Name: Fabricação de grades revestidas de grafeno monocamada para microscopia crioeletrônica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprenda a fabricar grades revestidas com monocamada de grafeno para microscopia crioeletrônica. Este protocolo reduz ruído de fundo e preserva amostras biológicas, permitindo produção em massa em um único dia.

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Agradecemos ao Dr. Xiao Fan pelas discussões úteis ao estabelecer esses métodos na Scripps Research. B.B. foi apoiado por uma bolsa de pesquisa de pós-doutorado da Fundação Hewitt para Pesquisa Médica. W.C. é apoiado por uma bolsa de pré-doutorado da National Science Foundation. O D.E.P é apoiado pelo NS095892 de concessão do National Institutes of Health (NIH) ao G.C.L. Este projeto também foi apoiado por subsídios do NIH GM142196, GM143805 e S10OD032467 para G.C.L.

Revestindo grades TEM com uma monocamada de grafeno

<ol><li>Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+electron+dose+rate+on+electron+counting+images+recorded+with+the+K2+camera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera.</a> Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).</li>
<li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 1-22 (2018).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSPARC%3A+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li>
<li>Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+individual+atoms+of+protein+complex+by+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy.</a> Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).</li>
<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li>
<li>Schultz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).</li>
<li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins%2C+interfaces%2C+and+cryo-em+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+%26+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Proteins, interfaces, and cryo-em grids.</a> Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).</li>
<li>Glaeser, R. M., Han, B. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion%3A+hazards+faced+by+macromolecules+when+confined+to+thin+aqueous+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films.</a> Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).</li>
<li>Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer-crystal+streptavidin+support+films+provide+an+internal+standard+of+cryo-EM+image+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality.</a> Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, 1-42 (2018).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).</li>
<li>Liu, N., Wang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+cryo-EM+specimen+preparation%3A+how+to+deal+with+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface.</a> Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926(2022).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).</li>
<li>Palovcak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+robust+procedure+for+preparing+graphene-oxide+cryo-EM+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).</li>
<li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+carbon+films+with+%7E500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li>
<li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide%3A+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).</li>
<li>Pantelic, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene%3A+substrate+preparation+and+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene: substrate preparation and introduction.</a> Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).</li>
<li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+towards+an+optimal+specimen+support+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).</li>
<li>Passmore, L. A., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+preparation+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Specimen preparation for high-resolution cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+monolayer+graphene+grids+for+near-atomic+resolution+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+ultraclean+atomically+thin+membranes+for+atomic-resolution+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 541(2020).</li>
<li>Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhn%2C+E+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. (Cvd), (2021).</li>
<li>Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li>
<li>Fan, H., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+graphene+grids+for+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Developing graphene grids for cryoelectron microscopy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253(2022).</li>
<li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> eLife. 8, e42747(2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+copper+step+beams+during+graphene+growth+by+CVD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Surface+Science%22%5BJournal%5D)">Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method.</a> Applied Surface Science. 610, 155518(2023).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+thin+ice+on+ultraflat+graphene+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM.</a> Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).</li>
<li>Fujita, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxidized+graphene+grid+for+highly+efficient+high-resolution+cryoEM+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis.</a> Scientific Reports. 13, 2279(2023).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+graphene+grids+with+various+charges+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM.</a> Nature Communications. 13, 6718(2022).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

