Name: Biobanco de biópsias humanas aquosas e vítreas líquidas para análises moleculares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: Aprenda a coletar e biobancar biópsias líquidas de humor aquoso e vítreo humanos durante cirurgia intraocular. Este protocolo padronizado utiliza banco de dados web para anotação e rastreamento de amostras, facilitando análises moleculares como proteômica e metabolômica em pesquisas de doenças oculares.

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O VBM é apoiado por subsídios do NIH (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 e P30EY026877), pelo Stanford Center for Optic Disc Drusen e pela Research to Prevent Blindness, Nova York, EUA. TJ e RD são apoiados pela VitreoRetinal Surgery Foundation, EUA. A DR é apoiada pela DARE Fellowship, que é patrocinada pela Fundação Lundbeck.

O protocolo segue as diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos (CEP) da Universidade de Stanford, EUA.
ATENÇÃO: Este protocolo é um guia para cirurgiões oftalmológicos qualificados. No contexto de neoplasias intraoculares, a disseminação de tumor extraocular no contexto de humor aquoso ou biópsias líquidas vítreas não pode ser descartada. No entanto, o risco de extensão extraocular e envolvimento orbitário é extremamente baixo na biópsia transvítrea de tumor de coroide, que é feita de forma reforçada em segurança e com consideração cuidadosa do sítio deentrada6. Este protocolo não abrange e pode ser contraindicado em casos de retinoblastoma ou tumores com alto risco metastático.
1. Antes da coleta da amostra
<ol><li>Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa
	<ol><li>Obter as aprovações do CEP local antes do início do experimento e realizar a coleta de amostras de acordo.</li>
	</ol></li>
	<li>População de estudo
	<ol><li>Critérios de inclusão: Incluir todos os pacientes (0 a 99 anos) submetidos à cirurgia intraocular na instituição que disponibilizará uma quantidade adequada de humor aquoso ou líquido vítreo superior à necessária para testes diagnósticos adequados para avaliar a condição do paciente e os pacientes que desejam participar.</li>
		<li>Critérios de exclusão: Excluir pacientes que se recusam a participar e gestantes.</li>
	</ol></li>
</ol>
<ol start="3"><li>Consentimento informado
	<ol><li>Obter consentimento informado por escrito de cada paciente seguindo o protocolo aprovado pelo IRB.</li>
		<li>Arquive o consentimento assinado em um banco de dados seguro.</li>
		<li>Treinar o pessoal envolvido (cirurgiões, técnicos de laboratório, pessoal da sala de cirurgia (SO), cientistas) conforme descrito neste protocolo.</li>
		<li>Configure um banco de dados de gerenciamento de exemplo. Use o REDCap como um banco de dados de amostra baseado na Web compatível com HIPAA projetado para oferecer suporte à captura de dados para estudos de pesquisa5. Observação : este artigo descreve o uso da interface baseada na Web fornecida pelo REDCap para criar formulários, definir campos, configurar lógica de ramificação e aplicar regras de validação de dados sem a necessidade de amplo conhecimento de programação. Alternativamente, outros softwares, como aplicativos de planilha padrão, também podem ser adequados.</li>
		<li>Garantir a disponibilidade de uma caixa de refrigeração, gelo seco, seringa para coleta de amostras e criovials (consulte a Tabela de Materiais). Use criósforos com códigos de barras que são gravados permanentemente nos frascos. Isso elimina a necessidade de adicionar identificadores de paciente no frasco e a possibilidade de perder um rótulo em condições de congelamento.</li>
		<li>Avise o cirurgião sobre o caso e o técnico de laboratório que ajudará na coleta da amostra na SO pelo menos 24 h antes da cirurgia programada.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Aquisição de peças cirúrgicas no centro cirúrgico
<ol><li>Interface móvel de laboratório de centro cirúrgico (MORLI)
	<ol><li>Estabeleça um MORLI na sala de cirurgia. O MORLI inclui uma superfície plana de bancada de laboratório, um computador/tablet com um scanner de código de barras com acesso ao banco de dados REDCap e uma caixa de resfriamento com gelo seco (consulte a Tabela de Materiais). CUIDADO: O gelo seco é extremamente frio. Use sempre luvas ao manusear gelo seco e evite tocá-lo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparo da coleta de amostras na SO
	<ol><li>Faça login no computador/tablet no MORLI e abra o banco de dados REDCap.</li>
		<li>Verifique se o consentimento informado foi assinado pelo paciente e confirme isso com o cirurgião. Lembre-o de que é necessária uma amostra não diluída.</li>
		<li>Use luvas. Obter o número adequado de criósculos com código de barras (0,5 mL para humor aquoso e 1,9 mL para amostras vítreas) e colocá-los onde sejam de fácil acesso.</li>
	</ol></li>
