Name: Extração de DNA de Diatomáceas de Amostras de Água e Tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T13:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 20 s
Description: Aprenda a extrair DNA de diatomáceas de amostras de água e tecidos pulmonares usando um kit modificado. Este método simples e econômico auxilia investigações forenses de afogamento.

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Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82060341,81560304) e pelo Projeto de Pesquisa Científica da Plataforma de Inovação Acadêmica da Província de Hainan (YSPTZX202134).

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Hainan Medical University. As amostras de tecido utilizadas neste estudo não são consideradas estudos envolvendo seres humanos. Esses espécimes foram obtidos para fins de diagnóstico patológico forense, e o restante foi usado para a extração de DNA de diatomáceas neste experimento. Os pesquisadores não podem identificar prontamente os indivíduos para obter o consentimento informado das partes interessadas relevantes.
OBS: Para garantir a aplicabilidade geral do método de pesquisa relatado neste experimento, este experimento seguiu basicamente as instruções de operação do kit utilizado, sendo que apenas algumas etapas foram modificadas. As amostras de água utilizadas neste experimento foram retiradas aleatoriamente de lagoas próximas ao laboratório (Figura 1A Suplementar). Neste experimento, o tecido pulmonar do corpo afogado foi confirmado como tecido de pesquisa para demonstrar o protocolo de extração (Figura 1B Suplementar). Na prática forense, às vezes também é necessário usar outros órgãos e tecidos de corpos afogados (como fígado, baço, rim, medula óssea, etc.) para extrair o DNA das diatomáceas, o que requer pequenas melhorias correspondentes a este método experimental, que serão explicadas na seção correspondente do experimento. As amostras de tecido pulmonar utilizadas neste experimento foram provenientes de cadáveres claramente afogados em casos forenses. Testes morfológicos têm sido realizados para comprovar que o tecido pulmonar contém diatomáceas (Figura 2 Suplementar).
1. Pré-tratamento das amostras
<ol><li>Pré-tratamento de amostras de água<ol><li>Levar 10 mL de amostra de água para o tubo da centrífuga e centrifugar a 13.400 x g por 5 min. Descarte cuidadosamente 9,8 mL de sobrenadante com uma pistola de pipeta e transfira cerca de 200 μL de amostra de água de diatomácea enriquecida restante no fundo para um tubo de centrífuga de 2 mL. NOTA: O pré-experimento pode ser realizado primeiro, e a quantidade inicial pode ser aumentada se uma amostra de água de 10 mL não for suficiente para o enriquecimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Pré-tratamento de amostras de tecido<ol><li>Tome 0,5 g do tecido da margem pulmonar do corpo afogado, pique totalmente ou triture o tecido pulmonar até que fique lamacento. Prevenir a contaminação de diatomáceas exógenas é o cerne desta etapa. Corte o tecido em pedaços repetidamente usando uma tesoura.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Extração de DNA
