Name: Análise Imuno-Histoquímica Multiplex da Paisagem Espacial de Células Imunes do Microambiente Tumoral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Aprenda a caracterizar células imunes no microambiente tumoral usando imuno-histoquímica multiplex em tecidos FFPE. Este método permite visualizar múltiplos marcadores simultaneamente para compreender a dinâmica imunológica.

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O PhenoImager HT foi adquirido por meio de financiamento fornecido pelo Centro Médico da Universidade Radboud e pelo Centro de Tecnologia Radboud para Microscopia. A FC é apoiada financeiramente por uma bolsa da Dutch Cancer Society (10673) e pela ERC Adv ARTimmune (834618). JT é apoiado financeiramente por uma bolsa NWO Vidi (VI.Vidi.192.084). Os autores gostariam de agradecer a Eric van Dinther e Ankur Ankan por sua ajuda na criação de fluxos de trabalho para armazenar dados IHC multiplex e Bengt Phung é agradecido por instruções sobre como implementar dados IHC multiplex no QuPath para desenho de ROI.

Mapeando a paisagem imune do tumor: um protocolo de análise IHC multiplex aprofundado

<ol><li>Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+from+immunosurveillance+to+tumor+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape.</a> Nature Immunology. 3 (11), 991-998 (2002).</li>
<li>van der Woude, L. L., Gorris, M. A. J., Halilovic, A., Figdor, C. G., de Vries, I. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrating+into+the+tumor%3A+a+roadmap+for+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migrating into the tumor: a roadmap for T cells.</a> Trends in Cancer. 3 (11), 797-808 (2017).</li>
<li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+human+tumours%3A+impact+on+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li>
<li>Fridman, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+of+human+tumors%3A+general+significance+and+clinical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenvironment%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment of human tumors: general significance and clinical impact.</a> Cancer Microenvironment. 6 (2), 117-122 (2013).</li>
<li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer%3A+a+prognostic+and+accuracy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li>
<li>Angell, H. K., Bruni, D., Barrett, J. C., Herbst, R., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immunoscore%3A+colon+cancer+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The Immunoscore: colon cancer and beyond.</a> Clinical Cancer Research. 26 (2), 332-339 (2020).</li>
<li>Angell, H., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+immune+contexture+to+the+Immunoscore%3A+the+role+of+prognostic+and+predictive+immune+markers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">From the immune contexture to the Immunoscore: the role of prognostic and predictive immune markers in cancer.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+classification+using+the+Immunoscore%3A+a+worldwide+task+force%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer classification using the Immunoscore: a worldwide task force.</a> Journal of Translational Medicine. 10, 205(2012).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World-wide+Immunoscore+Task+Force%3A+meeting+report+from+the+34%3BMelanoma+Bridge%26%2334%2C+Napoli%2C+November+30th-December+3rd%2C+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">World-wide Immunoscore Task Force: meeting report from the 34;Melanoma Bridge&#34, Napoli, November 30th-December 3rd, 2016.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 212(2017).</li>
<li>Tumeh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+blockade+induces+responses+by+inhibiting+adaptive+immune+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance.</a> Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).</li>
<li>Creemers, J. H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tipping+point+in+cancer-immune+dynamics+leads+to+divergent+immunotherapy+responses+and+hampers+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A tipping point in cancer-immune dynamics leads to divergent immunotherapy responses and hampers biomarker discovery.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002032(2021).</li>
<li>Blank, C. U., Haanen, J. B., Ribas, A., Schumacher, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CANCER+IMMUNOLOGY.+The+%26%2334%3Bcancer+immunogram%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CANCER IMMUNOLOGY. The &#34;cancer immunogram&#34;.</a> Science. 352 (6286), 658-660 (2016).</li>
<li>Teruya-Feldstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunohistochemistry+laboratory+looking+at+molecules+and+preparing+for+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The immunohistochemistry laboratory looking at molecules and preparing for tomorrow.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (11), 1659-1665 (2010).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+tissue+antigens+and+antibodies+get+along%3A+revisiting+the+technical+aspects+of+immunohistochemistry--the+red%2C+brown%2C+and+blue+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).</li>
<li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+where%2C+the+when%2C+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clinical Cancer Research. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li>
<li>Parra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+platforms+of+multiplexed+immunofluorescence+for+study+of+paraffin+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Treatment+and+Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Novel platforms of multiplexed immunofluorescence for study of paraffin tumor tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight-color+multiplex+immunohistochemistry+for+simultaneous+detection+of+multiple+immune+checkpoint+molecules+within+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).</li>
