Name: Reprogramação do Adenocarcinoma Ductal Pancreático para Pluripotência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Aprenda a reprogramar células de adenocarcinoma ductal pancreático em células-tronco pluripotentes induzidas usando lentivírus. Este protocolo estabelece linhas iPSC estáveis para estudar a progressão do câncer pancreático.

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A.S e J.K gostariam de agradecer à Cancer Research UK e à OHSU pelo financiamento (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A A.S é apoiada por um prêmio de desenvolvimento de carreira da MRC (MR/N024028/1). A.A é financiado por uma bolsa de doutorado (Bolsa ref. 1078107040) da Cidade Rei Abdulaziz para Ciência e Tecnologia. J.K é financiado pelo MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) e Knight CEDAR grant (68182-933-000, 68182-939-000). Agradecemos ao Prof. Keisuke Kaji por gentilmente fornecer o vetor de reprogramação pSIN4-EF1a-O2S e pSIN4-CMV-K2M. Para fins de acesso aberto, o autor aplicou uma licença Creative Commons Attribution (CC BY) a qualquer versão do Manuscrito Aceito pelo Autor decorrente desta submissão.

Reprogramação de PDAC e células pancreáticas em células-tronco pluripotentes induzidas

Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.

Para facilitar o uso da reprogramação iPSC para estudar a progressão do câncer, um protocolo robusto foi estabelecido para reprogramação de células de câncer de pâncreas. A reprogramação de células cancerosas em pluripotência tem se mostrado muito desafiadora até o momento, pois poucos estudos conseguiram gerar iPSCs a partir de células cancerosas32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46 . A maioria desses estudos utilizou linhagens de células cancerosas imortalizadas para gerar linhagens de iPSC, e não células primárias derivadas do paciente 36,37,38,40,42,43,44,46. Por exemplo, a reprogramação de quatro linhagens celulares diferentes de câncer de fígado foi tentada usando a introdução retroviral de fatores OSKM, mas apenas uma única linhagem celular foi reprogramada com sucesso41. No entanto, a linhagem iPSC de câncer de fígado gerada mostrou uma perda de haste após algumas passagens, destacando a alta resistência das células cancerosas à reprogramação de OSKM41. Anteriormente, tentativas foram feitas para reprogramar células PDAC usando a entrega lentiviral de OSKM individualmente; no entanto, apenas uma única linha iPSC foi gerada, dependente da expressão exógena de OSKM e, portanto, não totalmente reprogramada37. Outro estudo usou vetores epissomais para entregar fatores OSKM sem integração genômica, mas só conseguiu gerar um único clone iPSC do PDAC39. O sucesso limitado na reprogramação de células cancerosas se soma aos muitos desafios que dificultam o uso da tecnologia iPSC na pesquisa do câncer.
Aqui, a geração de iPSCs a partir de amostras primárias de PDAC derivadas de dois pacientes diferentes e uma linhagem celular PDAC estabelecida (BxPc3) é explicada. Além disso, iPSCs também foram geradas a partir de H6c7, uma linhagem celular epitelial ductal pancreática. Até onde sabemos, este é o primeiro relato de linhagens iPSC estáveis derivadas com sucesso de BxPc3 e H6c7. Seguindo esse protocolo, iPSCs também foram geradas com sucesso a partir de fibroblastos humanos primários derivados de indivíduos saudáveis, expandindo a aplicabilidade do método para além da pesquisa do câncer.
Um dos elementos-chave por trás do sucesso do protocolo é o uso de vetores lentivirais bicistrônicos para co-expressar fatores OS e KM. Esses vetores contêm o sítio de entrada interno do ribossomo 2 (IRES2) para expressar OCT4 e SOX2 em um vetor e KLF4 e cMYC no outro. Múltiplos estudos utilizando vetores monocistrônicos onde cada fator de reprogramação foi entregue individualmente mostraram que a captação de cada vetor é diferente, afetando a estequiometria OSKM e a eficiência da reprogramação47. O uso de vetores bicistrônicos pode ajudar a mitigar esse problema. Além disso, o uso do IRES em vetores lentivirais mostrou um aumento significativo na eficiência da reprogramação48. Neste sistema lentivírus, a expressão do SO é conduzida pelo promotor EF1a, enquanto a expressão KM está sob o controle de um promotor CMV. Sabe-se que o promotor do CMV pode ser submetido a silenciamento altamente eficiente por metilação do DNA e desacetilação de histonas, ao contrário do EF1a49,50. Portanto, o silenciamento precoce da GC antes da EO durante a reprogramação pode ser um fator chave para o sucesso do protocolo. Isso é consistente com estudos anteriores mostrando a importância da dinâmica de expressão de OSKM durante a reprogramação 51,52,53,54,55. Assim, o vetor bicistrônico também é mais vantajoso que o vetor policistrônico, onde todos os fatores OSKM são expressos a partir de um único promotor56. Outros fatores que contribuem para o sucesso do protocolo incluem as doses de infecção por lentivírus e o número de células infectadas utilizadas para reprogramação, que foram personalizadas para cada tipo celular.
Em resumo, um método otimizado para reprogramação de células PDAC primárias juntamente com outras linhagens celulares e células normais é apresentado. Este método ajudará a expandir o uso da reprogramação iPSC para modelar a progressão do câncer e, neste caso, descobrir biomarcadores PDAC precoces.

O adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é uma das neoplasias malignas mais fatais, e o diagnóstico precoce permanece desafiador devido à natureza assintomática da doença. A maioria dos pacientes com ADP é diagnosticada na fase metastática avançada, quando opções de tratamento muito limitadas estão disponíveis 1,2. Isso se deve principalmente à falta de biomarcadores confiáveis para os estágios iniciais, como aqueles que poderiam ser convenientemente detectados como proteínas liberadas na corrente sanguínea.
O ADP pode disseminar-se muito precocemente durante sua progressão, e um melhor prognóstico tem sido associado à detecção precoce do câncer quando o ADP está localizado no pâncreas3. Entretanto, menos de um décimo dos pacientes com ADP são diagnosticados com prognóstico favorável, permitindo a ressecção cirúrgica. No entanto, aqueles poucos com tumores ressecáveis também são propensos à recorrência tumoral em 12meses4.
Nas últimas cinco décadas, melhorias notáveis foram feitas nas técnicas cirúrgicas, no atendimento ao paciente e nas modalidades de tratamento 5,6. No entanto, a taxa de sobrevida em 5 anos em pacientes com ADP ressecados cirurgicamente mal subiu para 17%. No entanto, este ainda é melhor do que em pacientes não ressecados, que permaneceu praticamente inalterado (0,9%)4,7. A quimioterapia é a única outra alternativa de tratamento para o ADP. No entanto, essa opção é muito limitada, pois a grande maioria dos pacientes com ADP apresenta forte resistência a medicamentos quimioterápicos como a Gencitabina 7,8. Outros fármacos, como o erlotinibe, estão disponíveis apenas para um pequeno grupo de pacientes com ADP com mutações específicas, a maioria dos quais apresenta resistência ao erlotinibe9. Os efeitos adversos associados à quimioterapia na maioria dos pacientes com ADP são outra desvantagem desse tratamento10. Recentemente, estratégias promissoras têm mostrado que inibidores de checkpoints imunes (ICIs) e inibidores de pequenas moléculas quinases (SMKIs) podem ser eficazes no tratamento de ADP, mas respostas duráveis a essas terapias-alvo permanecem limitadas a uma minoria de pacientes11,12. Em geral, a descoberta de biomarcadores precoces específicos para o PDAC pode pavimentar novos caminhos para o diagnóstico e tratamento precoces.
O ADP desenvolve-se a partir de lesões precursoras de neoplasias intraepiteliais pancreáticas (PanIN) que resultam de proliferações epiteliais não invasivas dos ductos pancreáticos13,14. Enquanto a formação de PanIN é iniciada por mutações oncogênicas como KRAS, alterações genéticas e epigenéticas adicionais são necessárias para a progressão para PDAC. Projeta-se que a progressão da NIPan através dos diferentes estágios para ADP invasiva leva cerca de 10 anos 13,15,16,17. Esse período oferece uma grande oportunidade de se beneficiar do diagnóstico precoce de ADP. Portanto, extensas pesquisas têm sido realizadas para estabelecer modelos animais de xenoenxerto tumoral e culturas organoides para estudar a progressão do ADP18,19,20,21. Esses modelos têm sido muito úteis para estudar os estágios invasivos do ADP, embora não a transição das fases iniciais da PanIN. Portanto, é importante desenvolver modelos experimentais que possam recapitular a progressão precoce dos estágios de PanIN para permitir a descoberta de biomarcadores de detecção precoce.
A reprogramação de células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando os quatro fatores de transcrição OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC (OSKM) ilustrou a extensão da plasticidade celular22. A plasticidade das células cancerosas tem sido bem documentada, e a reprogramação de células cancerosas humanas em iPSCs tem sido usada com sucesso para redefinir as células ao seu estado celular original, removendo muitos dos insultos epigenéticos que se acumularam durante a progressão do câncer 23,24,25,26,27,28,29. A possibilidade de utilizar essa estratégia de reprogramação para manipular a identidade das células cancerígenas tem, portanto, se apresentado como grande promessa no tratamento docâncer30,31. De fato, mostramos anteriormente que a diferenciação de iPSCs derivadas de PDACs pode recapitular a progressão da PDAC através dos estágios iniciais da PanIN32. Por meio da identificação de genes e vias específicas para os estágios iniciais a intermediários da ADP, foram identificados biomarcadores candidatos que podem ser utilizados clinicamente para o diagnóstico precoce da ADP32,33. No entanto, os biomarcadores descobertos usando uma única linhagem iPSC mostraram cobertura limitada na maioria dos pacientes com ADP32. Os desafios de gerar linhas iPSC de outros pacientes com ADP interromperam a capacidade de descobrir biomarcadores mais confiáveis. Isso se deve a muitos fatores técnicos, incluindo a heterogeneidade da liberação de OSKM, já que apenas uma pequena porção de células PDAC primárias humanas continha todos os quatro fatores e respondia com sucesso à reprogramação. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para reprogramação de células PDAC primárias usando uma entrega lentiviral dupla mais eficiente e consistente de OSKM.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol (50 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti- humano TRA-1-60-R</td><td>BioLegend</td><td>330613</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de Pituitária Bovina (BPE)</td><td>Thermo Fisher</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BxPc3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1687</td><td></td></tr><tr><td>Toxina da Cólera de Vibrio cholerae</td><td>Merck&nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno, solução Tipo I de cauda de rato</td><td>Merck&nbsp;</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Concluído Definido K-SFM</td><td>Thermo Fisher</td><td>&nbsp; 10744-019</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar TC-Treated Placas de Poço Múltiplo</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS3516</tr><tr><td>Filtros de seringa Corning</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS431231</tr><tr><td>Placas de cultura tratadas com cultura de tecidos Corning</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS430599</tr><tr><td>Dia Impex&nbsp; Virkon Desinfetante Virucida Tablets</td><td>Thermo Fisher</td><td>12328667</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Fosfato Tampolado Salino (PBS)</td><td>Merck&nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal de Bezerro (FCS)&nbsp;</td><td>Reagente de Transfecção HD Fugene</td><td>10270-106</td><td></td>da Thermo</tr><tr><td>Fisher&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>&nbsp; E2312</td><td></td></tr><tr><td>Solução de gelatina, Tipo B, 2% em H2O</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Mídia Essencial Mínima (GMEM)</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>Proteína Recombinante EGF Humana</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic Humana (FGF-2/bFGF) (154 aa) Proteína Recombinante, PeproTech</td><td>Thermo Fisher</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Linha de Células Epiteliais de Duto Pancreático Humano (H6c7)</td><td>Kerafast</td><td>ECA001-FP</td><td></td></tr><tr><td>iMEF alimentador de células&nbsp;</td><td>iXcells Biotechnologies</td><td>10MU-001-1V</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Queratinócitos Free Media (KSFM)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17005-042</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM&nbsp;</td><td>Substituição do soro Thermo Fisher</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HP 0.45 &mu; Unidade de Filtro de Seringa M (Estéril)</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>SLHP033RS</tr><tr><td>Opti-MEM Medium de Soro Reduzido&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>pMDG&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>187440</td><td></td></tr><tr><td>Polibreno (brometo de hexadimetrina)&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-CMV-K2M&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21164</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF2-O2S&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21162</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>AddGene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pWPT-GFP&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>12255</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Médio (modificação ATCC)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1049101</td><td></td></tr><tr><td>Sodym Pyruvate</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Seringas Estéreis para Uso Único (60 mL)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15899152</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express (1x), vermelho de fenol</td><td>Thermo Fisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Dicloridrato)</td> <td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr></tbody></table>

