Name: Pontuação de Inflamação, Desmielinização e Lesão do Axônio do Sistema Nervoso Central na Encefalomielite Autoimune Experimental (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprenda a pontuar inflamação, desmielinização e lesão axonal na medula espinhal e cérebro em camundongos com encefalomielite autoimune experimental. Este protocolo histológico avalia a gravidade da doença além da escala clínica.

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Agradecemos ao Dr. Raymond Sobel (Universidade de Stanford) por nos mostrar seu método de grossar e corrigir seções do cérebro e da medula espinhal. Agradecemos a Kyle Roberton e Milan Ganguly, do Toronto Centre for Phenogenomics, por aprenderem o método de incorporação e por cortarem tantas de nossas seções do cérebro e da medula espinhal. Agradecemos ao Dr. Matthew Cussick e ao Dr. Robert Fujinami (Universidade de Utah) por compartilharem seus protocolos para pontuar inflamação submeníngea e perivascular na medula espinhal. Agradecemos a Shalina Ousman por compartilhar o clone do anticorpo CD45. Agradecemos a Xiofang Lu pelo treinamento no processador de tecidos e na estação de incorporação de tecidos e pela manutenção deste equipamento no Keenan Research Centre of Biomedical Research no St. Michael's Hospital. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa Biomédica da MS Canada (para SED). Carmen Ucciferri é apoiada por um estudante do Governo do Canadá. Nuria Alvarez-Sanchez é apoiada por uma bolsa de pós-doutorado Keenan.

Coloração histológica da medula espinhal para avaliação da gravidade da doença EAE

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Shannon Dunn presta consultoria para FSD Lucid Psycheceuticals.

A coloração histológica da medula espinhal é uma ferramenta importante na avaliação da gravidade da doença EAE, particularmente nos casos em que há diferenças entre os grupos de tratamento na extensão da recuperação da doença na fase pós-aguda da doença. A coloração para infiltração de células imunes (CD45), mielina (LFB) e lesão axonal (SMI-32) ajuda a caracterizar a causa subjacente dos escores clínicos alterados em camundongos. O protocolo de coloração histológica aqui descrito fornece uma perspectiva da inflamação, bem como da extensão da mielina e da lesão axonal. Além disso, os resultados mostraram validar a medida do NFL-L como um método para avaliar a extensão do dano neuronal global em EAE.
Os parâmetros críticos para esta análise são garantir que os investigadores sejam cegados para a identidade das seções e que haja amostragem equivalente em cada nível da medula espinhal nos diferentes camundongos. Isso ocorre porque a gravidade da inflamação pode ser maior em níveis mais baixos do cordão. Outro parâmetro crítico é o tamanho dos grupos experimentais. A medula espinhal e os cérebros são tipicamente colhidos de 6 a 8 camundongos por grupo no final para ver diferenças significativas entre grupos com tratamentos ou genótipos com tamanhos de efeito modestos. Também é importante garantir que os camundongos selecionados, quando calculados em média, tenham escores médios representativos de todo o grupo. Em relação à solução de problemas, um problema comum encontrado por aqueles que não têm experiência com o protocolo é que a medula espinhal é fixada por um período insuficiente de tempo e não é facilmente extrudada da coluna vertebral. Se este for o caso, a medula espinhal pode ser dissecada manualmente da coluna por clipe ao longo dos processos espinhosos usando tesouras finas e abrindo a coluna para revelar a medula espinhal. Alternativamente, os tecidos podem ser fixados por alguns dias adicionais sem interferir no sucesso da coloração de anticorpos. Os clones de anticorpos aqui descritos funcionam em tecidos fixados até 2 semanas em formalina.
Incorporar as peças da medula espinhal requer habilidade e prática. Recomenda-se o uso de lupas oculares e a direção de uma lâmpada sobre a estação de incorporação para melhor visualizar se as seções estão caindo em seção transversal ou longitudinal. Manter os comprimentos dos pedaços da medula espinhal em menos de 2 mm durante a captação irá ajudá-los a cair na secção transversal. Outro problema comum encontrado para usuários menos experientes é que o LFB evapora durante a incubação durante a noite, deixando metade da lâmina manchada e metade sem manchas. Para evitar a evaporação, a placa de coloração de vidro deve ser selada com filme termoplástico e, em seguida, filme plástico. Se ocorrer evaporação e as seções forem coradas de forma desigual, recomenda-se desazular completamente as lâminas com carbonato de lítio e recolori-las novamente em LFB durante a noite. Outro problema comum é que os usuários não desazuisam totalmente a massa cinzenta após o LFB. É fundamental examinar seções individuais sob o microscópio para garantir que uma quantidade suficiente de desrubor tenha sido alcançada antes de prosseguir com outras etapas do protocolo. Além disso, embora as colorações de IHQ CD45 e SMI-32 tenham um desempenho robusto, ainda é importante identificar as concentrações de anticorpos em experimentos preliminares para cada novo lote de anticorpos recebido. Isso pode ser feito testando uma variedade de concentrações do anticorpo em uma seção de controle positivo (EAE medula espinhal). A primeira coloração também deve incluir um controle negativo que consiste em anticorpo secundário isolado sem adição de anticorpo primário. Finalmente, é fundamental na análise de imagens limitar imagens individuais, pois a coloração pode ser desigual entre slides ou seções.