	<li>Coleta de biópsias líquidas de humor aquoso CUIDADO: Considere amostras de tecido humano como material bioperigoso, o que requer precauções apropriadas, como jaleco e luvas para garantir a segurança do pessoal envolvido. NOTA: Os passos a seguir só devem ser realizados por um cirurgião oftalmológico treinado. Biópsias aquosas de humor líquido podem ser obtidas, por exemplo, no início da cirurgia de catarata, uma das cirurgias mais frequentes em todo o mundo. NOTA: Um campo estéril é mantido de acordo com os protocolos de cuidados padrão na sala de cirurgia. Os procedimentos pré-operatórios relacionados à anestesia do paciente seguem as etapas padrão de cuidados para cirurgias de câmara anterior e vitreorretinianas.<ol><li>Prepare e esfregue o olho para a cirurgia e coloque um espéculo de pálpebra estéril para visualização ideal do campo estéril.</li>
		<li>Use um microscópio cirúrgico para realizar uma paracentese da câmara anterior perpendicular ao limbo usando uma agulha 30-32 G conectada a uma seringa de 1 mL. Use uma ponta de algodão ou pinça pequena para estabilizar o olho durante este procedimento. NOTA: Certifique-se de que a agulha e a seringa estão bloqueadas e que não há pressão na seringa (movendo o êmbolo). Certifique-se de que a ponta da agulha permaneça sobre a íris periférica na câmara médio-anterior para evitar danos às estruturas intraoculares. No caso da cirurgia de catarata, a agulha para obter a biópsia líquida também pode entrar na câmara anterior através de uma das paracenteses que são criadas para a cirurgia de catarata.</li>
		<li>Sob visualização direta ao microscópio, aspirar manualmente aproximadamente 100 μL de humor aquoso não diluído usando uma seringa de 1 mL. Mova o êmbolo da seringa com a mão não dominante do cirurgião ou por um assistente treinado sem mover a agulha. NOTA: Obter menos de 100 μL de humor aquoso caso a câmara anterior entre em colapso.</li>
		<li>Retire cuidadosamente a agulha da câmara anterior. NOTA: Em um olho fácico, mantenha a agulha sobre a íris para evitar tocar na lente. A pressão positiva sobre o globo ocular pode aumentar o refluxo. Soltar a ponta do algodão antes que a agulha seja retirada ajuda a reduzir o refluxo.</li>
		<li>Puxe o êmbolo para trás e veja como o ar e o fluido coletado estão se movendo.</li>
		<li>Injete a seringa no criovial. O ar extra limpa o espaço morto da seringa.</li>
		<li>Use o código de barras no criovial para digitalizar a amostra para o formulário REDCap em um computador na sala de cirurgia (mais detalhes nas etapas 3.1 a 3.9).</li>
		<li>Transfira imediatamente o criovial para gelo seco na caixa de resfriamento.</li>
		<li>Continue com a cirurgia programada para o paciente (por exemplo, uma cirurgia de catarata como descrito anteriormente7 ).</li>
	</ol></li>
	<li>Coleta de biópsias de líquido vítreo NOTA: Os passos a seguir só devem ser realizados por um cirurgião vitreorretiniano treinado. Biópsias vítreas líquidas podem ser obtidas no início de uma vitrectomia8. Como o objetivo é coletar uma amostra vítrea não diluída, o cortador de vitrectomia não será preparado com líquido1. NOTA: Um campo estéril é mantido de acordo com os protocolos de cuidados padrão na sala de cirurgia. Os procedimentos pré-operatórios relacionados à anestesia do paciente seguem as etapas padrão de cuidados para cirurgias de câmara anterior e vitreorretinianas.<ol><li>Prepare e esfregue o olho para a cirurgia e coloque um espéculo de pálpebra estéril para visualização ideal do campo estéril.</li>
		<li>Criar esclerotomias com cânula de trocarte 23, 25 ou 27 G, seguindo os procedimentos padrão de tratamento. Insira a cânula de infusão e confirme visualmente o posicionamento adequado na cavidade vítrea.</li>
		<li>Na cavidade vítrea, ative o cortador vítreo sem infusão para coletar uma amostra vítrea não diluída. Aspirar manualmente 0,5 a 1,0 mL de vítreo com seringa conectada à cânula de extrusão vítrea1.</li>
		<li>Retire o cortador vítreo do olho e ligue a infusão de líquido.</li>
		<li>Aspirar o líquido restante dentro da tubulação para a seringa.</li>
		<li>Desconecte a seringa.</li>
		<li>Processar a amostra conforme descrito para uma amostra de humor aquoso na secção 2.3 (passo 2.3.5 a passo 2.3.9).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Processamento de amostras na SO e adição de amostras ao banco de dados
<ol><li>Peça ao técnico de laboratório para pegar o criovial preparado (0,5 mL para humor aquoso e 1,9 mL para amostras vítreas) e caminhar até o cirurgião sem tocar em nenhum equipamento estéril de SO.</li>
	<li>Peça ao técnico de laboratório para abrir o criovial.</li>
	<li>Descarregue a seringa diretamente no criovial.</li>
	<li>Peça ao técnico de laboratório para recapitular imediatamente o criovial.</li>
	<li>Peça ao técnico de laboratório para voltar ao MORLI e transferir imediatamente a amostra para gelo seco na caixa de resfriamento (-80 °C). Feche a tampa da caixa.</li>