<li>Roelofsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+regression+of+ovarian+carcinoma+after+septic+peritonitis%3B+a+unique+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous regression of ovarian carcinoma after septic peritonitis; a unique case report.</a> Frontiers in Oncology. 8, 562(2018).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-mediated+delivery+of+therapeutic+mRNA+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Peptide-mediated delivery of therapeutic mRNA in ovarian cancer.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 141, 180-190 (2019).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM-binding+DARPins+for+targeted+photodynamic+therapy+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">EpCAM-binding DARPins for targeted photodynamic therapy of ovarian cancer.</a> Cancers. 12 (7), 1762(2020).</li>
<li>Di Blasio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumour+microenvironment+shapes+dendritic+cell+plasticity+in+a+human+organotypic+melanoma+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The tumour microenvironment shapes dendritic cell plasticity in a human organotypic melanoma culture.</a> Nature Communications. 11 (1), 2749(2020).</li>
<li>van Beek, J. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pDCs+are+superior+to+cDC2s+in+attracting+cytolytic+lymphocytes+in+melanoma+patients+receiving+DC+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human pDCs are superior to cDC2s in attracting cytolytic lymphocytes in melanoma patients receiving DC vaccination.</a> Cell Reports. 30 (4), 1027-1038 (2020).</li>
<li>Rodriguez-Rosales, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+aged+neutrophils+are+augmented+in+blood+and+skin+of+psoriasis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory aged neutrophils are augmented in blood and skin of psoriasis patients.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 148 (4), 1030-1040 (2021).</li>
<li>Hoeijmakers, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+composition+in+the+endometrium+of+patients+with+a+complete+molar+pregnancy%3A+Effects+on+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immune cell composition in the endometrium of patients with a complete molar pregnancy: Effects on outcome.</a> Gynecologic Oncology. 160 (2), 450-456 (2021).</li>
<li>van Ravensteijn, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+genomic+analysis+reveals+clinically+relevant+distinctions+between+angiosarcoma+subgroups%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Immunological and genomic analysis reveals clinically relevant distinctions between angiosarcoma subgroups.</a> Cancers. 14 (23), 5938(2022).</li>
<li>van der Woude, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+shows+an+immunological+abscopal+effect+in+patients+with+NSCLC+treated+with+pembrolizumab-radiotherapy+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment shows an immunological abscopal effect in patients with NSCLC treated with pembrolizumab-radiotherapy combination.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (10), e005248(2022).</li>
<li>Graham Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+landscape+shows+treatment-specific+differences+in+rectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment landscape shows treatment-specific differences in rectal cancer patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 1011498(2022).</li>
<li>Cortenbach, K. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+immune+cell+infiltration+in+different+stages+of+coronary+atherosclerosis+revealed+by+multiplex+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology.+Heart+%26+Vasculature%22%5BJournal%5D)">Topography of immune cell infiltration in different stages of coronary atherosclerosis revealed by multiplex immunohistochemistry.</a> International Journal of Cardiology. Heart & Vasculature. 44, 101111(2023).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+repair+deficient+prostate+cancer+represents+an+immunologically+distinct+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination repair deficient prostate cancer represents an immunologically distinct subtype.</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2094133(2022).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+primary+and+metastatic+lesions+of+patients+with+ipilimumab-treated+melanoma%3A+high+variation+in+lymphocyte+infiltration+and+HLA-ABC+expression+whereas+tumor+mutational+load+is+similar+and+correlates+with+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paired primary and metastatic lesions of patients with ipilimumab-treated melanoma: high variation in lymphocyte infiltration and HLA-ABC expression whereas tumor mutational load is similar and correlates with clinical outcome.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (5), e004329(2022).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+T+cell+depletion+following+neoadjuvant+chemotherapy+in+patients+with+muscle-invasive+bladder+cancer+is+associated+with+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Intratumoral T cell depletion following neoadjuvant chemotherapy in patients with muscle-invasive bladder cancer is associated with poor clinical outcome.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 72 (1), 137-149 (2023).</li>
<li>Sultan, S., Gorris, M. A. J., Buytenhuijs, F., Lvan de Woude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Segmentation-free+machine+learning+architecture+for+immune+land-scape+phenotyping+in+solid+tumors+by+multichannel+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A Segmentation-free machine learning architecture for immune land-scape phenotyping in solid tumors by multichannel imaging.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-profiling+and+cellular+spatial+analysis+using+five+immune+oncology+multiplex+immunofluorescence+panels+for+paraffin+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Immuno-profiling and cellular spatial analysis using five immune oncology multiplex immunofluorescence panels for paraffin tumor tissue.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8511(2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Sun, Z., Nyberg, R., Wu, Y., Bernard, B., Redmond, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+an+enhanced+7-color+multiplex+IHC+protocol+to+dissect+immune+infiltration+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Developing an enhanced 7-color multiplex IHC protocol to dissect immune infiltration in human cancers.</a> PLoS One. 16 (2), e0247238(2021).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