NOTA: Todas as etapas de centrifugação são concluídas à temperatura ambiente. Usando uma centrífuga de mesa com uma força centrífuga de 14.500 x g; um banho-maria (ou banho metálico) pré-aquecido a 70 °C precisa ser preparado antes do início do experimento. Todas as etapas devem seguir rigorosamente os princípios de operação asséptica.
<ol><li>Montagem de amostras de água e tecidos NOTA: A amostra de água e o método de extração de DNA de diatomáceas de tecido são os mesmos.<ol><li>Adicionar esferas de vidro a um tubo de centrifugação de 2 mL contendo a amostra de água pré-tratada. Inverta 10x-15x para misturar bem. As contas de vidro adicionadas são compostas de contas de vidro grandes e pequenas misturadas em uma proporção de massa de 1:1. O diâmetro das contas de vidro grandes é de 1,5-2,0 mm e das contas de vidro pequenas é de 0,4-0,6 mm.</li>
		<li>Tome 0,5 g de tecido finamente picado, adicione contas de vidro a um tubo de centrífuga de 2 mL contendo o tecido, conforme descrito acima. Inverta 10x-15x para misturar.</li>
	</ol></li>
	<li>Adicionar 40 μL de proteinase K (20 mg/mL) aos tubos. Coloque em temperatura ambiente por 15 min, durante esse período, inverta e misture 10x a cada 3 min. NOTA: Se o tecido não for totalmente digerido, a quantidade de proteinase K pode ser adequadamente aumentada até que a solução se torne clara.</li>
	<li>Adicionar 200 μL de tampão de ligação aos tubos da centrífuga, imediatamente vórtice, e misturar durante 4 min (frequência de mistura de oscilação: 3000 rpm). NOTA: Nesta etapa, a intensidade e o tempo de agitação devem ser rigorosamente controlados para garantir intensidade e tempo de mistura suficientes.</li>
	<li>Coloque os tubos de centrifugação em banho-maria a 70 °C por 10 minutos e a solução fica límpida.</li>
	<li>Adicionar 100 μL de isopropanol aos tubos da centrífuga, vórtice e misturar por 15 s, precipitação floculenta pode aparecer neste momento. NOTA: É muito importante misturar bem com a força adequada nas etapas de operação acima, mas o tremor vigoroso deve ser evitado para evitar o cisalhamento do DNA.</li>
	<li>Colocar a solução obtida na etapa anterior juntamente com o precipitado floculante na coluna de adsorção (a coluna de adsorção é colocada no tubo de coleta). O comprimento da coluna de adsorção é de 3,0 cm, o diâmetro é de 1,0 cm e a matriz de adsorção é a membrana da matriz de silício.</li>
	<li>Centrifugar a 8.000 x g por 30 s, descartar o líquido residual no tubo de coleta e colocar a coluna de adsorção de volta no tubo de coleta.</li>
	<li>Adicionar 500 μL de tampão de remoção do inibidor à coluna de adsorção. Centrifugar a 13.400 x g por 30 s e descartar o líquido residual no tubo de coleta.</li>
	<li>Adicionar 700 μL de tampão de lavagem à coluna de adsorção. Centrifugar a 13.400 x g por 30 s e descartar o líquido residual no tubo de coleta. NOTA: Adicione a quantidade especificada de etanol absoluto ao frasco tampão de lavagem antes da primeira utilização.</li>
	<li>Adicionar 500 μL de tampão de lavagem à coluna de adsorção. Centrifugar a 13.400 x g por 30 s e descartar o líquido residual no tubo de coleta.</li>