Este protocolo utiliza software disponível gratuitamente. Se a pessoa não tiver acesso a um processador, um incorporador ou micrótomo, essas etapas podem ser fornecidas a um núcleo de patologia hospitalar que ofereça esses serviços. Além disso, se não tiver acesso a um scanner de lâminas, pode-se usar um microscópio de luz equipado com uma câmera de vídeo para salvar imagens TIFF da medula espinhal ou regiões cerebrais. Para um fluxo de trabalho baseado em microscópio, capture cortes LFB ou LFB/H&E em baixa potência (aumento de 40x) e para coloração de CD45 e SMI-32, imagine pelo menos quatro janelas centradas nas partes ventral, dorsal e lateral da medula espinhal (aumento de 200x para CD45 e aumento de 400x para SMI-32). A análise das imagens pode ser realizada para quantificar a coloração de maneira semelhante à descrita.
A decisão de qual abordagem histológica tomar para pontuar EAE depende do quanto os escores clínicos diferem entre os grupos. Por exemplo, se houver diferenças drásticas no escore clínico do EAE (um grupo recebeu EAE e outro não), isso geralmente está relacionado a diferenças na inflamação mediada por periféricos. Neste caso, pontuar a presença de lesões desmielinizantes nos cortes corados com BFL/H&E é suficiente e revelará diferenças entre os grupos. Se os grupos forem mais semelhantes no escore clínico no início e, em vez disso, houver diferenças na extensão da recuperação clínica (por exemplo, experimento na Figura 5A), é melhor aplicar o fluxo de trabalho histológico completo descrito aqui, incluindo a pontuação da inflamação cerebral no tronco cerebral e no cerebelo, para distinguir se as diferenças na cronicidade da doença estão relacionadas a diferenças na inflamação ou dano tecidual.  Se forem encontradas diferenças na inflamação, conforme avaliado pela contagem de CD45, estudos adicionais de IHQ podem ser feitos para corar células T (anti-CD3), monócitos/macrófagos infiltrantes (Mac3) e micróglia (Iba-1/TMEM119) (clones de anticorpos recomendados estão na Tabela Suplementar 3). A ativação da micróglia é refletida por um aumento na intensidade da coloração de Iba-1 na micróglia de dupla marcação Iba-1+TMEM-19+ e um aumento da retração dos processos da micróglia que pode ser avaliado pela análise Sholl nas seções32. Além disso, técnicas como citometria de fluxo ou sequenciamento de RNA de célula única podem ser aplicadas para conduzir uma caracterização mais profunda da frequência e fenótipo de populações imunes no cérebro e na medula espinhal.
A contagem de axônios SMI-32+ é um método sensível para detectar lesão axonal em EAE32,33 e em MS34. SMI-32, que detecta a forma não fosforilada de neurofilamento pesado ou médio acumula-se em bulbos terminais de neurônios transeccionados. Uma alternativa para detectar axônios lesados é a coloração com proteína precursora de amiloide (APP) que pode se acumular nos axônios como resultado da interrupção do transporte de axônios33. O padrão de coloração para SMI-32 e PFA, embora ambos reflitam lesão axonal, normalmente não se sobrepõem, indicando que estão detectando patologias diferentes33. Pode-se também complementar as medidas histológicas da lesão axonal medindo o NF-L, que é uma medida rápida e sensível da lesão axonal em curso tanto na medula espinhal quanto no cérebro. Ele oferece a vantagem de que pode ser feito em meio dia em ratos vivos. Uma desvantagem deste método é que os kits são caros e a máquina é altamente especializada. A empresa que vende o kit sNF-L oferece uma taxa de serviço para quem não tem acesso a uma máquina SIMOA. Uma alternativa para avaliar a lesão axonal é pontuar a perda axonal contando axônios em cortes corados com azul de toluidina da medula espinhal12 ou contando feixes de neurofilamentos detectados por SMI-31 em áreas da substância branca da medula espinhal32. Ambas as abordagens são mais trabalhosas do que a medida de SMI-32 ou sNF-L.
Se os escores clínicos do EAE diferirem entre os grupos, mas a pontuação para inflamação, desmielinização e lesão axonal não revelar diferenças entre os grupos, pode ser útil corar para ativação de astrócitos usando GFAP (ver Tabela Suplementar 3 para clone de anticorpos recomendado). A ativação astrocitária está associada a um aumento na coloração de GFAP e isso se correlacionou com a progressão do EAE em alguns modelos de EAE, incluindo EAE crônico no rato DA35.
Em conclusão, este protocolo descreve métodos e fornece um fluxo de trabalho de análise para conduzir a pontuação histológica do EAE.