A preservação de amostras biológicas em uma fina camada de gelo vítreo é um passo criticamente importante para a determinação da estrutura crioEM de alta resolução. No entanto, os pesquisadores frequentemente encontram problemas decorrentes das interações com o AWI, que introduz orientação preferencial, desmontagem complexa, desnaturação e agregação. Além disso, as amostras nem sempre podem ser concentradas o suficiente para povoar o gelo fino suspenso através dos orifícios de um filme fenestrado. Vários grupos de pesquisa têm desenvolvido métodos para revestir grades de EM com uma monocamada de grafeno para ajudar a superar algumas dessas limitações24,25,26,27,28,29,30, e grades de grafeno têm sido utilizadas com grande sucesso. Aqui, fornecemos instruções passo a passo para preparar efetivamente lotes de grades de grafeno internamente e examinar a qualidade das grades de grafeno por TEM. Ressaltamos que um cuidado especial deve ser exercido durante algumas das etapas críticas, que descrevemos a seguir.
O grafeno tem uma forte tendência a atrair contaminantes transportados pelo ar. Portanto, durante o processo de fabricação da grade de grafeno, é importante certificar-se de que todas as ferramentas que entram em contato com a folha de grafeno/ou as grades estejam limpas e livres de poeira. As tampas de vidro usadas para transferir grafeno podem ser limpas enxaguando com etanol e água DI ou usando um air-duster. Também é aconselhável trabalhar sob um exaustor de fumaça e manter folhas e grades de grafeno cobertas com papel alumínio ou uma placa de vidro limpa o tempo todo. Poeira ou contaminantes nas grades podem impedir que o grafeno adera completamente às grades EM. Ao manusear grades revestidas de grafeno ou grafeno, é importante estar aterrado eletricamente para evitar danos ao filme de grafeno por descarga estática. A descarga estática pode ser evitada com o uso de uma alça de aterramento do pulso, o toque em um objeto metálico aterrado cada vez que as grades de grafeno ou grafeno são manuseadas e/ou o não uso de luva na mão que segura a pinça24.
Como uma monocamada de grafeno é muito fina (a largura de um átomo de carbono), é importante suportar o grafeno com uma camada orgânica como MMA ou poli-MMA (PMMA) durante a transferência do grafeno para grades. O PMMA é o material mais utilizado para transferência de grafeno. No entanto, o PMMA tem uma forte afinidade com o grafeno e muitas vezes pode resultar em contaminação do polímero no filme de grafeno. O MMA é utilizado nesse protocolo, pois deixa menos contaminação residual25. No entanto, tanto o PMMA quanto o MMA têm a desvantagem de formar rugas e rachaduras que podem ser observadas em algumas áreas do filme de grafeno (Figura 3B). Pode ser um desafio evitar essas rugas, pois elas ocorrem comumente durante o crescimento do grafeno pelo método da DCV31. Recentemente, foi desenvolvido um método para o cultivo de grafeno ultraplano sem rugas, pelo qual a folha de cobre é substituída por um wafer de(111)/safira como substrato de crescimento32.
Com base em nossa experiência, é melhor comprar folhas de grafeno/e apoiar o grafeno com MMA internamente do que comprar folhas de-grafeno cobertas de polímero de fabricantes, que se tornam quebradiças após a gravação de cobre e são difíceis de manusear nas etapas subsequentes. O revestidor de spin que usamos para revestimento MMA pode ser construído de forma barata usando peças de uma loja local de computadores/ferragens, como descrito anteriormente25.
Durante a etapa de revestimento do MMA, é importante cobrir toda a superfície do grafeno na folha de-grafeno com MMA. Depois que o for gravado, o MMA-grafeno se tornará semitransparente, e as áreas sem cobertura de MMA parecerão buracos vazios. Para evitar o revestimento de MMA no lado de cobre, é importante colocar um pequeno pedaço de papel manchado por baixo dele durante o revestimento, de modo que absorva qualquer excesso de MMA que saia do filme CVD.
Após a gravação e enxágue, a folha de MMA/grafeno está pronta para ser transferida para grades EM usando um sistema de calha comercial ou caseiro com uma seringa ou bomba peristáltica para controlar o nível de água. Antes da etapa de transferência, é importante pré-enxaguar cuidadosamente as grades em banhos sucessivos de clorofórmio, acetona e IPA. Assar grades revestidas de grafeno a 65 °C ajuda a preservar a integridade do grafeno e promove a adsorção de grafeno às grades. Por fim, para evitar a contaminação do MMA nas grades, é importante remover bem o MMA em um banho de acetona e limpar as grades no IPA. Qualquer resíduo de MMA não lavado será observado nas grades de EM e diminuirá a relação sinal-ruído das imagens (Figura 3C). O processo de lavagem acetona-IPA pode ser repetido para limpar ainda mais as superfícies de grafeno.
Para tornar as grades de grafeno hidrofílicas, expomos as grades ao UV/Ozônio. Diferentes modelos de limpadores UV/ozônio podem exigir otimização para oxigenar suficientemente a camada de grafeno para a preparação de amostras de crioEM sem danificar o grafeno. Independentemente do sistema, é fundamental usar essas grades para aplicação de amostras de crioEM imediatamente após o tratamento com UV/ozônio. Métodos alternativos para tornar hidrofílicas as grades de grafeno são descritas em outros estudos33,34.