	<li>Abra um novo formulário de coleta de amostras. Insira as seguintes informações no respectivo campo do formulário: cirurgião do caso, local e data da coleta, número identificador do paciente e outras informações básicas, como idade, sexo, olho direito ou esquerdo, diagnóstico, história pré-operatória (texto livre), informações sobre o procedimento (por exemplo, tipo de cirurgia), bem como informações sobre as amostras, como número de amostras coletadas, tipo de amostras (humor aquoso, vítreo) e outros detalhes, como volumes. Adicione o código de barras do tubo usando o scanner de código de barras.</li>
	<li>Clique em Enviar/Avançar.</li>
	<li>Repita as etapas 3.1 a 3.7 se forem coletadas amostras adicionais.</li>
	<li>Quando todas as amostras estiverem protegidas, clique em Salvar e enviar no formulário de coleta de amostras REDCap. Em seguida, faça logout do banco de dados e do computador/tablet.</li>
</ol>4. Transferência de crióvios para armazenamento
<ol><li>Transporte as amostras em gelo seco na caixa de resfriamento da sala de cirurgia para o laboratório e coloque-as em uma bancada de laboratório ao lado de um computador de laboratório.</li>
	<li>Faça login no REDCap no computador do laboratório usando seu ID de login e senha.</li>
	<li>Use luvas. Pegue uma das amostras coletadas e digitalize o código de barras do criovial no banco de dados (mais detalhes na seção 5). Coloque imediatamente a amostra de volta no gelo seco.</li>
	<li>Obtenha um segundo recipiente cheio de gelo seco.</li>
	<li>Obtenha um rack para os crióssils do congelador de -80 °C. Coloque no segundo recipiente sobre gelo seco. NOTA: Um rack de formato 96 será necessário para os tubos de humor aquoso de 0,5 mL e um rack de formato 48 para os tubos vítreos de 1,9 mL.</li>
	<li>Digitalize o código de barras do rack para o banco de dados (mais detalhes na seção 5).</li>
	<li>Transfira a amostra para o rack.</li>
	<li>Adicione a posição dos frascos para injetáveis no rack à base de dados (mais detalhes na secção 5).</li>
	<li>Clique em Salvar e enviar.</li>
	<li>Transporte o rack com os frascos para injetáveis em gelo seco para o frigorífico para armazenamento a -80 °C. Adicione o rack a uma posição específica na geladeira usando um sistema de coordenadas. Isso permitirá mais tarde recuperar amostras para análise a jusante facilmente.</li>
</ol>5. Formulário de armazenamento da amostra
<ol><li>Preencha um formulário de armazenamento para cada amostra coletada durante a fase de formulário de entrada. Clique no círculo vazio ou no "+" em Armazenamento de amostra para criar e abrir um novo formulário de armazenamento.</li>
	<li>Insira a data em que este formulário foi preenchido em Data de arquivamento do registro.</li>
	<li>Digitalize ou digite o código de barras do tubo em Código de barras do tubo da amostra. Coloque imediatamente a amostra de volta no gelo seco.</li>
	<li>Selecione se uma amostra é transferida para fora ou se a amostra está indo para o armazenamento interno do biorrepositório.</li>
	<li>Verifique se o consentimento informado por escrito foi obtido do paciente e selecione a caixa em Verificar conformidade do consentimento e insira seu nome em Consentimento verificado por.</li>
	<li>Selecione um local livre e adequado para o criovial no rack. Transfira o criovial nessa posição para o rack (por exemplo, posição A1). Mantenha a cremalheira no gelo seco.</li>
	<li>Na fase Localização, insira as seguintes informações: a localização do freezer em Freezer, o número da prateleira onde a amostra será armazenada em Shelf, o código de barras da caixa em Box Barcode, a posição do tubo na caixa por linha (Posição do tubo (Row)) e a coluna (Tube Position (Column)). NOTA: Opcionalmente, uma etiqueta de caixa também pode ser inserida em Etiqueta de caixa, o que pode facilitar a localização da caixa no congelador.</li>
	<li>Na seção Uso , insira as seguintes informações: o nome do projeto para o qual a amostra é usada (Nome do projeto), o volume da amostra em uma das seguintes categorias: cheio, parcial, quase vazio ou vazio (Volume da amostra) e notas de armazenamento, se aplicável, em Notas de armazenamento. Observação : a data, hora e usuário que acessou o formulário pela última vez é preenchido automaticamente para garantir uma cadeia de custódia que pode ser revisada e auditada conforme necessário.</li>
	<li>Confirme se o formulário foi preenchido clicando em Concluir em Concluir?.</li>
	<li>Clique em Salvar & Sair do formulário. Isso o levará de volta à visão geral do paciente.</li>
	<li>Para cada tubo coletado, gere outro formulário de coleta de amostra clicando no "+" em Armazenamento de amostras. Em seguida, repita as etapas 5.1 a 5.10.</li>
	<li>Clique em Salvar e Sair para preencher o formulário e fazer logout do banco de dados e do computador/tablet.</li>
	<li>Transfira o rack de amostras (em gelo seco) para o frigorífico na posição pré-especificada.</li>
</ol>6. Recuperação de peças cirúrgicas para análise a jusante
NOTA: Os espécimes são frequentemente arquivados por vários anos antes de serem analisados. Os crióvios com código de barras e o sistema de banco de dados REDCap pesquisável permitem encontrar e localizar cada amostra facilmente para análise a jusante.