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é o modelo murino mais comum para a doença desmielinizante humana, a Esclerose Múltipla (EM)1. A patologia inflamatória clássica da EM, incluindo a infiltração de células T helper produtoras de IFN-γ (gama) e IL-172, a infiltração de monócitos inflamatórios3, a formação de lesões desmielinizantes inflamatórias perivasculares e submeníngeas4 e a ocorrência de lesão axonal4 no sistema nervoso central (SNC), também é observada nas EAE 5,6,7,8,9. A semelhança nos mecanismos imunológicos entre EAE e MS tornou o EAE um modelo pré-clínico adequado para testar a eficácia e os mecanismos de ação de várias terapias imunológicas aprovadas para a EM, incluindo natalizumabe, fingolimode, fumarato de dimetilo e acetato de glatiramer (revisado em 1,5). Alguns regimes EAE modelam outros aspectos da patologia progressiva da EM além da lesão axonal, incluindo o desenvolvimento de inflamação submeníngea no cérebro, desmielinização crônica, atrofia medular, sinapse e perda de neurônios 6,10,11,12. Assim, a EAE tem utilidade para rastrear a eficácia de terapias neuroprotetoras para a SM.
EAE é induzido em roedores de várias maneiras. A imunização ativa é o método de indução mais comum e envolve a imunização de roedores com antígenos da mielina (proteínas integrais ou peptídeos) emulsionados em CFA suplementado com Mycobacterium tuberculosis morto pelo calor 13. Dependendo da cepa do camundongo, a toxina pertussis (PTX) também é administrada no dia 0 e no dia 2 da imunização para aumentar a penetrância da doença13. O EAE também pode ser induzido pela transferência adotiva de células T mielina-específicas obtidas de camundongos preparados com mielina/CFA para camundongos saudáveis14 ou pode se desenvolver espontaneamente em camundongos que superexpressam receptores de células T específicos para os principais antígenos da mielina5.
A gravidade e a progressão da doença EAE são comumente pontuadas usando uma escala clínica discreta de 5 pontos: 1 – claudicação da cauda, 2 – fraqueza dos membros posteriores ou pés, 3 – paralisia completa em um ou ambos os membros posteriores, 4 – fraqueza dos membros torácicos, 5 – moribundos ou mortos13. Esse sistema de escore clínico é sólido em documentar a progressão da paralisia ascendente que ocorre no início da doença, mas é menos sensível em capturar a extensão da recuperação de ataques inflamatórios do SNC. Por exemplo, tanto os ratos que deambulam com dificuldade como os ratos que deambulam facilmente, mas apresentam fraqueza de preensão dos pés, recebem uma pontuação de 2 na escala EAE. Os escores podem permanecer elevados na fase pós-aguda do EAE devido à presença de lesão ou perda permanente do axônio, mesmo apesar da resolução da respostainflamatória9. Houve uma variedade de tentativas de desenvolver sistemas de pontuação mais refinados, testes comportamentais, medidas de força de membros pélvicos e de preensão manual e sistemas de monitoramento infravermelho para melhor captar diferenças nos déficits clínicos em EAE9,16,17,18; no entanto, essas medidas de pontuação mais intrincadas não distinguem a contribuição da inflamação versus lesão tecidual para os déficits neurológicos subjacentes. Assim, a abordagem padrão-ouro para pontuar a gravidade do EAE é realizar pontuação clínica e histológica.
Aqui, é descrito um protocolo de como dissecar e incorporar espécimes da medula espinhal e do cérebro de camundongos em parafina de forma a capturar o processo estocástico de formação de lesões que ocorre no EAE. Também é apresentado um protocolo de como corar cortes com Luxol fast blue (LFB), originalmente criado por Kluver e Barrera19, que detecta mielina no SNC. Os cortes são corados apenas com LFB (para análise de desmielinização) ou são contracorados com hematoxilina e eosina (H&E) para ajudar a visualizar e pontuar lesões inflamatórias. Protocolos também são fornecidos para quantificar a presença de leucócitos totais (CD45), a perda de mielina e o número de axônios lesados (SMI-32) na medula espinhal usando anticorpos disponíveis comercialmente, técnicas de imuno-histoquímica (IHQ) e software de acesso público. O protocolo usado para quantificar leucócitos na medula espinhal também pode ser aplicado para quantificar leucócitos no cérebro.
A avaliação histológica da perda e lesão axonal no cérebro é comparativamente mais difícil do que na medula espinhal, uma vez que os tratos da substância branca cerebral não correm em paralelo uns aos outros. A medida da luz sérica de neurofilamentos (sNF-L) tem emergido como um promissor biomarcador de lesão neuronal naEM20,21. Estudos recentes têm estendido essa tecnologia para EAE 22,23,24. Aqui, um método é apresentado para medir a luz de neurofilamento sérico (sNF-L) em camundongos vivos usando um ensaio Small Molecule Assay (SIMOA). Este método requer apenas uma pequena quantidade de soro e pode ser feito em camundongos vivos em apenas meio dia, fornecendo feedback rápido sobre como uma terapia testada está afetando a lesão geral do SNC. Todos os métodos descritos aqui podem ser aplicados a camundongos de qualquer sexo ou linhagem.