A análise espacial do TME é uma técnica procurada para aprender mais sobre o compartimento das células imunes e descobrir novos biomarcadores prognósticos e preditivos, particularmente no campo da imuno-oncologia16. Muitas técnicas diferentes estão sendo desenvolvidas para esse fim, envolvendo a detecção de proteínas, transcritos de mRNA ou uma combinação dos dois, com estimativas de até 100-1.000 alvos. No entanto, uma multiplexação mais alta tem o custo de experimentos de menor rendimento, custos experimentais mais altos e desafios técnicos e, muitas vezes, apenas uma pequena parte do TME pode ser analisada. A IHQ multiplex usando o método baseado em TSA que descrevemos aqui, detecta seis marcadores diferentes + DAPI simultaneamente, é relativamente mais barata de realizar e seções de tecido inteiro são visualizadas em menos de 20 minutos, prontas para serem analisadas completamente. Essa técnica tornou-se menos complexa com a automação do procedimento de coloração. Melhorias no microscópio multiespectral, que incluem a adição de dois filtros extras, melhoraram tremendamente os tempos de separação e varredura espectral. É possível detectar até oito marcadores diferentes + DAPI simultaneamente. No entanto, ao expandir a multiplexação com mais marcadores, os benefícios mencionados acima desaparecem à medida que a separação espectral se torna mais desafiadora e os tempos de varredura para lâminas inteiras aumentam substancialmente. Esforços estão sendo realizados para padronizar a IHQ multiplex entre diferentes instituições para facilitar a implementação no ambiente de diagnóstico com mais facilidade. Para esta padronização do IHC multiplex, aconselhamos os usuários a aderir ao protocolo mais acessível com seis marcadores diferentes + DAPI. No entanto, ainda é necessário algum conhecimento técnico e a análise a jusante pode ser um desafio, para o qual desenvolvemos metodologias descritas neste protocolo.
A padronização começa com o desenvolvimento do painel IHC multiplex. A importância da escolha de anticorpos primários que detectam alvos proteicos específicos foi enfatizada antes17. Nossos painéis multiplex de IHC são desenvolvidos principalmente com clones de anticorpos primários que também são usados e validados para IHC em nosso departamento de diagnóstico. No entanto, no caso do painel IHQ multiplex de células dendríticas, a maioria dos anticorpos não foi usada no cenário diagnóstico (van der Hoorn et al., manuscrito em submissão). Para garantir a especificidade e minimizar as diferenças de lote, optamos por usar anticorpos monoclonais em vez de anticorpos policlonais e também validamos a maioria dos anticorpos usando linhagens celulares transfectadas e células primárias. Ao longo dos anos, diferentes versões de painéis IHC multiplex foram utilizadas em vários estudos usando o sistema Vectra 3 18,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Para implementar esses painéis IHC multiplex de maneira ideal no sistema PhenoImager HT, alguns ajustes tiveram que ser feitos nas combinações de anticorpos primários e fluoróforos. Para se beneficiar de uma melhor separação espectral e tempos de varredura mais rápidos de seções de tecido inteiro, é necessária a implementação dos mais recentes fluoróforos Opal480 e Opal780 e evitar o uso de fluoróforos Opal540 e Opal650 em painéis IHC multiplex de sete cores. Os tempos de varredura são ~ 3-10 vezes mais rápidos, dependendo do tamanho da seção de tecido. Os ajustes do painel IHC multiplex foram bastante fáceis de alcançar, mas algumas considerações precisam ser mantidas em mente. O espectro fluorescente do Opal480 se sobrepõe muito ao espectro de autofluorescência e, portanto, interfere na mistura espectral de eritrócitos e outras estruturas autofluorescentes. O uso de uma concentração aumentada do anticorpo primário emparelhado com o Opal480 resolveu esse problema na maioria dos casos. A implementação do filtro AF de amostra proprietário no PhenoImager HT facilita a separação de Opal480 e autofluorescência. No entanto, é melhor usar um anticorpo primário que produza um sinal claro quando usado com Opal480 para que seu sinal seja maior que a autofluorescência.
Embora esses painéis IHC multiplex estejam estabelecidos, a variação de lote para lote é algo que precisa ser considerado. Ao realizar controles de IHC monoplex antes de iniciar o experimento de IHC multiplex completo, às vezes observamos que os anticorpos primários têm um desempenho mais forte ou mais fraco de experimento para experimento. As razões para isso podem ser erros de pipetagem, condições de armazenamento de reagentes abaixo do ideal e prazo de validade. Resolvemos isso ajustando a solução de anticorpos primários com base em nossa experiência. Mesmo quando nenhum dos ajustes mencionados acima teve que ser feito, com cada experimento de lote IHC multiplex, é importante definir os tempos de exposição com base nas lâminas de controle coradas com IHC monoplex.