A microscopia eletrônica criogênica de partícula única (crioEM) é uma tecnologia cada vez mais aplicável para investigar as estruturas 3D de biomacromoléculas. Os avanços tecnológicos em óptica de microscopia eletrônica, detecção direta de elétrons1 e algoritmos computacionais 2,3,4 na última década permitiram que usuários de crioEM determinassem estruturas de complexos macromoleculares bioquimicamente estáveis com resolução próxima à atômica 5,6,7,8 . Apesar desses avanços, ainda existem barreiras notáveis para a preservação de amostras para imagens por crioEM, que impedem que a maioria dos espécimes biológicos seja resolvida com resoluções tão altas.
A preparação de amostras para análise crioEM de alta resolução envolve o aprisionamento de macromoléculas que são uniformemente distribuídas em uma ampla gama de orientações dentro de uma fina camada de gelo vitrificado. Os métodos de congelamento "blot and plunge" são os métodos mais utilizados para gerar filmes finos de amostras biológicas em grades para estudos decrioEM9,10. Esses métodos envolvem a aplicação de alguns microlitros de solução de amostra em uma grade de EM contendo um filme fenestrado que foi tornado hidrofílico e, subsequentemente, a remoção da maior parte da amostra com papel de filtro antes de mergulhar rapidamente a grade em um criogênio de etano líquido ou mistura etano-propano9.
Embora este método tenha sido usado com sucesso para determinar estruturas de uma ampla gama de espécimes biológicos, todos os métodos de preparação de espécimes crioEM comumente usados expõem espécimes à interface hidrofóbica ar-água (AWI), que frequentemente introduz problemas que limitam a determinação de estruturas de alta resolução. Estabelece-se que espécimes biológicos têm alta propensão à desnaturação quando expostos ao AWI, o que pode levar a complexa agregação e desmontagem11,12,13,14. Além disso, manchas hidrofóbicas nas superfícies de espécimes biológicos fazem com que as partículas adotem orientações preferenciais no gelo12. Em muitos cenários, uma única região hidrofóbica da amostra força todas as partículas a adotar uma orientação singular no gelo, abolindo assim a capacidade de gerar uma reconstrução confiável. Além dos problemas com o AWI, os espécimes podem demonstrar afinidade pela superfície da camada fenestrada de filme, limitando o número de partículas suspensas no gelo dentro dos orifícios15.
Diversas soluções metodológicas e tecnológicas têm sido desenvolvidas para diminuir essas questões decorrentes das interações com o AWI ou com os filmes16,17. Uma abordagem popular é revestir o filme fenestrado das grades EM com uma fina (dezenas de nanômetros) camada de carbono amorfo. Esse revestimento fornece uma superfície contínua através dos orifícios aos quais as partículas podem adsorver, com o benefício de proteger parcialmente a amostra das interações com o AWI15,18,19,20. No entanto, a camada de carbono adicional eleva a quantidade de sinal de fundo nas regiões fotografadas, introduzindo ruídos que podem comprometer a resolução atingível, particularmente para amostras pequenas (<150 kDa). Nos últimos anos, o uso de flocos de óxido de grafeno (GO) para produzir filmes de suporte em grades crioEM tem mostrado vantagens sobre o carbono amorfo tradicional. Os flocos de GO são produzidos através da oxidação de camadas de grafite, resultando em folhas pseudocristalinas de grafite monocamada que são hidrofílicas devido ao seu substancial teor de oxigênio na forma de grupos carboxila, hidroxila e epóxi nas superfícies e bordas. Flocos comerciais de GO em suspensões aquosas são de baixo custo, e existem inúmeros métodos publicados para aplicação de flocos de GO em grades de EM18,21. No entanto, esses métodos geralmente resultam em grades que são apenas parcialmente cobertas com flocos de GO, bem como regiões que contêm várias camadas de flocos de GO. Além disso, os flocos de GO contribuem com um sinal de fundo perceptível para imagens crioEM que é próximo ao observado com carbono amorfo fino22,23.
O grafeno monocamada pura, que consiste em uma única matriz cristalina 2D de átomos de carbono, é distinto do GO por não produzir contraste de fase no microscópio eletrônico. Assim, o grafeno monocamada pode ser usado para gerar uma camada de suporte invisível para imagens de amostras biológicas. O grafeno monocamada também é mais forte que o GO e pode ser aplicado como uma única monocamada em uma grade EM, e avanços recentes na fabricação de grades EM revestidas com grafeno tornaram possível preparar internamente grades de grafeno monocamada de alta cobertura 24,25,26,27,28,29,30. No entanto, apesar dos benefícios do uso de grades revestidas com grafeno para determinação da estrutura crioEM, elas não são amplamente utilizadas devido ao custo proibitivo de opções comerciais e à complexidade da produção interna. Aqui, descrevemos um guia passo-a-passo para a produção efetiva de grades de EM cobertas com uma monocamada de grafeno para determinação da estrutura crioEM de espécimes biológicos (Figura 1). Seguindo este protocolo detalhado, os pesquisadores do cryoEM podem preparar de forma reprodutível dezenas de grades de suporte de grafeno de alta qualidade em um único dia. A qualidade das grades revestidas com grafeno pode ser facilmente examinada usando um microscópio eletrônico de transmissão (MET) de baixa potência equipado com um filamento de LaB6.

