectinifera+displays+antithrombotic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential.</a> Biochimie. 105, 45-57 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fibrinolytic+protein+From+Pheretima+vulgaris%3A+purification%2C+identification%2C+antithrombotic+evaluation%2C+and+mechanisms+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419(2022).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant%2C+hypolipidemic+and+hepatic+protective+activities+of+polysaccharides+from+Phascolosoma+esculenta%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta.</a> Marine Drugs. 18 (3), 158(2020).</li>
<li>Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en">https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en</a> (2019).</li>
<li>Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+expressed+differentially+in+female+and+male+gametes+of+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus.</a> Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).</li>
<li>Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+renature+DNA-binding+proteins+separated+by+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).</li>
<li>Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+barcoding+reveals+cryptic+diversity+in+the+peanut+worm+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).</li>
<li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen-plasmin+system.+I.+Purification+and+properties+of+human+plasminogen%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).</li>
<li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen-plasmin+system.+II.+Purification+and+properties+of+human+plasmin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).</li>
<li>Wiman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-chromatographic+purification+of+human+%CE%B12-antiplasmin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin.</a> The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).</li>
<li>Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+and+characterization+of+a+new+fast-acting+plasmin+inhibitor+from+human+platelets.+Evidence+for+non-identity+with+the+known+plasma+proteinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors.</a> The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).</li>
<li>Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+plasma%2Fcellular+fibronectin+and+fibronectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments.</a> Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).</li>
<li>Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+and+purification+of+human+recombinant+tissue+type+plasminogen+activator+%28rt-PA%29+from+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Preparative+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants.</a> Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).</li>
<li>Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+abnormalities+of+human+plasminogen+isolated+from+synovial+fluid+of+rheumatoid+arthritis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients.</a> Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Devido à indisponibilidade da sequência exata do gene sFE, o FE atualmente utilizado foi extraído de S. nudus fresco 14. Além disso, os procedimentos de purificação da FEs relatados na literatura foram complicados e dispendiosos, pois se basearam em algumas características gerais da FEs, como peso molecular, ponto isoelétrico, força iônica e polaridade15,16. Nenhum protocolo de purificação de afinidade de FEs foi relatado até o mo...

A trombose é uma grande ameaça à saúde pública, especialmente após a pandemia global de Covid-19 1,2. Clinicamente, muitos ativadores do plasminogênio (APs), como o ativador do plasminogênio tecidual (tPA) e a uroquinase (UK), têm sido amplamente utilizados como trombolíticos. Os APs podem ativar o plasminogênio dos pacientes em plasmina ativa para degradar a fibrina. Assim, sua eficácia trombolítica é fortemente limitada pelo estado plasminogênico dos pacientes 3,4. Os agentes fibrinolíticos, como a plasmina metaloproteinase e a serina plasmina, são outro tipo de trombolítico clínico que também inclui enzimas fibrinolíticas (EG), como a plasmina, que podem dissolver diretamente os coágulos, mas são rapidamente inativados por vários inibidores de plasmina5. Posteriormente, um novo tipo de agente fibrinolítico foi relatado que pode dissolver o trombo não apenas ativando o plasminogênio em plasmina, mas também degradando diretamente a fibrina 6-a enzima fibrinolítica do antigo verme do amendoim Sipunculus nudus (sFE)6. Essa bifunção confere ao sFE outras vantagens em relação aos trombolíticos tradicionais, especialmente em termos de estado anormal do plasminogênio. Comparado a outros fibrinolíticos bifuncionais 7,8,9, o FE apresenta várias vantagens, incluindo segurança, sobre agentes não derivados de alimentos para o desenvolvimento de fármacos, especialmente para drogas orais. Isso porque a biossegurança e a biocompatibilidade de Sipunculus nudus estão bem estabelecidas10.
Assim como outros fibrinolíticos naturais isolados de microrganismos, minhocas e cogumelos, a purificação do FEs de S. nudus é muito complicada e inclui múltiplas etapas, como homogeneização tecidual, precipitação com sulfato de amônio, dessalinização, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica e peneiramento molecular10,11,12. Tal sistema de purificação não depende apenas de habilidades proficientes e materiais caros, mas também requer vários dias para concluir todo o procedimento. Portanto, um simples programa de purificação de sFE é de grande importância para o desenvolvimento posterior de sFE. Felizmente, dois cristais de sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) foram obtidos com sucesso (ver Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2). Através de análises estruturais e experimentos de acoplamento molecular, descobrimos que o núcleo catalítico do sFE poderia se ligar especificamente a alvos contendo resíduos de arginina ou lisina.
Neste trabalho, um sistema de purificação por afinidade foi proposto pela primeira vez, baseado na estrutura cristalina do sFE. Seguindo este protocolo, o FE altamente puro e altamente ativo pôde ser purificado dos extratos brutos em um único estágio de purificação por afinidade. O protocolo aqui desenvolvido não é apenas importante para a preparação em larga escala de FEf, mas também pode ser aplicado para a purificação de outros agentes fibrinolíticos.