Como nossa pesquisa foi inicialmente focada em diferentes tipos de carcinomas e melanoma, os painéis multiplex IHC deveriam ser intercambiáveis entre os tipos de tumor com ajustes mínimos. Portanto, sempre incluímos vários tipos de tecido (tumoral) no processo de otimização e observamos que as diluições para anticorpos primários para marcadores de células imunes podem ser mantidas semelhantes entre diferentes tipos de tumor. No entanto, a detecção de tecido tumoral entre carcinomas e melanoma precisa de diferentes marcadores tumorais. Assim, o marcador tumoral sempre foi otimizado para funcionar no final de cada painel IHC multiplex e atualmente é sempre usado em conjunto com o Opal780, que coincidentemente também deve estar no último fluoróforo em um procedimento de coloração IHC multiplex. Ao usar o marcador tumoral consequentemente no final da IHQ multiplex, esses painéis IHQ multiplex podem ser facilmente trocados por outros tipos de tumor, como glioblastoma (ou seja, GFAP) e linfoma de Hodgkin (ou seja, CD30). Para o angiossarcoma, usamos este painel IHQ multiplex de linfócitos com gene relacionado à transformação de eritroblastos (ERG) como marcador tumoral com apenas dois experimentos de otimização25. A otimização incluiu a titulação do anticorpo primário ERG e o teste do painel IHC multiplex com ERG no final.
Outros ajustes nesses painéis multiplex IHC também podem ser feitos trocando um determinado marcador de célula imune por outro marcador imunológico ou funcional. Cada mudança requer otimização. O protocolo de otimização pode ser seguido conforme descrito anteriormente17. Certas alterações nos painéis IHC multiplex propostos irão interferir com os algoritmos ImmuNet que criámos. Dados suficientes devem ser gerados e tempo deve ser gasto para implementar essas mudanças no algoritmo (pelo menos 750 anotações para cada novo marcador e/ou fenótipo celular e 150 anotações para validação de marcadores previamente treinados). Os painéis aqui apresentados não contêm marcadores funcionais, embora a implementação de marcadores de checkpoint imunológico como PD-1 e PD-L1 em painéis multiplex IHQ seja realizada em nosso laboratório. No entanto, a análise de marcadores menos binários em sinais negativos e positivos tem se mostrado mais difícil e é uma área de pesquisa ativa em nosso grupo.
O número de marcadores que podem ser avaliados simultaneamente com IHQ multiplex é limitado em comparação com outras técnicas novas. Embora isso possa ser contornado analisando diferentes painéis em fatias consecutivas de um bloco FFPE, será difícil comparar essas fatias espacialmente. A orientação e os artefatos dobrados provavelmente não são os mesmos após a preparação do slide. No entanto, a IHQ multiplex é bastante acessível, o que a torna uma ferramenta atraente para mais instituições e pesquisadores e, portanto, mais adequada para implementação futura em um cenário diagnóstico. Com a padronização de painéis de células imunes IHC multiplex para vários tipos de tumores e pipelines de análise a jusante, mais conhecimento pode ser obtido sobre as diferenças no TME entre pacientes e tipos de tumor. Isso pode, por exemplo, levar a mais informações sobre o papel do TME na resposta antitumoral a tratamentos específicos. Isso pode até dar origem a novos biomarcadores para prever fatores como resposta ao tratamento e sobrevida esperada. No geral, isso pode permitir que a IHQ multiplex se torne uma ferramenta clínica para auxiliar na tomada de decisões clínicas, em uma abordagem de medicina personalizada. É certo que mais etapas do procedimento de análise provavelmente devem ser automatizadas e padronizadas para que seja viável para uso em um ambiente de diagnóstico diário, portanto, por enquanto, é principalmente uma perspectiva futurista.
A análise de vários marcadores em uma única lâmina de amostra pode ser uma ferramenta muito poderosa, apesar de seus desafios técnicos. Com protocolos experimentais padronizados e um método de análise robusto, como descrevemos aqui usando o ImmuNet, a quantificação de múltiplos marcadores o torna mais informativo do que o IHC clássico, enquanto o IHC multiplex permanece com um rendimento relativamente alto em comparação com os novos métodos experimentais de plex superior.