<table><tbody><tr><td>70% EtOH</td><td>Pharmco (190 pf EtOH)</td> <td>241000190CSGL</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501-4L</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio (APS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>215589-500g</td><td>Perigoso; use extremo cuidado</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de suporte de grade TEM de fixação para 45 grades</td><td>PELCO</td><td>16830-45</td><td></td></tr><tr><td>Ventilador de computador</td><td>Amazon (Noctua)</td><td>B07CG2PGY6</td><td></td></tr><tr><td>Lamínula</td><td>Bellco Glass</td><td>1203J71</td><td>Lamínulas padrão</td></tr><tr><td>Prato de cristalização</td><td>Pyrex</td><td>3140-100</td><td></td></tr><tr><td>Espanador eletrônico</td><td>Falcon Safety Products</td><td>75-37-6</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Dust-off Air Duster</td><td>Grampos</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Papéis de filtro</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de ponta fina</td><td>Dumont</td><td>0508-L4-PO</td><td></td></tr><tr><td>Frasco</td><td>Pyrex</td><td>4980-500</td><td></td></tr><tr><td>Garfo</td><td>Supermercado</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta pasteur de vidro</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>Grafeno/</td><td>Graphenea</td><td>N/A</td><td>CVD monocamada grafeno</td></tr><tr><td>Calha</td> <td>de revestimento de gradeLadd Research Industries</td><td>10840</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol Frágil</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Fita Kapton</td><td>Amazon (MYJOR)</td><td>MY-RZY001</td><td>Fita de poliimida</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Long twzeer</td><td>Cole Parmer Essentials</td><td>UX-07387-15</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de grade de metal</td><td>Ted Pella</td><td>16820-81</td><td></td></tr><tr><td>MMA(8.5)MMA EL 6</td><td>KAYAKU Materiais Avançados</td><td>M31006 0500L 1GL</td><td>Modelo Inflamável</td></tr><tr><td>10 Forno de Laboratório</td><td>Quincy Lab, Inc.</td><td></td><td></td>FO19013</tr><tr><td>placa de Petri</td><td>Pyrex</td><td>3610-102</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de plasma (Solarus 950)</td><td>Gatan, Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Fiskars</td><td>194813-1010</td><td></td></tr><tr><td>Agitador Orbital Analógico Padrão</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300</td><td>Quantifoil</td><td>N/A</td><td>Holey Gold grids Sistemas de</td></tr><tr><td>limpeza de ozônio ultravioleta</td><td>UVOCS</td><td>modelo T10X10/OES</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação de grades revestidas de grafeno monocamada para microscopia crioeletrônica

Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy

A microscopia eletrônica criogênica (crioEM) tem emergido como uma poderosa técnica para sondar a estrutura atômica de complexos macromoleculares. A preparação da amostra para crioEM requer a preservação de espécimes em uma fina camada de gelo vítreo, normalmente suspensa dentro dos orifícios de um filme de suporte fenestrado. No entanto, todas as abordagens de preparação de amostras comumente usadas para estudos de crioEM expõem o espécime à interface ar-água, introduzindo um forte efeito hidrofóbico no espécime que frequentemente resulta em desnaturação, agregação e dissociação complexa. Além disso, interações hidrofóbicas preferenciais entre regiões do espécime e a interface ar-água impactam as orientações adotadas pelas macromoléculas, resultando em reconstruções 3D com resolução direcional anisotrópica. 
A adsorção de amostras de crioEM a uma monocamada de grafeno mostrou ajudar a mitigar as interações com a interface ar-água, minimizando a introdução de ruído de fundo. Os suportes de grafeno também oferecem o benefício de reduzir substancialmente a concentração necessária de proteínas necessárias para imagens crioEM. Apesar das vantagens desses suportes, as grades revestidas com grafeno não são amplamente utilizadas pela comunidade crioEM devido ao custo proibitivo de opções comerciais e aos desafios associados à produção interna em larga escala. Este trabalho descreve um método eficiente para a preparação de lotes de grades crioEM que possuem cobertura quase total de grafeno monocamada.

A execução bem-sucedida do protocolo de fabricação de grade de grafeno descrito aqui resultará em grades EM totalmente revestidas com uma única monocamada de grafeno. A cobertura de grafeno das grades pode ser verificada usando qualquer MET. Como uma monocamada de grafeno limpo é quase invisível no MET, deve-se examiná-lo usando o modo de difração do microscópio e observar pontos de Bragg correspondentes à organização hexagonal dos átomos de carbono que compõem o grafeno (Figura 3A). É normal ocasionalmente observar algumas rugas de grafeno monocamada, que são introduzidas durante o revestimento com MMA (Figura 3B). Pode-se também verificar o nível de contaminação presente no grafeno adquirindo uma imagem de alta magnificação no centro de um dos orifícios cobertos de grafeno (Figura 3C). Se adquirida com um detector de alta resolução, uma transformada de Fourier desta imagem deve conter pontos de Bragg correspondentes ao espaçamento carbono-carbono a 2,14 Å (Figura 4C). Uma monocamada de átomos de carbono não produz espalhamento de elétrons suficiente para gerar contraste de fase e, portanto, uma imagem de grafeno limpo não apresentará anéis de Thon associados à função de transferência de contraste em uma transformada de Fourier da imagem. No entanto, é muito difícil evitar a contaminação das grades de grafeno depois que elas são produzidas, e a lavagem insuficiente das grades EM ou a remoção de MMA após o revestimento de grafeno resultará em contaminantes notáveis nas grades que são visíveis nas imagens do espaço real (Figura 3C). Como mostrado na Figura 4, as grades de grafeno têm um efeito concentrador em uma amostra, como observado ao comparar 0,5 mg/mL de apoferritina aplicada a grades de ouro holey com (Figura 4A) e sem o suporte de grafeno (Figura 4B). Protocolos similares de fabricação de grafeno foram previamente descritos para resolver estruturas crioEM de proteínas como a apoferritina em alta resolução25,27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig01.jpg"> Figura 1: Esquema para preparação de grades crioEM revestidas com grafeno. As principais etapas no processo de fabricação da grade de grafeno são ilustradas. Abreviações: cryoEM = microscopia eletrônica criogênica; MMA = metacrilato de metila; SAF = persulfato de amônio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig02.jpg"> Figura 2: Materiais necessários para fazer grades de grafeno. (A) Os materiais necessários para o revestimento de grades crio-EM são rotulados em conformidade. (B) Vista de perto do revestidor com folha de grafeno/colada em um papel manchado em uma lâmina de vidro. O revestidor de spin pode ser montado comprando peças de uma loja local de computadores/ferragens. (C) Vista de perto da calha de revestimento da grade presa a uma seringa que pode ser usada para controlar o nível da água. As grades são colocadas em cima de um papel manchado em uma malha de aço inoxidável. O papel de mancha ajuda a manobrar a localização das grades para que a folha de grafeno possa ser combinada com ele. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig03.jpg"> Figura 3: Imagem representativa do padrão de difração e imagens de campo brilhante de uma grade de grafeno mostrando rugas ou contaminação por MMA . (A) Grades EM cobertas com uma monocamada de grafeno mostrarão picos de Bragg correspondentes à rede hexagonal do grafeno quando imageados em um MET em modo de difração. O pico de Bragg correspondente ao espaçamento carbono-carbono de 2,14 Å é circundado e denotado com uma seta. (B) Imagem de campo brilhante de uma grade de grafeno monocamada com algumas rugas (denotadas com uma seta) na monocamada de grafeno. (C) Imagem de campo claro de grafeno monocamada com contaminação por MMA (indicada com uma seta). Barras de escala = 100 nm (B,C). Abreviações: EM = microscopia eletrônica; MMA = metacrilato de metila. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig04.jpg"> Figura 4: Apoferritina em grades de ouro cobertas de grafeno: (A) Micrografia de crioEM de 0,5 mg/mL de apoferritina em grades de ouro cobertas de grafeno. (B) A apoferritina fotografada na mesma concentração é visível em concentração substancialmente menor quando preparada usando grades de ouro holey sem grafeno. (C) FFT da micrografia crioEM de apoferritina 0,5 mg/mL sobre grades de ouro cobertas de grafeno, com os picos de Bragg correspondendo à rede hexagonal de grafeno denotada. Barras de escala = 100 nm (A,B). Abreviações: cryoEM = microscopia eletrônica criogênica; FFT = transformada rápida de Fourier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, descrevemos um protocolo para aplicação de uma única monocamada de grafeno em grades de microscopia eletrônica e como prepará-las para uso na determinação da estrutura do crioEM.