<ol><li>Identifique amostras de interesse para o experimento usando a função de busca do banco de dados. Isso permitirá encontrar, por exemplo, todas as amostras de humor aquoso de pacientes entre 20 e 40 anos com retinopatia diabética.</li>
	<li>Obter a localização dos crióvios de interesse (congelador, prateleira/rack, rack de amostras, coordenadas dentro do rack). Anote-os, imprima-os ou disponibilize-os em um computador/tablet móvel para facilitar a localização das amostras no freezer.</li>
	<li>Marque os exemplos como usados no banco de dados.</li>
	<li>Clique em Salvar e Sair para preencher o formulário e fazer logout do REDCap e do computador/tablet.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Espécimes cirúrgicos de pacientes permitem a caracterização molecular direta da doença em seres humanos vivos2,3,4,14 e podem ajudar a superar as limitações de modelos de doenças celulares e animais que não recapitulam totalmente a doença humana 15,16. A análise molecular de tecidos humanos pode melhorar a seleção de novos alvos de fármacos e contribuir para uma maior taxa de sucesso de ensaios clínicos e aprovação de fármacos17. Além disso, essa abordagem oferece o potencial para a medicina personalizada, uma vez que o tecido obtido retém a impressão digital genômica, epigenômica, metabolômica, glicômica e proteômica única de cada indivíduo 2,18,19.
A alta e consistente qualidade da amostra é fundamental para todas as aplicações de análise molecular. Estudos prévios mostraram que o congelamento imediato após a recuperação da amostra e evitar ciclos repetidos de congelamento/descongelamento são críticos para altas qualidades da amostra 9,20. O armazenamento prolongado por vários anos a -70 °C não afetou significativamente a integridade do perfil proteômico9. Um protocolo padronizado é uma base importante para reduzir vieses e melhorar a comparabilidade de dados científicos, especialmente quando várias pessoas (cirurgiões, técnicos e outros) ou diferentes instituições estão envolvidas no processo de amostragem. Além da qualidade da amostra, a anotação das amostras é outro fator importante que requer padronização para permitir a correlação dos achados moleculares com os dados clínicos. Nosso protocolo baseia-se em três princípios essenciais para conseguir isso: 1) um procedimento de amostragem padronizado para biópsias de humor aquoso e líquido vítreo por um cirurgião oftálmico, 2) o processamento imediato e o congelamento instantâneo de amostras na SO pelo pessoal do laboratório e 3) uma anotação de metadados de cada amostra em um banco de dados baseado na web que permite aos pesquisadores encontrar rapidamente amostras para experimentos posteriores.
Além dos espécimesvítreos20, esse fluxo de trabalho também estabelece a coleta padronizada de biópsias líquidas aquosas do humor para análise molecular. O humor aquoso é um líquido complexo e altamente acessível na câmara anterior do olho que não reflete apenas doenças oculares do segmento anterior, mas também do segmento posterior do olho, incluindo doenças retinianas18,21. Juntamente com o fato de que um grande número de amostras de humor aquoso pode ser coletado, por exemplo, durante a cirurgia de catarata, uma das cirurgias mais frequentemente realizadas em todo o mundo, essas características a tornam uma fonte interessante para biópsias líquidas do olho humano. A anotação padronizada de metadados de cada amostra estabelecida neste fluxo de trabalho também poderia permitir a correlação dos dados do proteoma com os dados de seguimento clínico prospectivo. Isso oferece a oportunidade empolgante de identificar novos biomarcadores prognósticos que podem ajudar a estimar o prognóstico de futuros pacientes.
No entanto, a análise molecular de espécimes cirúrgicos humanos também apresenta limitações importantes. Por exemplo, manipulações experimentais complexas muitas vezes só são possíveis em modelos animais e celulares. Uma solução pode ser comparar o perfil molecular de modelos animais ou celulares com o de doenças humanas. Essa estratégia pode identificar biomarcadores proteicos sobrepostos e alvos terapêuticos que podem ser validados em animais ou modelos celulares para identificar os candidatos mais promissores que se correlacionam com a doença humana e provavelmente terão sucesso em ensaios clínicos 4,16.
Em conclusão, nosso fluxo de trabalho estabelece uma interface prática entre o centro cirúrgico e o laboratório de pesquisa que permite coleta, anotação e armazenamento padronizados e de alto rendimento de espécimes cirúrgicos de alta qualidade para análise molecular a jusante, fornecendo uma base valiosa para futuras pesquisas translacionais.

O perfil molecular de biópsias líquidas do olho humano pode capturar fluidos localmente enriquecidos contendo moléculas como DNA, RNA, proteínas, glicanos e metabólitos de tecidos oculares altamente especializados. Biópsias líquidas do vítreo na câmara posterior do olho humano mostraram-se um procedimento geralmente seguro1. Permitem a caracterização molecular de doenças oculares em seres humanos vivos e oferecem o potencial para identificar novas estratégias diagnósticas e terapêuticas2,3,4. O humor aquoso na câmara anterior do olho tem acessibilidade cirúrgica ainda maior e pode ser obtido em grande número, por exemplo, durante a cirurgia de catarata, que é uma das cirurgias mais realizadas. No entanto, nenhum protocolo padronizado para coleta, anotação e biobanco de biópsias de humor aquoso humano e líquido vítreo para análises moleculares a jusante, incluindo proteômica, metabolômica e glicômica, está disponível até o momento.