<table><tbody><tr><td>10% Formalina Tamponada Neutra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>Usado para fixar amostras de medula espinhal e cérebro</td></tr><tr><td>1000 mL Copo de Vidro</td><td>Pyrex</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon Tube</td><td>Starstedt</td><td>62.554.100</td><td>Fixação e armazenamento de medula espinhal e cérebro</td></tr><tr><td>250 mL Erlenmeyer Flask</td><td>Pyrex</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Glass Beaker</td><td>Pyrex</td><td>1003</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 92 mm x 16 mm</td><td>Starstedt</td><td>82-1473-001</td><td>Usado no procedimento de macroscopagem de tecidos</td></tr><tr><td>Álcool etílico 95%</td><td>Álcoois comerciais</td><td>P016EA95</td><td>Etapas de desidratação e reidratação</td></tr><tr><td>ABC Elite Kit</td><td>Vector Labratories</td><td>PK6100</td><td>Usado para rotulagem imuno-histoquímica</td></tr><tr><td>Aqua Hold 2 PAP Pen</td><td>Cole Parmer</td><td>UZ-75955-53</td><td>Usado para desenhar em torno de seções de tecido em Imuno-histoquímica</td></tr><tr><td>Coloração Avidin/Biotina Kit de Bloqueio</td> de <td>Vetor Labratórias</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de Biossegurança</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>coelho biotinilado anti-rato IgG</td><td>Vector Labratories</td><td>BA-4000</td><td>Usado para coloração CD45</td></tr><tr><td>C57BL6/J Camundongos</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Stock # 664</td><td>Esses camundongos foram usados em experimentos mostrado em papel.</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Sorvall ST Plus</td><td></td></tr><tr><td>CitriSolv</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-121</td><td>Usado para desparafinagem. É uma alternativa ao xileno</td></tr><tr><td>DAB Kit</td><td>Vector Labratories</td><td>SK-4100</td><td>Usado para desenvolvimento em imuno-histoquímica</td></tr><tr><td>ddH2O</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Bisturi descartável</td><td>Magna</td><td>M92-10</td><td>Usado para grossing medula espinhal e cérebro</td></tr><tr><td>DWK Life Sciences (Wheaton) placa de coloração de vidro</td><td>Cole Parmer</td><td>UZ-48585-60</td><td>Usado para coloração histoquímica e lavagens</td></tr><tr><td>Rack de coloração de vidro DWK Life Sciences (Wheaton)</td><td>Cole Parmer</td><td>10061392</td><td>Usado para imuno-histoquímica e histoquímica</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Bioshop</td><td>173772-87-1</td><td>Cora citoplasma</td></tr><tr><td>Lâminas de micrótomo de penas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-634-1C</td><td>Usado para seccionar parafina</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Whatman</td><td>1001110</td><td>Usado para filtrar a formalina (durante a grossagem) e o luxol fast blue</td></tr><tr><td>Tesoura Cirúrgica Fina</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14160-10</td><td>Usado para cortar o cérebro e o crânio</td></tr><tr><td>Fumehood</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14190944</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>BioShop</td><td>ACE333.4</td><td>Usado no procedimento de coloração azul rápido luxol</td></tr><tr><td>Histoplex Histology Containers</td><td>Starplex Scientific</td><td>565-060-26</td><td>Fixação da medula espinhal e do cérebro</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>Fisher Chemicals</td><td>H325-500</td><td>Usado para remover a peroxidase endógena no tecido</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Kimtech Science</td><td>Kimwipes Kimberly Clark Professional</td><td>34155</td><td>Usado para imuno-histoquímica</td></tr><tr><td>Papel para lentes</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td>usado prendendo espécies da medula espinhal na gaveta durante o processamento</td></tr><tr><td>Microscópio claro</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Aldrich</td><td>554-13-3</td><td>De-azulamento após a coloração azul rápida do luxol</td></tr><tr><td>Sigma Aldrich</td><td>1328-51-4</td> do azul<td>de Luxol</td><td>colore</td></tr> o <tr>vetor <td>labratories</td><td>BMK-2202</td> do<td>jogo de imunodetecção do mielin M.O.M</td> do <td>CNS usado a mancha SMI-32</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A454.2</td><td>Usado para fixação</td></tr> Ciências <tr>de <td>Microscopia Eletrônica</td><td>de Hematoxilina de Mayer</td><td>26381-02</td><td>Mancha núcleos</td></tr><tr><td>Micro-Adson Fórceps com Dentes</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11027-12</td><td>Usado para refletir o crânio durante dissecações</td></tr><tr><td>Microcentrífuga&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Modelo 5417R</td><td></td></tr><tr><td>Microvette Tubos Capilares CB 300 Z</td><td>Starstedt</td><td>16.440.100</td><td>Usado para coleta de sangue</td></tr><tr><td>Vidro de Cobertura Micrscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545A</td><td>Usado para cobertura de lamínula</td></tr><tr><td>Mini Shaker</td><td>VWR</td><td>12620-938</td><td>Usado para fazer buffers</td></tr><tr><td>Kit de luz NF</td><td>Quanterix</td><td>103186</td><td>Este kit pode ser usado para detecção de neurofilamento solúvel em camundongo ou humano em luvas</td></tr><tr><td>de nitrilo</td> de soro <td>VWR</td><td>76307-462</td><td>Labratories de vetor</td></tr><tr><td>de soro de cabra normal</td> de segurança <td></td><td>S-1000</td><td>Reagente de bloqueio</td></tr><tr><td>Labratories de vetor</td> de<td>soro normal de coelho</td><td>S-5000</td><td>Reagente de bloqueio</td></tr><tr><td>OmniSette Tissue Cassettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>M4935FS</td><td>Usado para incorporar a medula espinhal e o cérebro</td></tr><tr><td>p1000 Pipeta e pontas</td>, <td>várias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipetas e pontas p200</td>, <td>várias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>estações de incorporação de parafina</td><td>Leica Biosystems</td><td>Modelo EG1160</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Medium</td><td>Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td>Usado para incorporar a medula espinhal e o cérebro</td></tr><tr><td>Permount Mounting Médio</td><td>Fisher Chemicals</td><td>SP15-100</td><td>Usado para montar lamínulas em lâminas</td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Fisher Scientific</td><td>13636AB315B</td><td>Usado para tampões de pH</td></tr><tr><td>Pipetas de Transferência de Plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td>Usado para tampões de pH Cloreto de</td></tr><tr><td>Potássio</td><td>BioShop</td><td>7447-40-7</td><td>Usado para fazer</td></tr><tr><td>PBS Fosfato de Potássio Monobásico</td><td>BioShop</td><td>7778-77-0</td><td>Usado para fazer</td></tr><tr><td>PBS Panela de Pressão</td><td>Nordic Ware</td><td>Tender Cooker</td><td></td></tr><tr><td>Rato purificado anti-rato CD45</td><td>Vector Labratories</td><td>553076</td><td>Detecta leucócitos</td></tr><tr><td>Álcool de grau reagente 100%</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td>Etapas de desidratação e reidratação</td></tr><tr><td>Álcool de grau reagente 70%</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td>Desidratação e </td></tr><tr><td>micrótomo rotativo</td><td>Leica Biosystems</td><td>Modelo RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Simoa Machine</td><td>Quanterix</td><td>HD-X</td><td></td></tr><tr><td>Scanner de slides</td><td>Zeiss</td><td>AxioScan.Z1</td><td></td></tr><tr><td>SMI-32 camundongo IgG1 anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>801701</td><td>Detecta axônios danificados</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>BioShop</td><td>7647-14-5</td><td>Usado para fazer PBS</td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio Dibásico&nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>7558-79-4</td><td>Usado para fazer PBS</td></tr><tr><td>Standard Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11150-10</td><td>Usado para etapas de dissecação</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Lâminas de microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Usado para coletar seções</td></tr><tr><td>Cortes Cirúrgicos Resistentes</td><td>Ferramentas de Fine Science</td><td>14110-15</td><td>Usado para cortar a coluna, parede do corpo e pele</td></tr><tr><td>Processador de Tecidos</td><td>Leica Biosystems</td><td>Modelo TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de Tri-soldium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-04-6132</td><td>Usado para recuperação de antígeno</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioBasic</td><td>9005-64-5</td><td>Usado para lavar seções</td></tr><tr><td>X-P Pierce XP-100 selo de placa</td><td>Excel Scientific</td><td>12-140</td><td>Usado para o ensaio sNF-L</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher Chemicals</td><td>1330-20-7</td><td>Usado para desparafinar e limpar seções</td></tr><tr><td>Funil</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-63100-64</td><td>Usado para filtrar formalina antes de grossar o tecido</td></tr><tr><td>Placa de agitação</td><td>Qualquer</td><td></td><td>Usado para fazer soluções</td></tr><tr><td>Forno</td><td>Qualquer</td><td></td><td>Usado para assar seções de tecido após o corte</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>13-374-10</td><td>Usado para selar o prato de coloração LFB</td></tr><tr><td>Microondas</td><td>Qualquer</td><td></td><td>O tempo pode variar dependendo do modelo de micro-ondas</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Usado para fazer tampão de bloqueio</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408--129</td><td>Usado para armazenar amostras de soro de camundongo</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Any</td><td></td><td>Usado para preparar amostras para o ensaio sNF-L</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Any</td><td></td><td>Usado para aquecer substrato enzimático para ensaio sNF-L</td></tr></tbody></table>