	<li>Coloque a coluna de adsorção de volta no tubo de coleta vazio. Centrifugar a 14.500 x g por 2 min e remover o tampão de lavagem o máximo possível, para evitar que o etanol residual no tampão de lavagem iniba as reações a jusante.</li>
	<li>Retire a coluna de adsorção e coloque-a em um tubo de centrífuga limpo. Adicionar 100 μL de tampão de eluição à parte média da membrana de adsorção.</li>
	<li>Colocar a coluna de adsorção à temperatura ambiente durante 3-5 minutos e centrifugar a 13.400 x g durante 1 minuto.</li>
	<li>Adicionar novamente a solução obtida na etapa anterior à coluna de adsorção centrífuga. Colocar a coluna de adsorção centrífuga à temperatura ambiente durante 2 minutos e centrifugar a 13.400 x g durante 1 min. NOTA: O tampão de eluição deve ser pré-aquecido em banho-maria a 70 °C durante cerca de 10 minutos. O volume de eluição não deve ser inferior a 50 μL; caso contrário, o rendimento de DNA será reduzido.</li>
	<li>Armazenar o DNA da diatomácea extraído a 2-8 °C para uso futuro. Se a solução de ADN for conservada durante muito tempo, armazene-a a -20 °C.</li>
</ol>3. Teste PCR
NOTA: Como o conteúdo de diatomáceas em amostras forenses é frequentemente baixo, os extratos de amostras de tecido dos corpos afogados também podem conter diferentes graus de tecido e órgãos (como os pulmões neste experimento) com seu próprio DNA. Portanto, a detecção direta de DNA total em extratos de DNA não reflete a situação da extração de DNA de diatomáceas. Neste experimento, primers diatomáceas específicos foram selecionados, e produtos de PCR foram usados para avaliar a extração de DNA de diatomáceas no extrato. Os produtos podem ser observados e analisados por eletroforese em gel de agarose e também podem ser analisados por curva quantitativa de fusão por PCR fluorescente em tempo real, que apresenta maior sensibilidade.
<ol><li>Adicione 2 μL do DNA extraído de amostras de água e tecidos como modelo. Escolha um dos dois métodos a seguir para inspeção.</li>
	<li>Teste PCR convencional<ol><li>Use primers22 que podem amplificar especificamente fragmentos de rDNA da diatomácea 18S. Para obter detalhes, consulte a Tabela 1.</li>
		<li>Estabelecer o sistema de reação de PCR e as condições de amplificação de acordo com as características dos primers. Para obter detalhes, consulte a Tabela 2.</li>
		<li>Executar os produtos de amplificação de PCR em gel de agarose a 2%. Observe e analise as imagens com um imageador em gel.</li>
	</ol></li>
	<li>Teste de PCR quantitativo fluorescente<ol><li>Use os primers acima que podem amplificar especificamente fragmentos de rDNA de diatomácea 18S para preparar um sistema de reação quantitativa de PCR fluorescente em tempo real. Para obter detalhes, consulte a Tabela 3.</li>
		<li>Realizar a amplificação por PCR e analisar a curva de amplificação obtida e os valores de Ct. Ao mesmo tempo, defina um programa, derreta as fitas duplas dos produtos amplificados em fitas simples gradualmente através da tecnologia de curva de fusão quantitativa fluorescente por PCR e, em seguida, analise as curvas de fusão obtidas.</li>
	</ol></li>
</ol>