<table><tbody><tr><td>30% Acrilamida-Bisacrilamida (29:1)</td><td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose G-10</td><td>Biowest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>SINOPHARM</td> Sulfato de amônio SINOPHARM <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Arginina-Sepharose <td></td><td></td></tr><tr><td>4B</td><td>Solarbio</td><td>Matriz de arginina-agarose</td><td></td></tr><tr><td>Bromoxilenol Azul (BPB)</td> <td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fast Silver Stain Kit</td><td>Beyotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogênio</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quinase</td><td>RHAWN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lisina-Sepharose 4B</td><td>Matriz Solarbio</td><td>Lisina-agarose</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td>Marcador de Proteína de Cor Prestained <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(10-170 kD)</td>Cloreto de sódio <td>Beyotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfonato de Sódio (SDS)</td><td>Hidróxido de</td> sódio Sigma-Aldrich <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Meilunbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris (Hidroximetil) Aminometano</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris (Hidroximetil) Cloridrato de Aminometano</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKT Sistema de Purificação de Aprotein</td><td>GE</td><td></td><td></td> puro</tr><tr><td>Esterilizador a vapor de pressão vertical automática MLS-3750</td><td>Sistema de</td> imagem de quimioluminescência SANYO <td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de fluxo constante GE</td><td></td> BT-100 QITE <td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de temperatura constante</td><td>JINGHONG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada de mesa 3-30KS</td><td>SIGMA</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> DHG Series Forno de aquecimento e secagem <td></td><td></td></tr><tr><td> DGG-9140AD</td><td>SENXIN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de vidro elétrico DY89-II</td><td>SCIENTZ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balança analítica eletrônica</td><td>DENVER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria eletrotermostático DK-S12</td><td>SENXIN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador de descoloração horizontal</td><td>Kylin-Bell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina de gelo AF 103</td><td>Scotsman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KQ-500E Limpador Ultrassônico</td><td>Agitador Magnético Zhi</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>wei</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Centrífuga Refrigerada H1650-W</td><td>Forno</td> de Microondas Cence <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Galanz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Referência</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH de Mesa de Precisão</td><td>Sartorious</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oscilador de Vórtice de Tamanho Pequeno</td> Sistema de Eletroforese <td>Vertical Kylin-Bell</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material Consumível&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L Tubo de PCR (200 &micro; L)</td> Tubo de Centrífuga <td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1,5 mL)</td> Tubo de Centrífuga <td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(5 mL)</td> Tubo de Centrífuga <td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(50 mL)</td><td></td> Tubo de Centrífuga NEST <td></td><td></td></tr><tr><td>(7 mL)</td> Placa de Cultura <td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(60 mm)</td><td></td> Membrana de Filtro NEST <td></td><td></td></tr><tr><td>(0,22 &micro; m)</td>Ponta de Pipeta <td>Millex GP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1 mL)</td> Ponta de Pipeta <td>KIRGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(10 &micro; L)</td><td>Ponta de Pipeta Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(200 &micro; L)</td> Papel Indicador Especial <td>Axygene</td><td></td><td></td></tr> Unidade de <tr><td>Filtro Ultra Centrífugo TZAKZY</td><td></td> (15 mL 3 KDa)Unidade de Filtro Ultra Centrífuga Millipore <td></td><td></td></tr><tr><td>(4 mL 3 KDa)</td><td>Reagente</td> SSS Indicador Universal de pH Millipore <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

purificação por afinidade de uma enzima fibrinolítica de sipunculus nudus

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

A enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus (sFE) é um novo agente fibrinolítico que pode tanto ativar o plasminogênio em plasmina quanto degradar a fibrina diretamente, apresentando grandes vantagens sobre os trombolíticos tradicionais. No entanto, devido à falta de informações estruturais, todos os programas de purificação para sFE são baseados em purificações por cromatografia em várias etapas, que são muito complicadas e caras. Aqui, um protocolo de purificação por afinidade de sFE é desenvolvido pela primeira vez baseado em uma estrutura cristalina de sFE; inclui a preparação da amostra bruta e da coluna de cromatografia de afinidade da matriz lisina/arginina-agarose, purificação por afinidade e caracterização do FE purificado. Seguindo este protocolo, um lote de sFE pode ser purificado dentro de 1 dia. Além disso, a pureza e a atividade do FE purificado aumentam para 92% e 19.200 U/mL, respectivamente. Assim, esta é uma abordagem simples, barata e eficiente para purificação de sFE. O desenvolvimento deste protocolo é de grande importância para a posterior utilização de sFE e outros agentes similares.