pontuação de inflamação, desmielinização e lesão do axônio do sistema nervoso central na encefalomielite autoimune experimental

Scoring Central Nervous System Inflammation, Demyelination, and Axon Injury in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo comum de esclerose múltipla (EM) de base imunológica. Esta doença pode ser induzida em roedores pela imunização ativa com componentes proteicos da bainha de mielina e adjuvante completo de Freund (CFA) ou pela transferência de células T efetoras específicas da mielina de roedores preparados com proteína mielina/CFA para roedores virgens. A gravidade do EAE é tipicamente pontuada em uma escala clínica de 5 pontos que mede o grau de paralisia ascendente, mas essa escala não é ideal para avaliar a extensão da recuperação do EAE. Por exemplo, os escores clínicos permanecem altos em alguns modelos de EAE (por exemplo, modelo de EAE induzido por peptídeo de glicoproteína de oligodendrócitos de mielina [MOG]), apesar da resolução da inflamação. Assim, é importante complementar o escore clínico com o escore histológico do EAE, que também fornece um meio para estudar os mecanismos subjacentes da lesão celular no sistema nervoso central (SNC).
Aqui, um protocolo simples é apresentado para preparar e manchar seções da medula espinhal e do cérebro de camundongos e para pontuar inflamação, desmielinização e lesão axonal na medula espinhal. O método para pontuar a infiltração leucocitária na medula espinhal também pode ser aplicado para pontuar a inflamação cerebral no EAE. Um protocolo para medir a luz solúvel de neurofilamentos (sNF-L) no soro de camundongos usando um ensaio Small Molecule Assay (SIMOA) também é descrito, o que fornece feedback sobre a extensão da lesão global do SNC em camundongos vivos.