Aqui, desenvolvemos um protocolo para coleta e biobanco de biópsias líquidas de alta qualidade para análises moleculares de pacientes submetidos à cirurgia ocular. Uma Interface de Laboratório de Sala de Operação Móvel (MORLI) permite que um pesquisador congele imediatamente as amostras coletadas em criofrais com código de barras em gelo seco a -80 °C na sala de cirurgia (SO). Este procedimento garante uma qualidade de amostra alta e consistente para análise molecular a jusante. Além da excelente qualidade das amostras, a anotação precisa das amostras em um biobanco é fundamental. Usandoum banco de dados REDCap (captura eletrônica de dados de pesquisa) 5 compatível com HIPAA (Health Insurance Portability and Accountability Act) baseado na Web, nosso fluxo de trabalho permite o armazenamento de metadados detalhados para cada amostra, incluindo idade, sexo, doença, estágio da doença, tipo de amostra e características exclusivas da cirurgia. Isso permitirá uma capacidade de busca futura precisa, por exemplo, para amostras de uma doença específica ou de um grupo específico de pacientes. Além disso, a localização exata de cada amostra no freezer é arquivada usando um sistema de grade cartesiana, que permite a recuperação eficiente de amostras para experimentos a jusante. Mostramos exemplos de análises de DNA, proteínas, glicanos e metabólitos.
Nosso fluxo de trabalho representa uma conexão prática e eficaz entre a sala de cirurgia e o laboratório de pesquisa e fornece uma base valiosa para a pesquisa translacional.

<table><tbody><tr><td>Tubo tricodificado de 0,5 ml, formato 96, rosca externa</td><td>Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, EUA</td><td>68-0703-12</td><td>usado para amostras de humor aquoso</td></tr><tr><td>Seringa de grau cirúrgico de 1 mL</td><td>, o que estiver disponível no hospital</td> <td>-</td> <td>para biópsias de humor aquoso</td></tr><tr><td>Tubo tricodificado de 1,9 ml, formato 48, rosca externa</td><td>Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, EUA</td><td>65-7643</td><td>usado para amostras vítreas</td></tr><tr><td>Seringa de 3 mL</td><td>grau cirúrgico, o que estiver disponível no hospital</td> <td>-</td> <td>para biópsias vítreas</td></tr><tr><td>Agulha de calibre 30-32</td><td>grau cirúrgico, o que estiver disponível no hospital</td> <td>-</td> <td>para biópsias de humor aquoso</td></tr><tr><td>Eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massa transformada de Fourier (CE-FTMS)</td> <td>Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japão</td> <td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Sistema de vitrectomia Constellation com sistema de cânula de trocarte de 23, 25 ou 27 gauge</td><td>Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX,</td> <td>EUA-para</td> <td>biópsias vítreas</td></tr><tr><td>Caixa de resfriamento</td><td>Caixa de isopor padrão, o que estiver disponível no laboratório</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Gelo seco</td><td>O que estiver disponível no laboratório</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Kit de Scanner de Alcance Padrão Handsfree com Cabo USB Blindado Símbolo da</td><td>Zebra&nbsp;</td><td>DS9208-SR4NNU21Z</td><td>Leitor de código de barras</td></tr><tr><td>Glycosylation Humano Anticorpo Array L3&nbsp;</td><td>RayBiotech, Peachtree Corners, GA, EUA</td><td>GAH-GCM-L3-Mac</td><td></td></tr> <tr><td>mini</td><td>Apple Inc., Cupertino, CA 95014, EUA</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Software MetaboAnalyst</td><td>Pang et al., 2021, PMID: 34019663</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Rack para tubos de 0,5 ml, Formato 96</td><td>Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, EUA</td><td>66-51026</td><td>para amostras de humor aquoso</td></tr><tr><td>Rack para tubos de 1,9 ml, Formato</td> <td>48Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, EUA</td><td>65-9451</td><td>para amostras vítreas</td></tr><tr><td>Banco de dados de amostras baseado em navegador REDCap</td><td>Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

biobanco de biópsias humanas aquosas e vítreas líquidas para análises moleculares

Biobanking of Human Aqueous and Vitreous Liquid Biopsies for Molecular Analyses

Um desafio crítico na pesquisa translacional é estabelecer uma interface viável e eficiente entre o atendimento ao paciente na sala de cirurgia (SO) e o laboratório de pesquisa. Neste trabalho, desenvolvemos um protocolo para aquisição de biópsias líquidas de alta qualidade para análises moleculares a partir do humor aquoso e vítreo de pacientes submetidos à cirurgia ocular. Nesse fluxo de trabalho, um carrinho MORLI (Mobile Operating Room Lab Interface) equipado com um computador, um scanner de código de barras e instrumentos de laboratório, incluindo armazenamento a frio a bordo, é usado para obter e arquivar amostras biológicas humanas. Um banco de dados baseado na Web compatível com a privacidade de dados permite anotar cada amostra ao longo de sua vida útil, e um sistema de coordenadas cartesianas permite rastrear cada amostra com código de barras em armazenamento, permitindo a recuperação rápida e precisa de amostras para análises downstream. A caracterização molecular de amostras de tecido humano não serve apenas como uma ferramenta diagnóstica (por exemplo, para distinguir entre endoftalmite infecciosa e outra inflamação intraocular não infecciosa), mas também representa um componente importante da pesquisa translacional, permitindo a identificação de novos alvos de drogas, o desenvolvimento de novas ferramentas diagnósticas e terapêuticas personalizadas.