Extração econômica de DNA de diatomáceas usando um kit modificado

<ol><li>Liu, C., Cong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+and+prospect+of+diagnosis+of+drowning+deaths+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Fa+Yi+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).</li>
<li>Frisoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forensic+diagnosis+of+freshwater+or+saltwater+drowning+using+the+marker+aquaporin+5%3A+An+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina+%28Kaunas%29%22%5BJournal%5D)">Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study.</a> Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458(2022).</li>
<li>Mann, D. G., Vanormelingen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inordinate+fondness%3F+The+number%2C+distributions%2C+and+origins+of+diatom+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Eukaryot+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species.</a> J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).</li>
<li>Pfister, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terrestrial+diatoms+as+tracers+in+catchment+hydrology%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Water%22%5BJournal%5D)">Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review.</a> WIREs Water. 4, 1241(2017).</li>
<li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+automated+diatom+detection+method+based+on+YOLOv5+framework+and+its+preliminary+study+for+taxonomy+recognition+in+the+forensic+diatom+test%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test.</a> Front Microbiol. 13, 963059(2022).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+length+and+width+of+diatoms+in+drowning+cases+as+the+evidence+of+diatoms+penetrating+the+alveoli-capillary+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier.</a> Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).</li>
<li>Kihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+water+injection+into+lungs+using+an+animal+model%3A+Verification+of+the+diatom+concentration+test+to+diagnose+drowning%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning.</a> Forensic Sci Int. 327, 110983(2021).</li>
<li>Shen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+false-positive+results+of+diatom+test+in+the+diagnosis+of+drowning-would+not+be+an+impediment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment.</a> Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).</li>
<li>Manoylov, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomic+identification+of+algae+%28morphological+and+molecular%29%3A+species+concepts%2C+methodologies%2C+and+their+implications+for+ecological+bioassessment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phycol%22%5BJournal%5D)">Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment.</a> J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).</li>
<li>Uchiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+molecular+approach+to+help+conclude+drowning+as+a+cause+of+death%3A+simultaneous+detection+of+eight+bacterioplankton+species+using+real-time+PCR+assays+with+TaqMan+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes.</a> Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).</li>
<li>Kakizaki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+diverse+aquatic+microbes+in+blood+and+organs+of+drowning+victims%3A+first+metagenomic+approach+using+high-throughput+454-pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing.</a> Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).</li>
<li>Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+Progress+of+High-Throughput+Sequencing+Technology+in+Forensic+Diatom+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Fa+Yi+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).</li>
<li>Xiao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+multiplex+PCR+system+for+drowning+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis.</a> Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).</li>
<li>Yarimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+absolute+quantification+method+for+ribosomal+RNA+gene+copy+numbers+per+eukaryotic+single+cell+by+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Harmful+Algae%22%5BJournal%5D)">Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR.</a> Harmful Algae. 103, 102008(2021).</li>
<li>Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diatom+shell+incorporated+PHBV%2FPCL-pullulan+co-electrospun+scaffold+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).</li>
<li>Malviya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+global+diatom+distribution+and+diversity+in+the+world%27s+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).</li>
<li>Brunner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+studies+of+silica+biomineralization%3A+towards+an+understanding+of+silica+processing+by+diatoms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).</li>
<li>Annunziata, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+method+for+intact+nuclei+isolation+from+diatoms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms.</a> Sci Rep. 11 (1), 1681(2021).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnostic+value+of+quantitative+assessment+of+diatom+test+for+drowning%3A+An+analysis+of+128+water-related+death+cases+using+microwave+digestion-vacuum+filtration-automated+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy.</a> J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).</li>
<li>Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+digestion-vacuum+filtration-automated+scanning+electron+microscopy+as+a+sensitive+method+for+forensic+diatom+test%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test.</a> Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).</li>
<li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+glass+bead-vortex+oscillation+method+for+DNA+extraction+from+diatom%5BTitle%5D)+AND+%22Fa+Yi+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).</li>
<li>Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+diatoms%3A+evaluation+of+the+V4+subregion+on+the+18S+rRNA+gene%2C+including+new+primers+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Org+Divers+Evol%22%5BJournal%5D)">Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols.</a> Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).</li>
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</ol>