As células imunes desempenham um papel crucial na proteção contra patógenos, como vírus e bactérias, mas também contra células cancerígenas1. Portanto, o sistema imunológico dentro do microambiente tumoral (TME) é muito promissor para a descoberta de biomarcadores prognósticos e preditivos2. Os infiltrados de células imunes têm sido correlacionados ao prognóstico em vários tipos de câncer, embora isso ainda não tenha sido implementado no atendimento clínico 3,4. Na maioria dos tipos de tumores, um alto número de células T citotóxicas e células T auxiliares 1 e/ou baixo número de células T reguladoras estão ligados a bons prognósticos. Esforços estão em andamento para incorporar o chamado "Immunoscore" no estadiamento TNM do câncer colorretal, transformando-o no estadiamento TNM-I 5,6. O Immunoscore é derivado do número total de células T (detectadas com CD3) e células T citotóxicas (detectadas com CD8) em duas regiões tumorais diferentes: o núcleo do tumor versus a margem invasiva (IM) dos tumores. O Immunoscore também foi proposto como tendo valor prognóstico em outros tipos de câncer, como melanoma, câncer de pulmão e câncer de mama 6,7,8,9. Além disso, os infiltrados de células imunes também podem se correlacionar com a resposta à imunoterapia de bloqueio de checkpoint10. No entanto, esses biomarcadores preditivos devem ser validados em estudos prospectivos antes de poderem ser implementados rotineiramente na prática clínica. Além disso, também foi proposto que um único biomarcador será insuficiente para uma previsão significativa11. Portanto, a criação de um mapa completo de uma amostra de paciente pela combinação de diferentes biomarcadores foi proposta como um biomarcador preditivo mais abrangente no chamado "imunograma de câncer"12.
Dentre os métodos de estudo de células imunes dentro do TME, a técnica mais antiga e conhecida é a imuno-histoquímica (IHQ), utilizada rotineiramente para testes diagnósticos em diversas doenças, especialmente câncer13. Essa técnica foi limitada ao uso de um ou apenas alguns marcadores14 por um longo tempo e, portanto, foi superada em ambientes de pesquisa por outras técnicas, como citometria de fluxo e perfil de expressão gênica (GEP). No entanto, os tecidos tumorais fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) normalmente usados em diagnósticos e pesquisas de rotina não são (idealmente) adequados para citometria de fluxo e GEP. Além disso, embora o GEP e a citometria de fluxo forneçam muitas informações sobre o fenótipo e a função celular, a falta de informações espaciais é uma grande desvantagem. Portanto, a heterogeneidade dentro de uma amostra, como diferenças nas áreas infiltradas por células imunes versus áreas excluídas por células imunes de um tumor, pode passar despercebida15. Novas plataformas foram desenvolvidas para análise multiplex de tecidos FFPE, como IHC multiplex, citometria de massa por imagem e CO-Detection por indEXing (CODEX) que podem ser usadas para detectar vários marcadores simultaneamente dentro de uma seção de tecido16. As células imunes no TME estão sendo amplamente estudadas para encontrar os melhores biomarcadores para imunoterapia. No entanto, as técnicas multiplex e a análise automatizada de imagens representam obstáculos próprios.
Nosso laboratório tem uma vasta experiência em coloração IHC multiplex usando o método de amplificação de sinal Opal/Tyramide (TSA) e automatizou isso em uma plataforma IHC (consulte a Tabela de Materiais)17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31. Otimizamos os painéis de células imunes para a detecção de diferentes subconjuntos de linfócitos, células mieloides e células dendríticas (DCs). Os tecidos que contêm áreas densas de células imunes - para linfócitos ou morfologias celulares complexas (ou seja, células mieloides e DCs) - são particularmente difíceis de analisar, com risco de superestimar ou subestimar o número de células imunes presentes. Para superar esse problema, o software de análise ImmuNet foi desenvolvido pelo nosso grupo32, e esse pipeline de aprendizado de máquina melhorou imensamente a qualidade da detecção desses diferentes tipos de células imunológicas. Um protocolo detalhado desde a obtenção do material FFPE até a análise das densidades de células imunes em diferentes compartimentos teciduais e distâncias entre os tipos de células imunes é descrito aqui.
Este protocolo descreve como os painéis multiplex IHC são realizados no Radboud University Medical Center desde a implementação do gerador de imagens de patologia digital em 2022. Os painéis multiplex IHQ descritos podem ser usados para diferentes carcinomas (por exemplo, pulmão, próstata, colorretal, bexiga, mama) com o uso de um anticorpo pan-citoqueratina como marcador tumoral ou para melanoma com o uso de anticorpos associados a melanócitos como marcadores tumorais. Esses protocolos IHQ multiplex foram cuidadosamente otimizados em termos de concentração de anticorpos primários, combinações de fluoróforos e a sequência do procedimento de coloração. Nós e outros descrevemos a otimização do painel IHC multiplex anteriormente 17,33,34,35. Os painéis multiplex IHC podem ser adaptados, mas os pipelines de análise descritos precisam ser avaliados e potencialmente ajustados ou retreinados de acordo. Os protocolos IHC multiplex de sete cores descritos fazem uso dos fluoróforos Opal Opal480, Opal520, Opal570, Opal620, Opal690, Opal780 e 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), de modo que a fácil separação e a varredura rápida no gerador de imagens são habilitadas com "Imunofluorescência Multiespectral de Um Toque" (MOTiF). A coloração e a varredura de nove cores não são descritas neste protocolo, pois isso requer ainda mais ajustes da configuração experimental e outro modo de varredura no gerador de imagens que usa o filtro sintonizável de cristal líquido.