Fabricação de grades revestidas de grafeno monocamada para microscopia crioeletrônica

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has emerged as a powerful technique for probing the atomic structure of macromolecular complexes. Sample ...

Atualmente, preservar de forma otimizada amostras biológicas é um grande desafio na obtenção de estruturas de CryoEM de alta resolução. Durante o processo de preparação das amostras, os corpos de prova são expostos à interface hidrofóbica ar-água, que tem efeitos desnaturantes sobre as amostras e pode fazer com que amostras estáveis adotem uma orientação preferencial no gelo, o que impede a determinação da estrutura de alta resolução. O revestimento de grades CryoEM com uma fina camada de carbono semelhante ao óxido de grafeno macio tem sido comumente usado para resolver problemas relacionados a interações com a interface ar-água.No entanto, essas camadas costumam aumentar o ruído de fundo em nossas imagens, o que compromete as resoluções de nossa estrutura. O revestimento da grade com uma monocamada de grafeno alcança proteção semelhante sem introduzir ruído de fundo significativo. O uso de grades CryoEM revestidas de grafeno pode ajudar a superar problemas relacionados às interações com a interface ar-água, no entanto, as grades comerciais de grafeno são caras e muitos laboratórios consideram as grades de grafeno muito complicadas de preparar internamente.Pesquisadores da área de CryoEM agora podem usar esse protocolo passo a passo para reproduzir dezenas de grafenos de alta qualidade totalmente produzidos em um dia.

fabrication-monolayer-graphene-coated-grids-for-cryoelectron

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A aplicação de camadas de suporte a grades de microscopia eletrônica criogênica (crioEM) pode aumentar a densidade de partículas, limitar as interações com a interface ar-água, reduzir o movimento induzido pelo feixe e melhorar a distribuição das orientações das partículas. Este artigo descreve um protocolo robusto para o revestimento de grades de crioEM com uma monocamada de grafeno para melhorar a preparação de amostras criogênicas.

Aplicação do Grafeno Monocamada em Grades de Microscopia Crio-Eletrônica para Determinação de Estruturas de Alta Resolução

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Aprenda a fabricar grades revestidas com monocamada de grafeno para microscopia crioeletrônica. Este protocolo reduz ruído de fundo e preserva amostras biológicas, permitindo produção em massa em um único dia.

Fabricação de grades revestidas de grafeno monocamada para microscopia crioeletrônica

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