A Figura 3 mostra coloração histoquímica e histoquímica representativa, com exemplos de lesões agudas (esquerda) e mais antigas (direita). A coloração representativa de CD45 com contracoloração de hematoxilina é mostrada na Figura 3A,B.  A Figura 3C–F mostra exemplos de coloração LFB com (Figura 3C,D) ou sem (Figura 3E,F) a contracoloração H&amp;E. Embora a hematoxilina não seja específica das células imunes, os núcleos das células imunes mancham mais escuramente e podem ser distinguidos das células residentes no SNC. A Figura 3G,H mostra coloração representativa dos axônios SMI-32+, contracorados com hematoxilina. Observe o aumento do aparecimento desta mancha em lesões mais antigas do EAE.
A lesão dos trajetos mielinizados é mais prevalente na medula espinhal em EAE murinas ativas e este é o principal fator de paralisia nessa doença 7,9. Assim, a pontuação para a presença de inflamação e dano tecidual na medula espinhal é priorizada nas análises histológicas. As lesões do EAE ocorrem esporadicamente em diferentes regiões (anterior, lateral ou dorsal) (Figura 2A,B) e em diferentes níveis (sacral, lombar, torácico, cervical) da medula espinhal. O método de incorporação descrito garante uma boa amostragem das lesões em todo o cordão. Mais seções são incorporadas do que analisadas, uma vez que algumas seções podem ficar danificadas no processo de processamento ou seccionamento. Para garantir uma amostragem representativa, um mínimo de 3 cortes representativos são analisados nos níveis cervical, torácico e lombar da medula espinhal para cada camundongo. A identidade de cada espécime é cega para que a pessoa que conduz a análise não seja tendenciosa ao selecionar seções representativas para análise.
Para obter insights rápidos sobre as diferenças na gravidade histológica das EAE, pode-se pontuar a presença de lesões desmielinizantes submeníngeas nos quadrantes da medula espinhal em cortes selecionados (Figura 2A,B). Este é um método rápido que pode ser realizado em imagens digitalizadas ou usando um microscópio de luz. Essa análise é sensível o suficiente para detectar diferenças na gravidade histológica do EAE entre os grupos quando o EAE é grave em um grupo e leve em outro. Por exemplo, no experimento da Figura 4, EAE foi induzido em fêmeas selvagens (WT) e camundongos com deleção em OGR1 (OGR1 KO) usando MOG p35-55/CFA mais PTX. Camundongos do grupo WT desenvolveram EAE grave com paralisia completa, enquanto o grupo knockout OGR1 desenvolveu doença leve. Essa diferença no escore clínico correspondeu a uma diferença na fração de quadrantes que apresentavam lesões submeníngeas (Figura 4C).
É importante complementar a pontuação de lesões desmielinizantes com fração de área percentual da coloração de mielina para capturar a extensão da perda de mielina e/ou axônios mielinizados durante o ataque autoimune. No exemplo da Figura 4, a porcentagem de fração de mielina também diferiu significativamente entre os camundongos OGR1 e WT (Figura 4D). A porcentagem de fração de mielina também se correlaciona significativamente com o escore cumulativo de EAE em camundongos com EAE (Figura 4E) e, portanto, serve como uma boa medida do dano tecidual geral nesta doença. Note que este protocolo não distingue a intensidade da coloração de mielina. Se este for o resultado desejado, deve-se realizar a coloração por imunofluorescência para proteínas da mielina, como a proteína proteolipídica ou a proteína básica da mielina, e medir a intensidade dessa coloração.
No caso de EAE grave em ambos os grupos comparadores, uma fração maior dos quadrantes medulares conterá lesões inflamatórias/desmielinizantes. Nesse caso, uma abordagem mais sensível para pontuar a inflamação é contar o número de leucócitos CD45+ por mm2 de substância branca (ver coloração representativa na Figura 3A). O clone de anticorpos CD45 descrito aqui detecta todos os leucócitos infiltrantes e apenas cora microglias ocasionais que regulam a expressão de CD45 no EAE (ver seta aberta na Figura 3B) e, portanto, é útil na captura da infiltração de células imunes periféricas.
Em estudos de EAE de longo prazo (&gt;20 dias), recomenda-se que se realize também uma análise da lesão axonal. A coloração SMI-32 em cortes da medula espinhal é um método sensível para detectar axônios danificados. Embora a inflamação na medula espinhal diminua com o tempo e os axônios poupados possam se remielinizar, os axônios sobreviventes exibem uma extensão diferencialde lesão residual9 (Figura 3G,H). Por exemplo, no modelo de EAE induzido por MOG p35-55 em camundongos C57BL6/J, a extensão da lesão axonal e a perda são um direcionador dos escores clínicos após a diminuição do processo inflamatório9. A Figura 5 mostra um exemplo disso em um experimento EAE em camundongos WT machos e fêmeas que são deficientes em um gene chamado receptor delta ativado por proliferador de peroxissoma (PPAR-delta) no compartimento mieloide (LysMCre: Ppardfl/fl). Nos machos, os camundongos WT recuperaram a função dos membros posteriores, mas os escores clínicos permaneceram altos no grupo machos LysMCre: Ppardfl/fl. Por outro lado, no experimento no sexo feminino, ambos os grupos experimentais tiveram escores altos durante todo o experimento. À primeira vista, esse resultado sugeriu que o PPAR-delta tinha um efeito sexo-específico em EAE; no entanto, a pontuação patológica da medula espinhal revelou que camundongos de ambos os sexos no grupo LysMCre: Ppardfl/fl tiveram lesão axonal aumentada em comparação com os colegas WT (Figura 5B). Um efeito genotípico nos escores clínicos provavelmente não foi observado em fêmeas porque camundongos fêmeas WT tenderam a exibir lesão axonal aumentada, que se manifestou em déficits neurológicos crônicos.
Neste mesmo experimento, fêmeas de camundongos fêmeas LysMCre: Ppardfl/fl apresentaram infiltração de células T mais extensa no cerebelo, fornecendo um exemplo de como a inflamação cerebral pode ser útil no EAE. Nas EAE, a inflamação no cérebro é predominantemente encontrada no cerebelo e tronco cerebral (Figura 6A,D,G), mas também pode ser encontrada nas meninges (vistas sob o hipocampo na Figura 6C), próximas aos ventrículos (Figura 6F) e em outros tratos da substância branca, incluindo o nervo óptico e o corpo coloso (Figura 6B,E). A pontuação da inflamação cerebral é feita em uma região específica do cérebro (por exemplo, substância branca cerebelar) contando o número de células CD45 por região de tecido mm2 usando a mesma metodologia descrita para o protocolo da medula espinhal. No método de grosseamento aqui descrito, um corte é no meio do cerebelo, o que fornece a perspectiva do cerebelo e do tronco cerebral, como mostrado na Figura 6A.
