Fabricação de grades revestidas de grafeno monocamada para microscopia crioeletrônica
8 de setembro de 2023
Aqui, descrevemos um protocolo para aplicação de uma única monocamada de grafeno em grades de microscopia eletrônica e como prepará-las para uso na determinação da estrutura do crioEM.
Atualmente, preservar de forma otimizada amostras biológicas é um grande desafio na obtenção de estruturas de CryoEM de alta resolução. Durante o processo de preparação das amostras, os corpos de prova são expostos à interface hidrofóbica ar-água, que tem efeitos desnaturantes sobre as amostras e pode fazer com que amostras estáveis adotem uma orientação preferencial no gelo, o que impede a determinação da estrutura de alta resolução. O revestimento de grades CryoEM com uma fina camada de carbono semelhante ao óxido de grafeno macio tem sido comumente usado para resolver problemas relacionados a interações com a interface ar-água.
No entanto, essas camadas costumam aumentar o ruído de fundo em nossas imagens, o que compromete as resoluções de nossa estrutura. O revestimento da grade com uma monocamada de grafeno alcança proteção semelhante sem introduzir ruído de fundo significativo. O uso de grades CryoEM revestidas de grafeno pode ajudar a superar problemas relacionados às interações com a interface ar-água, no entanto, as grades comerciais de grafeno são caras e muitos laboratórios consideram as grades de grafeno muito complicadas de preparar internamente.
Pesquisadores da área de CryoEM agora podem usar esse protocolo passo a passo para reproduzir dezenas de grafenos de alta qualidade totalmente produzidos em um dia.
Visão Geral
Este estudo aborda o desafio de preservar de forma ideal amostras biológicas para microscopia eletrônica de criotransmissão de alta resolução (cryo-EM). Os autores apresentam um protocolo para revestir grades de microscopia eletrônica com uma única monocamada de grafeno, a fim de minimizar o ruído de fundo e melhorar a integridade da amostra durante a aquisição de imagens.
Principais Componentes do Estudo
Área de Pesquisa
- Microscopia eletrônica criogênica
- Preservação de amostras em imagem biológica
- Aplicações de grafeno em microscopia
Contexto
- A preservação de amostras biológicas é crucial para estruturas de alta resolução em microscopia eletrônica criogênica.
- Revestimentos tradicionais de carbono podem aumentar o ruído de fundo na imagem.
- O grafeno fornece uma camada protetora sem comprometer a qualidade da imagem.
Métodos Utilizados
- Aplicação de uma monocamada de grafeno em grades de ME
- Técnicas de imagem em microscopia eletrônica criogênica
- Uso de espalhadores caseiros e diversos agentes de limpeza
Resultados Principais
- As grades revestidas com grafeno mostram ruído de fundo reduzido na imagem.
- O método permite a produção em massa de grafeno de alta qualidade em um único dia.
- As grades de ME demonstram preservação e concentração eficazes de amostras biológicas.
Conclusões
- O protocolo fornece uma abordagem simples para laboratórios produzirem grades de ME revestidas com grafeno.
- Esse avanço aumenta o potencial de melhorias na imagem de criomicroscopia eletrônica em pesquisas biológicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A criomicroscopia eletrônica de alta resolução é fundamental para a biologia estrutural e a descoberta de fármacos, mas a desnaturação da amostra e o viés de orientação na interface ar-água limitam a qualidade e a produtividade dos dados. Grades revestidas com monocamada de grafeno resolvem esses gargalos ao preservar a integridade de macromoléculas e reduzir o ruído de fundo, impactando diretamente a descoberta inicial e a validação de alvos. A fabricação interna escalável de grades de grafeno permite uma adoção mais ampla, apoiando estudos estruturais em toda a carteira de projetos e acelerando a desmistificação mecanicista.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de alta fidelidade da estrutura de complexos macromoleculares para validação de alvos.
- Reduz a desnaturação e a agregação, apoiando a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta.
- Melhora a diversidade de orientação, aumentando a confiança preditiva em modelos estruturais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Facilita a preparação de grades de criomicroscopia eletrônica reprodutíveis e de baixo ruído de fundo para triagem posterior.
- Permite a obtenção de imagens quantitativas ao minimizar ruídos e artefatos de concentração.
- Permite a avaliação confiável de complexos proteicos em concentrações amostrais mais baixas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Aprimora a continuidade do descobrimento à validação pré-clínica ao apoiar a geração robusta de dados estruturais.
- Alinha-se ao desenvolvimento translacional de biomarcadores por meio da resolução estrutural aprimorada.
- Reduz o risco de falhas em estágios avançados devido a dados estruturais ambíguos ou comprometidos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
As grades revestidas com grafeno em monocamada se integram ao fluxo de trabalho de criomicroscopia eletrônica desde a descoberta inicial até a identificação de compostos promissores e pesquisas pré-clínicas, apoiando estudos estruturais orientados por hipóteses e permitindo imagens reprodutíveis e de alta qualidade.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao preservar as conformações nativas de macromoléculas.
- Triagem: Fornece grades padronizadas e reprodutíveis para ensaios quantitativos de criomicroscopia eletrônica.
- Análises: Oferece imagens de baixo ruído e alta resolução para análises comparativas robustas.
- Pesquisa Translacional: Melhora a continuidade pré-clínica ao permitir a caracterização estrutural confiável de candidatos terapêuticos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma escalável e economicamente eficiente para estudos estruturais repetidos em diversos programas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em biologia estrutural.
- Valor Operacional: Padroniza a preparação de grades, melhora a reprodutibilidade e permite escalonamento em lotes.
- Valor Estratégico: Acelera decisões de prosseguimento ou interrupção e reduz riscos biológicos em estágios avançados por meio de dados de maior qualidade.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco de alvos validados estruturalmente.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manuseio de grades para criomicroscopia eletrônica e na manipulação de grafeno.
- Necessita de acesso a centrífugas de espalhamento, capelas de exaustão e infraestrutura padrão para preparação de grades de microscopia eletrônica.
- Exige padronização entre equipes para garantir qualidade reprodutível das grades e resultados de imagem.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes classes de proteínas ou tipos de amostras.
- Limitações potenciais incluem sensibilidade no manuseio e treinamento inicial para as etapas de transferência de grafeno.