Os espécimes de biópsia líquida coletados podem ser submetidos a uma variedade de análises moleculares, incluindo a análise de DNA, proteínas, glicanos e metabólitos. Já foi demonstrado anteriormente que o armazenamento de longo prazo por vários anos a -70 °C não afetou significativamente a integridade do perfil proteômico9. O banco de dados REDCap permite a recuperação simples e rápida de amostras. O banco de dados pode ser pesquisado em busca de amostras de um grupo específico de pacientes, por exemplo, todos os pacientes com retinopatia diabética. O banco de dados fornecerá então os códigos de barras dos tubos e as posições em armazenamento. Até agora, coletamos e arquivamos mais de 1.000 biópsias líquidas. O banco de dados permitiu encontrar rapidamente as amostras para análises a jusante 3,10 e ajudou a realizar os experimentos seguintes.
Uma adolescente de 17 anos apresentou inflamação da retina e do nervo óptico. Ela estava imunocomprometida e havia uma preocupação com a infecção. O humor aquoso foi coletado do olho direito e enviado para análise de DNA PCR. Os resultados foram positivos para citomegalovírus e negativos para vírus herpes simples e toxoplasmose. Esses achados ilustram que biópsias líquidas de humor aquoso podem ajudar a distinguir formas infecciosas de não infecciosas de inflamação intraocular, o que é fundamental para selecionar a terapia apropriada.
A cromatografia líquida-espectrometria de massas permite uma análise semiquantitativa e imparcial do proteoma. Em biópsia líquida do vítreo de paciente vitrectomia, a técnica foi capaz de identificar 484 proteínas únicas, incluindo Complemento C3 (C3), Óptica (OPTC) e Colágeno Tipo II Alfa 1 (COL2A1) (Figura 1A).
Três biópsias vítreas líquidas foram analisadas usando um ELISA multiplex glicoproteômico (ver Tabela de Materiais)11. O ensaio detectou os perfis de glicosilação de 500 proteínas humanas, capturando uma variedade de vias biológicas, como metabolismo, resposta imune, adesão celular e organização da actina (Figura 1B).
Uma triagem metabolômica usando eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas com transformada de Fourier12 (ver Tabela de Materiais) identificou 292 metabólitos diferentes em três amostras de biópsia líquida de humor aquoso. Uma análise de vias (ver Tabela de Materiais)13 identificou uma variedade de vias metabólicas, incluindo metabolismo de aminoácidos, ciclo da ureia e síntese de carnitina (Figura 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65804/65804fig01.jpg"> Figura 1: Resultados representativos . (A) A análise proteômica do humor vítreo humano por cromatografia líquida e espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) identificou 484 proteínas únicas em uma única biópsia líquida. Os níveis de proteína são mostrados e classificados com base em contagens espectrais. Proteínas representativas são destacadas em azul. (B) Um ELISA multiplex glicoproteômico detectou níveis de glicosilação de 500 proteínas únicas em três biópsias vítreas líquidas. Uma análise de interação de proteínas STRING identificou clusters de interações proteicas (clusters com pelo menos 10 proteínas são mostrados). O caminho mais significativamente enriquecido é mostrado para cada cluster. (C) A análise metabolômica por espectrometria de massas identificou 292 metabólitos diferentes em três biópsias líquidas de humor aquoso. Cada ponto representa uma amostra. A altura da barra corresponde ao número médio de metabólitos, a barra de erro representa o desvio padrão. O painel direito mostra caminhos significativamente enriquecidos. O número de metabólitos detectados (numerador), bem como o número total de metabólitos em cada via (denominador) são mostrados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65804/65804fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo apresenta uma plataforma integrada de biorrepositório para coleta, anotação e biobanco padronizados de biópsias de humor aquoso humano e vítreo líquido de alta qualidade para análises moleculares a jusante, incluindo proteômica, metabolômica e glicômica.

Biobanco de biópsias humanas aquosas e vítreas líquidas para análises moleculares

A critical challenge in translational research is establishing a viable and efficient interface between patient care in the operating room (OR) and the ...