<table><tbody><tr><td>Marca de Célula</td> <td>anti-CD14</td><td>114R-16</td><td>seção 3, clone EPR3653</td></tr><tr><td>anti-CD163</td><td>Cell Marque&nbsp;</td><td>163M-15</td><td>seção 3, clone MRQ-26</td></tr><tr><td>anti-CD19</td><td>Abcam</td><td>ab134114</td><td>seção 3, clone EPR5906</td></tr><tr><td>anti-CD1c (BDCA1)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>TA505411</td><td>seção 3, clone OTI2F4</td></tr><tr><td>anti-CD20</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-340-S</td><td>seção 3, clone L26</td></tr><tr><td>anti-CD3</td><td>Thermo Scientific</td><td>RM-9107</td><td>seção 3, clone sp7</td></tr><tr><td>anti-CD303 / BDCA2</td><td>Dendritics via Enzo Lifesciences/Axxora</td><td>DDX0043</td><td>seção 3, clone 124B3.13</td></tr><tr><td>anti-CD56</td><td>Cell Marque&nbsp;</td><td>156R-94</td><td>seção 3, clone MRQ-42</td></tr><tr><td>anti-CD66b</td><td>BD Biosciences</td><td>555723</td><td>seção 3, clone G10F5</td></tr><tr><td>anti-CD68</td><td>Dako Agilent</td><td>M087601</td><td>seção 3, clone PG-M1</td></tr><tr><td>anti-CD8</td><td>Dako Agilent</td><td>M7103</td><td>seção 3, clone C8 / 144B</td></tr><tr><td>anti-Foxp3</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-4777</td><td>seção 3, clone 236A / E7</td></tr><tr><td>anti-Gp100</td><td>Dako Agilent</td><td>M063401</td><td>seção 3, clone HMB45</td></tr><tr><td>anti-HLA-DR, DP, DQ</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53302</td><td>seção 3, clone CR3 / 43</td></tr><tr><td>anti-MART-1</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-799</td><td>seção 3, clone A103</td></tr><tr><td>anti-pan citoqueratina</td><td>Abcam</td><td>ab86734</td><td>seção 3, clone AE1 / AE3 + 5D3</td></tr><tr><td>anti-SOX10</td><td>Sigma Aldrich</td><td>383R</td><td>seção 3, clone EP268</td></tr><tr><td>anti-tirosinase</td><td>Sanbio</td><td>MONX10591</td><td>seção 3, clone T311</td></tr><tr><td>anti-XCR1</td><td>Cell Signaling Technologies via Biok&eacute;</td><td>44665S</td><td>seção 3, clone D2F8T</td></tr><tr><td>diluente de anticorpo</td><td>Akoya BioSciences</td><td>SKU&nbsp; ARD1001EA</td><td>seção 3, da lâmina Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 (opcionalmente também pode ser substituída por TBST com 10% BSA)</td></tr><tr><td>Sonda de aspiração de ligação</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.0605</td><td>seção 3</td></tr><tr><td>Sonda de aspiração de ligação Limpeza</td><td>Leica Biosciences</td><td>CS9100</td><td>seção 3</td></tr><tr><td>Solução de desparafinação de ligação</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9222</td><td>seção 3</td></tr><tr><td>Etiqueta Bond Objectglas + fiapos de impressão</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.4564.A</td><td>seção 3</td></tr><tr><td>Sistema de Detecção de Pesquisa de Bond 2</td><td>Leica Biosciences</td><td>DS9777</td><td>seção 3</td></tr><tr><td>Bond RX autocorante&nbsp;</td><td>Leica Biosciences-seção</td><td></td> <td>3, plataforma automatizada</td></tr><tr><td>Bond TM Epitope Retrieval 1 - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9961</td><td>seção 3</td></tr><tr><td>Bond TM Epitope Retrieval 2 - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9640</td><td>seção 