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

As células das diatomáceas são protegidas por paredes celulares siliciosas duras17, e essa estrutura deve ser destruída para extrair o DNA das diatomáceas. Os kits comuns não destroem facilmente a casca siliciosa das diatomáceas; portanto, é difícil extrair com sucesso o DNA das diatomáceas21. Nosso laboratório aprimorou o kit de extração de DNA sanguíneo mais comumente usado, adicionando esferas de vidro de diferentes diâmetros e diferentes proporções de massa no processo ...

Na prática forense, determinar se um cadáver encontrado na água se afogou ou foi jogado na água após a morte é essencial para a resolução adequada do caso1. É também uma das questões difíceis que precisam ser resolvidas urgentemente na prática forense2. Diatomáceas são abundantes no ambiente natural (especialmente na água)3,4. No processo de afogamento, devido à hipóxia e resposta ao estresse, as pessoas terão movimentos respiratórios intensos e inalarão uma grande quantidade de líquido de afogamento. Assim, as diatomáceas presentes na água entram no pulmão com o líquido de afogamento, e algumas diatomáceas podem entrar na circulação sanguínea pela barreira alvéolo-capilar e se espalhar para órgãos internos com o fluxo sanguíneo 5,6. A detecção de diatomáceas em tecidos internos e órgãos como pulmão, fígado e medula óssea é uma forte evidência de afogamento antes da morte 7,8. Atualmente, o teste forense de diatomáceas baseia-se principalmente em métodos de testes morfológicos. Após uma série de pré-digestão do tecido, as estimativas qualitativas e quantitativas morfológicas das diatomáceas não digeridas são realizadas ao microscópio. Durante este período, é necessário utilizar reagentes perigosos e prejudiciais ao ambiente, como o ácido nítrico. Esse processo é demorado e exige dos pesquisadores sólidos conhecimentos taxonômicos e ampla experiência. Tudo isso traz alguns desafios para a equipe forense9. A tecnologia de teste de DNA de diatomáceas é uma nova tecnologia para testes de diatomáceas desenvolvida nos últimos anos 10,11,12. Esta tecnologia realiza a identificação de espécies de diatomáceas através da análise da composição de sequências específicas de DNA de diatomáceas13,14. A tecnologia de PCR e a tecnologia de sequenciamento são métodos técnicos comumente usados, mas sua base é a extração bem-sucedida de DNA de diatomáceas. No entanto, as diatomáceas têm uma estrutura especial diferente de outros organismos, tornando suas técnicas de extração de DNA também diferentes.
A parede celular das diatomáceas apresenta alto grau de silicificação, e seu principal componente é o dióxido de silício 15,16,17. A parede celular siliciosa é muito dura, e deve ser destruída antes de extrair o DNA. Kits comuns de extração de DNA são muitas vezes difíceis de usar diretamente para a extração de DNA de diatomáceas, porque não podem destruir a casca siliciosa das diatomáceas18. Portanto, destruir a casca siliciosa das diatomáceas é um dos principais problemas técnicos a serem resolvidos na extração do DNA das diatomáceas.
Ao mesmo tempo, como o número de diatomáceas contidas em amostras de pesquisa forense, sejam amostras de água ou órgãos e tecidos de corpos afogados, é muitas vezes limitado, é necessário enriquecer diatomáceas. A essência do enriquecimento é a separação das substâncias. Ao tentar reunir diatomáceas, minimize o conteúdo de outros componentes do material (componentes interferentes). Em trabalhos forenses, os laboratórios frequentemente usam métodos de centrifugação ou enriquecimento por filtração de membrana para separar as células das diatomáceas19. No entanto, como o equipamento de bombeamento a vácuo não é amplamente utilizado, o método de enriquecimento de membrana não é frequentemente usado em laboratórios forenses primários comuns. Assim, o método de centrifugação ainda é comumente enriquecido por diatomáceas em laboratóriosforenses 20.
A extração de DNA de diatomáceas é atualmente usada principalmente na prática forense, e há limitações significativas para sua aplicação. Atualmente, existem poucos kits de extração de DNA de diatomáceas utilizados em ciências forenses no mercado e geralmente são caros21. Este artigo fornece um método melhorado de extração de DNA de diatomáceas, tornando a extração de DNA de diatomáceas simples, conveniente e econômica. Isso aumenta a aplicação de testes subsequentes de biologia molecular de diatomáceas e pode resolver melhor problemas relacionados ao afogamento em medicina legal por meio de testes de diatomáceas. Este método quebra as paredes celulares siliciosas das diatomáceas adicionando contas de vidro e definindo um momento apropriado para o vórtice. Desta forma, a proteinase K e a solução de ligação lisam rapidamente as células e inativam várias enzimas nas células. O DNA genômico é absorvido na membrana da matriz na coluna de adsorção e finalmente eluído pelo tampão de eluição. Esse kit de extração de genes de sangue total melhorado melhora o efeito de extração de DNA de diatomáceas do kit de sangue em materiais de exame forense, reduz o custo da extração de DNA de diatomáceas na prática forense e pode ser melhor aplicado à pesquisa forense de base.