O perfil molecular de biópsias líquidas do olho humano pode capturar fluidos localmente enriquecidos contendo milhares de moléculas diferentes de tecidos oculares altamente especializados. Eles permitem a caracterização molecular de doenças oculares em seres humanos vivos e de maior potencial para identificar novas estratégias diagnósticas e terapêuticas. Aqui desenvolvemos protocolo para coleta padronizada e biobanco de biópsias de humor aquoso e líquido vítreo de alta qualidade durante cirurgia intraocular.Parte do protocolo é um banco de dados compatível com a privacidade de dados baseado na web para anotar cada amostra ao longo de sua vida útil e o uso de um sistema de coordenadas que permite rastrear a localização de cada amostra com código de barras em armazenamento, o que permite a recuperação eficiente de amostras para experimentos a jusante, como análise de proteínas, glicanos e metabólitos. Use um microscópio cirúrgico para realizar uma paracentese de câmara anterior perpendicular ao limbo usando uma agulha de calibre 30 a 32 conectada a uma seringa de um ml. Uma ponta de algodão pode ser usada para estabilizar o olho durante este procedimento.Certifique-se de que a ponta da agulha permaneça sobre a íris periférica na câmara média anterior para evitar danos às estruturas intraoculares. Sob visualização direta através do microscópio, aspirar manualmente aproximadamente cem microlitros de humor aquoso não diluído usando uma seringa de um ml. A agulha é então cuidadosamente removida da câmara anterior.Em um olho fácico, mantenha a agulha sobre a íris para evitar tocar na lente. A pressão positiva sobre o globo ocular pode aumentar o refluxo. Soltar a ponta do algodão antes que a agulha seja retirada ajuda a reduzir o refluxo.Puxe o encanador para trás e veja como o ar e o fluido coletado estão se movendo. Injete a seringa no frasco para injetáveis de crio. O ar extra limpa o espaço morto da seringa.Aqui você pode ver o código de barras que está gravado permanentemente no frasco. O código de barras é então usado para digitalizar a amostra para o formulário REDCap em um computador na sala de cirurgia. O frasco para injetáveis de crio será imediatamente transferido para gelo seco na caixa de arrefecimento.Biópsias vítreas líquidas podem ser obtidas no início de uma vitrectomia por um cirurgião vitreorretiniano treinado. Observe que o cortador de vitrectomia não será preparado com líquido. Na cavidade vítrea, ative o cortador vítreo sem infusão para coletar uma amostra vítrea não diluída.Aspirar manualmente 0,5 a um ml de vítreo com uma seringa conectada à cânula de extrusão vítrea. A amostra é então processada como demonstramos para um espécime umeral preciso. Este vídeo é um passo a passo de um formulário de coleta de amostra preenchido em REDCap no modo de exibição de pesquisa.Uma vez que um paciente preenche o consentimento eletrônico com a assistência de um coordenador de pesquisa clínica, este formulário é preenchido. Ele pode ser acessado no mesmo dispositivo em que o paciente foi consentido eletronicamente, ou pode ser acessado usando qualquer outro dispositivo aprovado. Uma cópia do consentimento eletrônico que foi preenchido pode ser acessada aqui para que as assinaturas sejam verificadas.O coordenador então preenche as outras seções relevantes, incluindo o tipo de consentimento e, nesta seção azul, detalhes sobre o caso em si, como o cirurgião do caso, onde foi realizado, a data da coleta e outras informações relevantes. Nesta próxima seção verde do paciente, temos os dados demográficos do paciente, incluindo uma amostra de NMR, o nome e sobrenome do paciente, seu sexo, data de nascimento com um autocálculo da idade, a lateralidade do olho afetado e categoria diagnóstica. Esse formulário apresenta lógica de ramificação, portanto, quando uma caixa de seleção é marcada, ela afeta a aparência das caixas de seleção abaixo dela.Neste caso, trata-se de um caso de segmento anterior e retina. Então, primeiro, a caixa de retina de diagnóstico é preenchida. O coordenador selecionou que se trata de um buraco macular e a caixa de diagnóstico do segmento anterior também foi preenchida.Neste caso, parece que é uma catarata. Um formulário de histórico pré-operatório também é preenchido como uma caixa de texto livre. Aqui, as informações do EMR podem ser copiadas e coladas ou novas informações sobre o histórico pré-operatório podem ser inseridas para referência futura.Em seguida, nesta seção vermelha, temos a caixa de procedimento. Neste caso, parece que uma vitrectomia pars plana foi selecionada juntamente com a lente intraocular de um facico. Qualquer coisa não preenchida aqui em qualquer uma dessas caixas de seleção pode ser inserida em texto livre usando essas outras caixas que são salpicadas em todo o formulário.Detalhes relevantes sobre o caso em si também são concluídos. Finalmente, nesta seção de ouro, temos uma área de coleta. O nome do coordenador que recolhe o espécime, juntamente com o número de tubos de amostra que estão a ser utilizados, foram introduzidos aqui.Novamente, usando a lógica de ramificação, podemos coletar quantas amostras forem necessárias para o caso. Neste caso, foram coletadas duas amostras, semelhante a um núcleo vítreo e uma amostra de fluido de câmara anterior. Os códigos de barras de cada uma dessas amostras foram escaneados aqui e registrados no formulário.Finalmente, há uma seção de notas de coleta de amostras onde o coordenador pode digitar detalhes relevantes, incluindo volumes e qualidade do fluido extraído. Nesta seção final de upload de arquivos, quaisquer fotos, vídeos ou documentação relevantes podem ser carregados no próprio formulário e vinculados. Finalmente, uma vez que tudo esteja concluído, o coordenador pode clicar em enviar em seguida e o formulário é salvo com todas as informações relevantes armazenadas, conectando a amostra com sucesso com o paciente.Transporte as amostras em gelo seco da sala de cirurgia para o laboratório. Faça login no REDCap no computador do laboratório. Pegue uma das amostras coletadas e digitalize o código de barras no banco de dados.Agora, um segundo recipiente com gelo seco e um rack para os frascos de crio é necessário. O código de barras do rack também será digitalizado para o