A mensuração do NFL-L por meio do ensaio SIMOA tornou-se um biomarcador útil para avaliar a lesão axonal em curso e as respostas à terapia na EM remitente-recorrente 20,21,27,28. O mesmo kit de ensaio SIMOA usado para medir sNF-L em humanos pode ser aplicado para medir sNFL em camundongos 22,23,24. Para explorar o desempenho deste ensaio na detecção de lesão axonal em EAE, o sNF-L foi medido em camundongos fêmeas C57BL6/J no ponto final de um experimento de EAE e os níveis foram comparados com aqueles em camundongos controles saudáveis pareados por sexo que não tinham EAE. Verificou-se que camundongos com EAE apresentaram níveis muito mais elevados de sNF-L do que em camundongos saudáveis (Figura 7A) e esses níveis se correlacionaram com a densidade de axônios SMI-32+ na medula espinhal (Figura 7B). Em comparação com a pontuação histológica da lesão axonal, o ensaio SIMOA é mais rápido (de camundongos sangrando a resultados podem ser alcançados em pouco mais de meio dia) e, portanto, fornece feedback rápido de como um tratamento está funcionando em camundongos vivos. Este ensaio também tem a vantagem de refletir a lesão axonal na medula espinhal e no cérebro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig01.jpg"> Figura 1: Bloqueio representativo em parafina de cortes cerebrais e medulares. As 5 seções cerebrais coronais e as seções transversais da medula espinhal (1,5–2 mm de espessura) estão embutidas no mesmo bloco para que possam ser cortadas em uma seção. Pelo menos 15 seções da medula espinhal devem ser incorporadas, permitindo a seleção adequada de cortes para análise. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig02.jpg"> Figura 2: Pontuação da inflamação meníngea e porcentagem de área de mielina ao nível da medula espinhal torácica. (A,B) mostram imagens da medula espinhal torácica de um camundongo fêmea C57BL6/J com EAE induzido por MOG p35-55 corado com LFB/H&amp;E. Mostra-se a abordagem utilizada para visualização de quadrantes e exemplos de lesões desmielinizantes (traçadas em linha pontilhada). O camundongo em A tem 4 de 4 quadrantes com lesões desmielinizantes confluentes, enquanto o camundongo em B tem 1 de 4 quadrantes afetados. O camundongo em B tem alguma inflamação em outros quadrantes, mas isso não se manifestou em uma lesão confluente e, portanto, não é pontuado. (C-E) Exemplo de imagem LFB e a imagem em escala de cinza e limite no imageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig03.jpg"> Figura 3: Cortes medulares corados com CD45, LFB H&amp;E, LFB e SMI-32. Exemplos de lesão submeníngea precoce (A,C,E,G) e tardia (B,D,F,H) NA MEDULA ESPINHAL CORADOS PARA ANTICORPOS CD45 (A,B), LFB/H&amp;E (C,D), LFB isolados (E,F) e SMI-32 (G,H). As setas pretas mostram exemplos de células coradas com cada respectivo anticorpo. As setas brancas mostram uma possível micróglia corada como CD45+. Barra de escala = 50 μm. Esta figura mostra a coloração representativa de lesões na medula espinhal de uma fêmea de camundongo C57BL6/J durante EAE e destaca como a patologia pode ser diferente em diferentes cortes da medula espinhal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig04v2.jpg"> Figura 4: Aplicação do escore para lesões e porcentagem de desmielinização em EAE. Mostrado é um exemplo de um experimento EAE onde camundongos fêmeas deficientes no gene do receptor acoplado à proteína G do câncer de ovário 1 (OGR1) no fundo C57BL6/J desenvolveram EAE clínico menos grave do que camundongos fêmeas C57BL6/J wildtype (WT). EAE foi induzida pela imunização com MOG p35-55/CFA mais PTX e os camundongos foram pontuados de acordo com a seguinte escala clínica: 1 = paralisia da cauda. 2 = fraqueza dos membros posteriores e pés, 3 = paralisia dos membros posteriores, 4 = fraqueza dos membros torácicos, 5 = moribundos. (A) Média + EPM dos escores clínicos de camundongos ao longo do tempo. (B) Mostra-se um exemplo de coloração LFB/H&amp;E na medula ventral. Barra de escala = 50 μm. (C) Quadrantes médios + EPM que continham lesões desmielinizantes. (D) Média + percentual de EPM desmielinização em cada grupo. (E) mostra o resultado de outro experimento em EAE induzido por MOG p35-55 em camundongos C57BL6/J, onde os escores de EAE de camundongos individuais foram somados ao longo dos 30 dias de observação e foram correlacionados com a porcentagem de desmielinização na medula espinhal. As correlações foram realizadas por meio do teste de Spearman. Os painéis em (A–D) são adaptados de Souza C et al.29. Os dados em (E) são dados originais. *P&lt;0,05, **P&lt;0,01, **P&lt;0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig04largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig05.jpg"> Figura 5: Aplicação da coloração SMI-32 para entender o efeito de um genótipo no fenótipo clínico do EAE. Esta figura mostra um exemplo de um experimento EAE onde machos e fêmeas selvagens (carregam o alelo floxado de Ppard) e camundongos mutantes mieloides específicos de Ppard (LysMCre: Ppardfl/fl) no fundo C57BL6/J foram imunizados com MOG p35-55/CFA e PTX e foram acompanhados por 45 dias. (A) mostra a média + EPM dos escores clínicos dos camundongos. (B) mostra resultados médios + EPM da pontuação histológica do número de axônios SMI-32+ na medula espinhal, %quadrantes com lesões submeníngeas, quadrantes percentuais com manguitos perivasculares e #CD3 lesões no cerebelo pormm2 de tecido. Este experimento mostrou efeito genotípico na coloração SMI-32. Esta figura é adaptada de Drohomyrecky. et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig06.jpg"> Figura 6: Exemplos de coloração CD45+/hematoxilina em cortes coronais cerebrais em EAE induzido por MOG p35-55 em camundongos fêmeas C57BL6/J. As lesões CD45+ são mostradas em marrom. (A) Lesões CD45+ no tronco encefálico de cortes coronais. Barra de escala = 150 μm. (B-G) Exemplos de lesões CD45+ nos nervos ópticos (B), extensões meníngeas sob o hipocampo (C), tronco cerebral (D), corpo coloso (E), habênula medial próxima ao ventrículo (F) e cerebelo (G).  Barra de escala: (B–G) = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig07v2.jpg"> Figura 7: Níveis séricos de NFL-L no GEA induzido por MOG p35-55. (A) Níveis séricos de NFL coletados de fêmeas de camundongos controle e EAE no ponto final de um experimento. Os dados foram analisados pelo teste bicaudal de Mann Whitney. (****p valor &lt; 0,0001). (B) Os cortes medulares foram retirados no ponto final e corados com SMI-32. O número de células positivas por área de tecido da substância branca foi determinado e correlacionado com NF-L sérico ao final usando o teste de Spearman. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig07largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela Suplementar 1: Descrição dos banhos utilizados no processamento de tecidos. Os são movidos automaticamente através desta série de banhos usando um processador automatizado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/JOVESupplementaryTable1.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 2: Passos na coloração Luxol Fast Blue e Hematoxilina e Eosina. Esta tabela descreve a ordem dos passos no protocolo de coloração Luxol Fast Blue e Hematoxilina e Eosina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/JOVESupplementaryTable2.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 3: Anticorpos utilizados para coloração imunoistoquímica. São descritos os anticorpos que são usados neste protocolo, bem como aqueles que podem ser usados para explorar mais a inflamação, microgliose e astrogliose. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/SupplementaryJOVETable3_Revised(1).zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela suplementar 4: Como converter arquivos .czi em TIFF. Observe que é ideal usar uma imagem de alta resolução, mas imagens de resolução média podem ser salvas em vez disso se a memória de trabalho do computador for limitada. É imprescindível o uso de imagens da mesma resolução em todas as análises. Além disso, observe que a última imagem da série é o rótulo do slide. Evite ler o rótulo para garantir que a análise seja cega. 30,31 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/SupplementaryJOVETable4.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) serve como modelo animal de esclerose múltipla. Este artigo descreve uma abordagem para pontuar inflamação medular, desmielinização e lesão axonal em EAE. Adicionalmente, um método para quantificar os níveis de luz solúvel dos neurofilamentos no soro de camundongos é apresentado, facilitando a avaliação da lesão axonal em camundongos vivos.