3</td></tr><tr><td>Bond TM Wash Solution 10x - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9590</td><td>seção 3</td></tr><tr><td>BOND Universal Covertile</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.4611</td><td>secção 3</td></tr><tr><td>Kit de titulação Bond(TM)</td><td>Leica Biosciences</td><td>OPT9049</td><td>secção 3</td></tr><tr><td>lamínula 24 x 32 mm #1 (0,13-0,16 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15717592</td><td>secção 2</td></tr><tr><td>lamínula 24 x 50 mm</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td>secção 2</td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>VWR</td><td>0100-20</td><td>seção 3, sempre que as lâminas monoplex precisam ser verificadas rapidamente, não para análise oficial, então o DAPI é corado separadamente para melhores resultados</td></tr><tr><td>Eosine</td><td></td><td></td><td>seção 2, caseiro</td></tr><tr><td>Etanol 99,5%</td> <td>VWR</td><td>4099,9005</td><td>seção 2</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>VWR</td><td>0100-01</td><td>seção 3&nbsp;</td></tr><tr><td>hematoxilina-seção</td><td></td><td></td> <td>2, pipeline caseiro</td></tr> <tr><td>de</td> <td>detecção e fenotipagem de células imunes</td><td>ImmuNet</td><td></td></tr> <tr><td>software inForm 2.4.10</td><td>Akoya BioSciences-seção</td><td></td> <td>4 e 6</td></tr><tr><td>Pacote de reagentes OPAL 480</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1500001KT</td><td>seção 3</td></tr><tr><td>Pacote de reagentes OPAL 520</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1487001KT</td><td>seção 3</td></tr><tr><td>Pacote de reagentes OPAL 570</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1488001KT</td><td>seção 3</td></tr><tr><td>Pacote de reagentes OPAL 620</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1495001KT</td><td>seção 3</td></tr><tr><td>Pacote de reagentes OPAL 690</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1497001KT</td><td>seção 3</td></tr><tr><td>Pacote de reagentes OPAL 780</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1501001KT</td><td>seção 3</td></tr><tr><td>Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 slide</td><td>Akoya BioSciences</td><td>NEL821001KT</td><td>seção 3</td></tr><tr><td>PhenoChart 1.1.0</td><td>Akoya</td><td></td> <td>BioSciences-seção 5</td></tr><tr><td>PhenoImagerHT</td><td>Akoya BioSciences</td><td>CLS143455</td><td>seção 4, gerador de imagens de patologia digital com visualizador de lâminas e software de imagem (anteriormente conhecido como Vectra Polaris)</td></tr><tr><td>Meio de montagem Quick-D</td><td>Klinipath</td><td>7280</td><td>seção 2</td></tr><tr><td>QuPath 0.3.2</td><td></td><td></td><td>plataforma de software de análise de imagem de lâminas inteiras</td></tr><tr><td>R 4.1.1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caixas de lâminas</td><td>VWR</td><td>631-0737</td><td>secção 1</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>Thermo Scientific através da VWR</td><td>631-9483</td><td>secção 1</td></tr><tr><td>Software Vectra Polaris 1.0.13</td><td>Akoya BioSciences-secção</td><td></td> <td>4</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>VWR</td><td>4055-9005</td><td>Seção 2</td></tr></tbody></table>