reprogramação do adenocarcinoma ductal pancreático para pluripotência

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

A geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando fatores de transcrição tem sido obtida a partir de quase qualquer tipo celular diferenciado e tem se mostrado altamente valiosa para pesquisas e aplicações clínicas. Curiosamente, a reprogramação iPSC de células cancerosas, como o adenocarcinoma ductal pancreático (ADP), demonstrou reverter o fenótipo invasivo de ADP e anular o epigenoma do câncer. A diferenciação de iPSCs derivadas do PDAC pode recapitular a progressão do ADP a partir de seu precursor precoce da neoplasia intraepitelial pancreática (PanIN), revelando as mudanças moleculares e celulares que ocorrem precocemente durante a progressão do ADP. Portanto, iPSCs derivadas do PDAC podem ser usadas para modelar os estágios iniciais do PDAC para a descoberta de marcadores diagnósticos de detecção precoce. Isso é particularmente importante para pacientes com ADP, que geralmente são diagnosticados nos estágios metastáticos tardios devido à falta de biomarcadores confiáveis para os estágios iniciais da PanIN. No entanto, a reprogramação de linhagens de células cancerosas, incluindo PDAC, em pluripotência permanece desafiadora, trabalhosa e altamente variável entre diferentes linhagens. Aqui, descrevemos um protocolo mais consistente para gerar iPSCs a partir de várias linhagens celulares PDAC humanas usando vetores lentivirais bicistrônicos. As linhagens iPSC resultantes são estáveis, não mostrando dependência da expressão exógena de fatores reprogramadores ou drogas induzíveis. Em geral, esse protocolo facilita a geração de uma ampla gama de iPSCs derivadas do PDAC, o que é essencial para a descoberta precoce de biomarcadores mais específicos e representativos dos casos de ADP.

Imagens representativas mostrando a morfologia de colônias iPSC derivadas de células PDAC, BXPc3, H6C7 e hFib são mostradas na Figura 1. As colônias PDAC-iPSC começaram a se formar no dia 25 de reprogramação. Colônias robustas de iPSC com morfologia ESC-like mais estabelecida foram identificadas no 40º dia de reprogramação (Figura 1). Da mesma forma, a formação de BxPc3-iPSCs começou no dia 23 e se tornou mais estabelecida no dia 35. A formação de H6C7-iPSC foi semelhante à de PDAC-iPSCs e começou a se estabelecer no 45º dia. As colônias hFib-iPSC começaram a se formar no dia 15 de reprogramação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65811/65811fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Figura 1: Imagens representativas das colônias iPSC. As imagens mostram morfologia estabelecida semelhante à hESC derivada de (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 e (D) hFib. Os dias de reprogramação são indicados acima de cada imagem. Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65811/65811fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
Linhagens clonais de iPSC foram estabelecidas a partir de cada reprogramação de células PDAC, BxPc3, H6C7 e hFib. Todas as linhagens iPSC estabelecidas foram positivas para TRA-1-60, um marcador indiferenciado da superfície celular da hESC, confirmando sua reprogramação para pluripotência (Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65811/65811fig2.jpg"> Figura 2: Imagens representativas das linhas clonais de iPSC. As imagens são derivadas de (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 e (D) hFib mostrando morfologia ESC-like (painéis superiores) e coloração positiva para TRA-1-60 (painel inferior). Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65811/65811fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O presente protocolo descreve a reprogramação do Adenocarcinoma Ductal Pancreático (ADP) e de células epiteliais ductais pancreáticas normais em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Fornecemos um procedimento otimizado e detalhado, passo a passo, desde a preparação do lentivírus até o estabelecimento de linhas iPSC estáveis.

Reprogramação do Adenocarcinoma Ductal Pancreático para Pluripotência

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...

reprogramming-pancreatic-ductal-adenocarcinoma-to-pluripotency

Research

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