Pontuação de Inflamação, Desmielinização e Lesão do Axônio do Sistema Nervoso Central na Encefalomielite Autoimune Experimental

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a common immune-based model of multiple sclerosis (MS). This disease can be induced in rodents by ...

Estamos interessados em entender como a autoimunidade e a esclerose múltipla ou esclerose múltipla começam. Esta pesquisa utiliza uma variedade de abordagens para estudar como os fatores de risco associados à SM. Levar ao desenvolvimento de autoimunidade. A encefalomielite autoimune experimental ou EAE é um modelo de EM em camundongo que pode ser usado para examinar o efeito de vários fatores de risco na autoimunidade.Descobrimos recentemente o caminho biológico de como um fator de risco da esclerose múltipla, a obesidade, leva a uma inflamação autoimune aumentada em camundongos. Estudos no modelo EAE foram fundamentais para desvendar esses mecanismos. A gravidade da doença EAE é frequentemente pontuada em uma escala clínica de cinco pontos.No entanto, essa escala tem sensibilidade limitada e não consegue distinguir se os déficits clínicos são impulsionados por inflamação ou dano tecidual. A histologia da medula espinhal e do cérebro é o método padrão-ouro para avaliar a inflamação e o dano tecidual no EAE. Este protocolo fornece um método simples para medir a inflamação e o dano tecidual na medula espinhal e no cérebro durante o EAE.Nosso protocolo pode ser utilizado juntamente com a escala clínica para melhor caracterizar a gravidade do EAE. Nosso protocolo mede as principais características histológicas do EAE, incluindo infiltração imunológica, desmielinização, dano axonal na medula espinhal e inflamação cerebral. Também inclui a medição da luz do neurofilamento no soro de camundongos, o que indica a extensão da lesão do SNC.Este protocolo abrangente fornece uma caracterização mais detalhada das EAE, do que a utilização de apenas um marcador.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o placar de indução e clínicos de um modelo animal de esclerose múltipla: doenças crônico-recidivante encefalomielite autoimune experimental em ratos DA. A doença, induzida pela imunização ratos com uma emulsão contendo medula espinhal de ratos inteiros e adjuvante de Freund completo, apresenta sinais clínicos semelhantes à doença humana.

Indução e pontuação clínica de doenças crônico-recidivante encefalomielite autoimune experimental

Este vídeo demonstra o método de indução de encefalomielite autoimune experimental (EAE) injetando peptídeos derivados de mielina com um adjuvante para ativar células T autorreativas, que migram para o cérebro. A toxina da coqueluche é administrada para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que essas células T e outras células imunológicas entrem no cérebro. Essas células imunes causam desmielinização, levando ao comprometimento da transmissão nervosa e ao...

Geração de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Neste vídeo, um modelo de camundongo com esclerose múltipla é estabelecido usando encefalomielite autoimune experimental (EAE). O camundongo é injetado com uma emulsão contendo um peptídeo neuronal e um adjuvante, desencadeando uma resposta imune que ativa as células T autorreativas. Isso é seguido por uma injeção de toxina coqueluche (PTX) para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que as células T autorreativas se infiltrem no cérebro. Essa infiltração inicia uma...

Indução de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal estabelecido de esclerose múltipla. C57BL / 6 são imunizados com mielina de oligodendrócitos glicoproteína (MOG) peptídeo 35-55 (MOG 35-55), o que resulta em uma paralisia flácida ascendente causada por células imunes autorreactivas no sistema nervoso central. Protocolos para indução e monitoramento de doenças serão discutidos.

Mielina Oligodendrocyte glicoproteína (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induzida Encefalomielite Auto-imune Experimental (EAE) em murganhos C57BL / 6

Este manuscrito descreve os métodos de indução e pontuação do modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE), juntamente com a avaliação da distribuição de células imunes e níveis de citocinas de mRNA em linfonodos, baço, sangue e medula espinhal usando citometria de fluxo e PCR quantitativo, respectivamente, em várias fases da doença.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

Aqui, apresentamos os protocolos para investigar o comprometimento da unidade neurovascular durante encefalomielite auto-imune experimental in vivo. Abordamos especificamente como determinar a permeabilidade da barreira hemato - encefálica e gelatinase atividade envolvida na migração de leucócitos através da limitans da glia.

Visualizando o comprometimento das barreiras endoteliais e Glial da unidade Neurovascular durante encefalomielite auto-imune Experimental In Vivo

Este manuscrito apresenta um protocolo para induzir encefalomielite autoimune experimental ativa (EAE) em camundongos. Um método de isolamento e caracterização dos linfócitos infiltrados no sistema nervoso central (SNC) também é apresentado para mostrar como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune cns.

Análise Citométrica de Fluxo de Infiltração linfócito no Sistema Nervoso Central durante Encefalomielite Autoimune Experimental

O presente protocolo descreve a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo utilizando glicoproteína de oligodendrócitos de mielina e monitorando o processo da doença usando um sistema de pontuação clínica. Os sintomas experimentais relacionados à encefalomielite autoimune são analisados usando tomografia microcomputadorizada de fêmur de camundongo e teste de campo aberto para avaliar o processo da doença de forma abrangente.

Indução e Diversos Indicadores de Avaliação da Encefalomielite Autoimune Experimental

Até o momento, os protocolos para o isolamento simultâneo de todos os principais tipos celulares residentes no sistema nervoso central do mesmo camundongo são uma demanda não atendida. O protocolo mostra um procedimento aplicável em camundongos ingênuos e experimentais com encefalomielite autoimune para investigar redes celulares complexas durante a neuroinflamação e, simultaneamente, reduzir o número necessário de camundongos.

Isolamento Simultâneo dos Principais Tipos Celulares Residentes no Sistema Nervoso Central de Camundongos Adultos com Encefalomielite Autoimune

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal de esclerose múltipla (EM), que compartilha com a doença humana uma resposta autoimune humoral robusta. Aqui, relatamos um protocolo ELISA simples e flexível para quantificar autoanticorpos no soro de camundongos imunizados com EAE.

Quantificação de anticorpos autorreativos em camundongos após encefalomielite autoimune experimental

Aprenda a pontuar inflamação, desmielinização e lesão axonal na medula espinhal e cérebro em camundongos com encefalomielite autoimune experimental. Este protocolo histológico avalia a gravidade da doença além da escala clínica.

Pontuação de Inflamação, Desmielinização e Lesão do Axônio do Sistema Nervoso Central na Encefalomielite Autoimune Experimental

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