<table><tbody><tr><td>Tampão de ligação</td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>células de lise rápida</td></tr><tr><td>ChemoHS qPCR Mix</td><td>Monad</td><td>00007547-120506</td><td>qPCR Mix</td></tr><tr><td>D2000 Escada de DNA</td><td>Real-Times(Beijing) Biotechnology</td><td>RTM415</td><td>Meça a posição das bandas eletroforéticas</td></tr><tr><td>D512</td><td>Taihe Biotechnology</td><td>TW21109196</td><td>forword primer</td></tr><tr><td>D978</td><td>Taihe Biotecnologia</td><td>TW21109197</td><td>primer reverso</td></tr><tr><td>Tampão de eluição</td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>Um tampão de eluição com baixo teor de sal lava o</td></tr><tr><td>DNA Conta de vidro</td><td>Yingxu Chemical Machinery(Shanghai)&nbsp;</td><td>70181000</td><td>Esferas de vidro especiais para dispersão e moagem</td></tr><tr><td>Coluna de adsorção de importação</td><td>BioTeke</td><td>B2008006022</td><td>Coluna de adsorção com membrana de matriz de sílica</td></tr><tr><td>Tampão de remoção de inibidores</td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>Remoção de inibidores na extração de DNA</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>Precipitar ou isolar DNA</td></tr><tr><td>MIX-30S Mini Mixer</td><td>Miulab</td><td>MUC881206</td><td>ação oscilatória</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>Inativação de nucleases intracelulares e outras proteínas</td></tr><tr><td>Rotor-Gene Q 5plex HRM</td><td>Qiagen</td><td>R1116175</td><td>quantificação de fluorescência em tempo real PCR</td></tr><tr><td>Velocidade Micro-Centrífuga</td><td>Scilogex</td><td>9013001121</td><td></td></tr><tr><td>Tanon 3500R Gel Imager</td><td>Tanon</td><td>16T5553R-455</td><td>imagem latente do gel</td></tr><tr><td>Taq Mix pro</td><td>Monad</td><td>00007808-140534</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Mix Thermo Cycler</td><td>Zhuhai Hema</td><td>VRB020A</td><td>o</td></tr><tr><td>tampão</td> comum <td>BioTeke</td><td>da lavagem do PCR B010006022</td><td>remova as impurezas tais como os metabolitos da pilha</td></tr></tbody></table>

extração de dna de diatomáceas de amostras de Água e tecidos

Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

O teste de diatomáceas é um meio auxiliar essencial na prática forense para determinar se o cadáver se afogou na água e inferir o local do afogamento. O teste de diatomáceas também é um importante conteúdo de pesquisa no campo do meio ambiente e do plâncton. A tecnologia de teste de biologia molecular de diatomáceas, que se concentra no DNA de diatomáceas como objeto de pesquisa primário, é um novo método de teste de diatomáceas. A extração de DNA de diatomáceas é a base do teste molecular de diatomáceas. Atualmente, os kits comumente usados para extração de DNA de diatomáceas são caros, o que aumenta o custo de realização de pesquisas relacionadas. Nosso laboratório melhorou o kit geral de extração rápida de DNA genômico de sangue total e obteve um efeito satisfatório de extração de DNA de diatomáceas, fornecendo assim uma solução alternativa econômica e acessível de extração de DNA baseada em esferas de vidro para pesquisas relacionadas. O DNA da diatomácea extraído usando este protocolo poderia satisfazer muitas aplicações a jusante, tais como PCR e sequenciamento.

Uma vez que a solução de DNA extraída pelo método de extração de DNA atualmente utilizado contém todos os componentes de DNA de diferentes fontes na amostra, o DNA obtido por este protocolo não foi exceção. Assim, a solução de DNA não era apenas uma solução de DNA genômico de diatomáceas. Os primers capazes de amplificar especificamente fragmentos de rDNA da diatomácea 18S foram selecionados por meio de consulta à literatura22,23,24.<...

Este artigo descreve um protocolo para extração de DNA de diatomáceas usando um kit de extração de DNA comum modificado.

Extração de DNA de Diatomáceas de Amostras de Água e Tecidos

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...

Nossa pesquisa se concentra principalmente no tema do afogamento. Queríamos responder à pergunta se o corpo encontrado na água morreu por afogamento, bem como responder a outra pergunta de onde a pessoa caiu na água. Isso significa saber o local do afogamento.Em comparação com outras tecnologias, fornecemos um protocolo de extração de DNA de diatomáceas simples, conveniente e econômico que podemos usar melhor em pesquisas forenses, especialmente na prática forense básica. Nosso laboratório se concentrará ainda mais nos problemas relacionados ao afogamento com base no padrão na água, como motivo da morte, intervalo post mortem e assim por diante. Além disso, também realizamos a pesquisa através da entomologia forense e alguns fenômenos especiais nas medicinas forenses tropicais.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Nós descrevemos um método para extração de DNA genômico de alto peso molecular a partir da biomassa planctônica concentrou-se em 0,22 mM filtros Sterivex, seguido por centrifugação em gradiente de cloreto de césio densidade para purificação.