banco de dados e as amostras serão transferidas para o rack. A posição dos frascos no rack é adicionada ao banco de dados e a entrada é salva e fechada.O rack com os frascos para injetáveis é então transportado em gelo seco para o frigorífico para armazenamento a menos 80 graus Celsius. O rack é adicionado a uma posição específica na geladeira usando um sistema de coordenadas. Isso permitirá mais tarde recuperar facilmente amostras para análise a jusante.Este vídeo é um passo a passo do formulário de armazenamento de exemplo. Aqui, vemos o registro de visão geral do paciente. Esse círculo verde indica que o formulário de entrada da coleta de amostra já foi preenchido.Esse círculo vazio indica que um formulário de armazenamento deve ser preenchido. Um formulário de armazenamento deve ser preenchido para cada amostra coletada durante a fase de formulário de entrada. Clicar neste círculo nos levará ao primeiro formulário de armazenamento de amostra.Aqui podemos ver que uma IDP foi gerada e a MRN foi mascarada. Essas informações ainda estão acessíveis e podem ser acessadas usando a página anterior, clicando no círculo verde no formulário de entrada. Aqui, um instantâneo de amostra será gerado assim que esta página for concluída.Em notas de coleta, vemos que as informações foram importadas automaticamente do formulário de entrada. Em seguida, em data de arquivamento do registro, podemos inserir a data em que este formulário está sendo preenchido. Sob o código de barras do tubo da amostra, digitalizamos ou reinserimos o código de barras do tubo que está sendo arquivado.Em tempo real, este instantâneo do espécime está sendo atualizado. Nesta seção, podemos selecionar se uma amostra está sendo transferida para fora. Aqui inserimos essa informação relevante.Para fins deste exemplo, vamos indicar que esta é uma amostra que vai para o armazenamento interno do biorrepositório. Sob verificação, um coordenador de pesquisa pode voltar e verificar se o consentimento eletrônico ou em papel foi concluído com sucesso e dentro dos protocolos. O nome da pessoa que está concluindo essa verificação é inserido e, usando essa lista suspensa, o verificador combina o código de barras aqui com o que acabou de ser digitado.Isso garante precisão. Em seguida, nesta fase de localização, vemos o freezer onde a amostra será armazenada. Podemos indicar a prateleira onde a amostra será armazenada, bem como registrar o código de barras da caixa, que pode ser digitalizado ou digitado.Uma etiqueta de caixa também pode ser digitada aqui e a etiqueta pode ser colocada na caixa para correspondência adicional. Em seguida, as duas posições por linha e coluna são gravadas. Isso garante que cada código de barras seja associado a uma posição dentro da caixa que é gravada para fácil recuperação no futuro.Nesta seção de uso, podemos inserir o nome do nosso projeto ou selecionar um em uma caixa suspensa. Registre o volume do espécime. E aqui, a data e hora, bem como o usuário que acessou este formulário pela última vez é preenchido automaticamente para garantir uma cadeia de custódia que pode ser revisada e auditada conforme necessário.A pessoa que arquiva o formulário insere seu nome aqui e indica quaisquer anotações relevantes aqui que possam ser consistentes com o que deseja registrar neste formulário de entrada para armazenamento. Finalmente, há outra seção para carregar um arquivo e, uma vez que tudo isso seja preenchido, este formulário pode ser preenchido e enviado clicando em salvar e sair, o que nos leva de volta à visão geral do paciente. Para cada formulário adicional que deve ser preenchido, para cada tubo que deve ser armazenado, podemos clicar neste botão de adição para voltar ao formulário de armazenamento de amostra e gerar outro registro.Esta visão geral fornece um acesso ao formulário de entrada que foi gerado, bem como quaisquer formulários de armazenamento subsequentes para esse registro de paciente. Dessa forma, ele é facilmente recuperável e acessível por qualquer pessoa com acesso de back-end ou outras permissões dadas dentro de um REDCap. As biópsias líquidas coletadas podem ser submetidas a uma variedade de análises moleculares, incluindo proteômica, glicômica e metabolômica.O banco de dados REDCap permite a recuperação simples e rápida de amostras, por exemplo, por meio da busca de amostras de pacientes com uma doença específica. Trata-se do caso de uma paciente de 17 anos, imunocomprometida, que apresentou inflamação retiniana e do nervo óptico. Com a preocupação de uma infecção, uma biópsia líquida de humor aquoso foi realizada e enviada para análise de DNA PCR.Os resultados foram positivos para CMV e negativos para HSV e toxoplasmose e foram críticos para distinguir formas infecciosas de não infecciosas de inflamação intraocular e selecionar a terapia apropriada. A espectrometria de massas por cromatografia líquida permite uma análise semiquantitativa e imparcial do proteoma. Em uma biópsia líquida do vítreo de um paciente submetido à vitrectomia, a técnica foi capaz de identificar 484 proteínas únicas, incluindo complemento C3, óptica e colágeno tipo 2.Três biópsias vítreas líquidas foram analisadas usando um analisador multiplex glicoproteômico. O ensaio detectou os perfis de glicosilação de 500 proteínas humanas, capturando uma variedade de vias biológicas, como metabolismo, resposta imune, adesão celular e organização da actina. Nós também analisamos o perfil metabolômico de biópsias líquidas de humor aquoso usando uma forma especial de espectrometria de massa.Identificamos 292 metabólitos diferentes em três biópsias líquidas humanas aquosas. Uma análise de vias identificou uma variedade de vias metabólicas, incluindo metabolismo de aminoácidos, ciclo da úria e síntese de carnitina. Em conclusão, nosso fluxo de trabalho estabeleceu uma interface prática entre o centro cirúrgico e o laboratório de pesquisa que permite coleta, anotação e armazenamento padronizados e de alto rendimento de peças cirúrgicas de alta qualidade.As amostras podem ser usadas para análise molecular a jusante, incluindo estudos proteômicos, glicômicos e metabolômicos. Nosso protocolo fornece uma base valiosa para futuras pesquisas translacionais.

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