Seguindo este protocolo, lisados teciduais brutos foram extraídos, colunas de cromatografia de afinidade com matriz de arginina-agarose e matriz de lisina-agarose foram construídas, FE purificado foi obtido e a pureza e atividade fibrinolítica do FE purificado foram medidas por SDS-PAGE e placas de fibrina, respectivamente.
Após a centrifugação, o sobrenadante coletado foi um líquido viscoso bronzeado transparente. A precipitação iniciou-se quando este sobrenadante foi misturado com solução sa...

Aqui, apresentamos um método de purificação por afinidade de uma enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus que é simples, barato e eficiente.

Purificação por Afinidade de uma Enzima Fibrinolítica de Sipunculus nudus

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...

Nossa pesquisa é principalmente sobre a purificação da enzima fibrinolítica. Este trabalho tenta estabelecer um método simples de purificação da enzima fibrinolítica. Neste trabalho, relatamos pela primeira vez um sistema de purificação de melhor afinidade de arginina ou lisina da enzima fibrinolítica.Em comparação com os métodos convencionais de purificação, esta é uma abordagem simples, barata e eficiente para a purificação de enzimas fibrinolíticas de Sipunculus nudus. O desenvolvimento deste protocolo é de maior importância para a posterior utilização de enzimas fibrinolíticas de Sipunculus nudus e outros agentes similares.

affinity-purification-of-a-fibrinolytic-enzyme-from-sipunculus-nudus

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Mama é uma proteína Magnetosome único associado que foi mostrado para ser envolvido na ativação magnetosome. Aqui apresentamos o protocolo de purificação da Mama exclusão mutante (MamAΔ41)...

Purificação do M. magneticum Strain AMB-1 proteína associada Magnetosome MamAΔ41

Tandem purificação por afinidade é uma abordagem robusta para a identificação de parceiros de ligação às proteínas. Como prova de conceito, este método foi aplicado ao bem caracterizado eIF4E factor de iniciação da tradução para o co-precipitado os factores de células hospedeiras envolvido na iniciação da tradução. Este método é facilmente adaptado a qualquer proteína celular ou virai.

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

Proteína de integrase espumosa vírus recombinante protótipo é frequentemente contaminada com uma nuclease bacteriana durante a purificação. Este método identifica a contaminação da nuclease e remove-lo a preparação final da enzima.

Deteção e remoção de contaminação de Nuclease durante a purificação do protótipo recombinante vírus espumoso Integrase

Este protocolo descreve como extrair a proteína de domínio de hidrolase 1 (FAHD1) de rim suíno e fígado de camundongo. Os métodos listados podem ser adaptados a outras proteínas de interesse e modificados para outros tecidos.

Extração e Purificação da Proteína FAHD1 do fígado de rim suíno e rato

Este artigo fornece um procedimento para a purificação de afinidade de uma proteína recombinante humana, a endonuclease 1 (FEN1), que foi marcada com uma marca de 6X-histidina. O protocolo envolve a utilização de duas colunas distintas de íons metálicos imobilizados para a purificação da proteína marcada.

Purificação de afinidade de uma proteína marcada com 6X-His usando um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida 

Aqui, apresentamos um protocolo de eletroforese em gel de fibrinogênio-poliacrilamida (PAGE) para separar e exibir rapidamente os agentes fibrinogenolíticos de Sipunculus nudus.

Separação Rápida e Exibição de Agentes Fibrinogenolíticos Ativos em Sipunculus nudus por meio de Eletroforese em Gel de Fibrinogênio-Poliacrilamida

Este artigo descreve uma metodologia para superexpressar Nsp15 recombinante, uma nuclease tóxica, em um sistema de expressão C41 (DE3), seguido de purificação da proteína marcada utilizando cromatografia de afinidade e exclusão de tamanho. Esses protocolos podem ser adaptados para outras proteínas tóxicas desafiadoras.

Superexpressando e purificando uma nuclease tóxica de Escherichia coli

Um protocolo para a produção, purificação e uso de vesículas de membrana externa (OMV) empacotadas com enzimas, proporcionando maior estabilidade enzimática para implementação em diversas aplicações, é apresentado.

Dirigido Embalagem Proteína da Membrana Externa no interior de vesículas<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Concepção, produção e purificação

Aqui descrevemos protocolos para romper as células de mamíferos por moagem em estado sólido a uma temperatura criogénica, produzem um extracto celular a partir do pó de células resultante, e isolar complexos proteína de interesse por captura de afinidade sobre esferas paramagnéticas escala mícron acoplado com anticorpo.

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Descrevemos aqui um método novo, robusto e eficiente de purificação por afinidade em tandem (TAP) para a expressão, isolamento e caracterização de complexos proteicos de células eucarióticas. Este protocolo pode ser utilizado para a caracterização bioquímica de complexos discretos, bem como a identificação de novos interagentes e modificações pós-traducionais que regulam sua função.

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

Aprenda a purificação por afinidade de enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus usando cromatografia com arginina ou lisina. Este método simples e eficiente facilita aplicações biotecnológicas e pesquisas em bioquímica.

Purificação por Afinidade de uma Enzima Fibrinolítica de Sipunculus nudus

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