Extração de DNA de 0,22 mM Sterivex Filtros e Césio cloreto de centrifugação em gradiente de densidade

Uma metodologia para isolar alto peso molecular e DNA genômico de alta qualidade da comunidade microbiana do solo é descrito.

Extração de DNA genômico de alto peso molecular de solos e sedimentos

Este vídeo demonstra o protocolo para a extração de DNA a partir de material fixado em formalina parafina. Este é um procedimento multi-dia em que as secções de tecido são desparafinizadas com xilol, reidratados com etanol e tratados com proteinase K para purificar e isolar DNA para análise de genes específicos ou genome-wide subseqüentes.

Extração de DNA de material parafinado Embedded para análises genéticas e epigenéticas

Nós fornecemos um protocolo melhorado para a extração de DNA de alto peso molecular de tapetes microbianos hipersalinos. Células microbianas são separados da matriz mat antes da extração e purificação DNA. Isso aumenta a concentração, qualidade e tamanho do DNA. O protocolo pode ser usado para outras amostras refratário.

Extração de DNA de alto peso molecular de Esteiras Microbianas

Um protocolo para quantificar genes bacterianos de rRNA 16S e transcritos de sedimentos costeiros por meio de PCR em tempo real é fornecido. A metodologia inclui a coextração de DNA e RNA; preparação de RNA livre de DNA; e quantificação do gene 16S rRNA e transcrito via RT-q-PCR, incluindo construção de curva padrão.

DNA-RNA simultânea de extração de sedimentos costeiros e quantificação de 16S rRNA genes e transcritos por PCR em tempo real

A criosfera oferece acesso a organismos preservados que persistiram sob condições ambientais do passado. Um protocolo é apresentada para recolher e descontaminar núcleos permafrost de solos e gelo. A ausência de colónias exógenas e DNA sugerem que os microrganismos detectados representam o material, em vez de contaminação de perfuração ou de processamento.

Remoção de materiais exógenos da parte exterior dos núcleos congelados para investigar a antiga comunidades biológicas abrigava Dentro

Descrevemos um protocolo para filtração de amostras de água com um cartucho de filtro e extração de DNA ambiental (eDNA) sem ter que abrir a caixa para remover o filtro. Este protocolo é desenvolvido para metabarcoding eDNA de peixes, mas também é aplicável a eDNA de outros organismos.

O uso de um cartucho de filtro para Amostras de filtração de água e extração de DNA Ambiental

Análises de conteúdo de intestino mais comuns de macroinvertebrados são visuais. Exigindo intenso conhecimento sobre diversidade morfológica de organismos de presas, eles falta suave rapina encorpada e, devido à forte cominuição de rapina, são quase impossíveis para alguns organismos, incluindo anfípodes. Nós fornecemos abordagens genéticas detalhadas, a novela de macroinvertebrados presas identificação na dieta de anfípodes.

Protocolo do laboratório para análises genéticas de conteúdo intestino de rDNA usando de macroinvertebrados aquáticos grupo-específicos Primers

O protocolo detecta os principais genes do ciclo de metano nas zonas úmidas costeiras do sul do Texas e visualiza sua distribuição espacial para melhorar a compreensão da regulação do metano e seus impactos ambientais nesses ecossistemas dinâmicos.

Visualizando a dinâmica microbiana do ciclo de metano em zonas úmidas costeiras

Formas confiáveis e precisas de análise de DNA implantável em campo são cruciais para muitas indústrias. Este artigo oferece dois métodos para análise microbiana ambiental em campo: 1) o isolamento de DNA microbiano de amostras ambientais usando um kit de extração biológica de campo, e 2) a análise do DNA via unidade qPCR de campo.

Análise de DNA microbiano em campo usando um kit de extração biológica de campo e uma unidade qPCR de campo

Aprenda a extrair DNA de diatomáceas de amostras de água e tecidos pulmonares usando um kit modificado. Este método simples e econômico auxilia investigações forenses de afogamento.

Extração de DNA de Diatomáceas de Amostras de Água e Tecidos

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