análise imuno-histoquímica multiplex da paisagem espacial de células imunes do microambiente tumoral

Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment

A paisagem de células imunes do microambiente tumoral potencialmente contém informações para a descoberta de biomarcadores prognósticos e preditivos. A imuno-histoquímica multiplex é uma ferramenta valiosa para visualizar e identificar diferentes tipos de células imunes em tecidos tumorais, mantendo suas informações espaciais. Aqui, fornecemos protocolos detalhados para analisar populações de células linfocitárias, mieloides e dendríticas em seções de tecido. Desde o corte de seções embebidas em parafina fixadas em formalina, procedimentos automáticos de coloração multiplex em uma plataforma automatizada, digitalização das lâminas em um microscópio de imagem multiespectral, até a análise de imagens usando um algoritmo de aprendizado de máquina desenvolvido internamente ImmuNet. Esses protocolos podem ser aplicados a uma variedade de amostras de tumor simplesmente trocando os marcadores tumorais para analisar células imunes em diferentes compartimentos da amostra (tumor versus margem invasiva) e aplicar a análise do vizinho mais próximo. Esta análise não se limita a amostras de tumores, mas também pode ser aplicada a outros tecidos (não) patogênicos. As melhorias no equipamento e no fluxo de trabalho nos últimos anos reduziram significativamente os tempos de produção, o que facilita a aplicação futura desse procedimento no ambiente de diagnóstico.

Este protocolo descreve em detalhes como é realizada a caracterização das células imunes do microambiente tumoral usando imuno-histoquímica multiplex.

Análise Imuno-Histoquímica Multiplex da Paisagem Espacial de Células Imunes do Microambiente Tumoral

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. ...

Nosso objetivo é identificar a quantidade, o tipo e a localização das células imunes nos microambientes tumorais. No campo da imunoquímica, houve um grande avanço na tecnologia nos últimos anos. O avanço na tecnologia de imunoquímica multiplex permite que mais marcadores sejam estudados de forma confiável.Os desafios experimentais atuais são visualizar tipos específicos de células imunes em amostras de tumores, que foram superados usando os métodos de imunoquímica multiplex. No entanto, a análise automática precisa dessas imagens ainda é um desafio no qual estamos trabalhando. As diferenças entre o cenário de células imunes entre tumores primários e metastáticos geram questões como: quais propriedades intrínsecas do tumor impulsionam essas diferenças e o que essas diferenças significam para terapias que visam o sistema imunológico?Além de nosso trabalho exploratório, também nos concentraremos em questões clinicamente relevantes, como como a paisagem de células imunes do tumor é afetada por diferentes tipos de terapias anticâncer e se a paisagem de células imunes pode prever o resultado da terapia.

multiplex-immunohistochemical-analysis-spatial-immune-cell-landscape

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

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