Name: Lesão por congelamento no músculo masseter de camundongo para estabelecer um modelo de fibrose muscular orofacial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Aprenda a criar um modelo de lesão por congelamento no músculo masseter de camundongo para estudar regeneração e fibrose muscular orofacial. Este método permite comparar mecanismos distintos entre músculos faciais e de membros.

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Este estudo foi apoiado por doações do Comitê Provincial de Saúde e Bem-Estar de Sichuan (Número da concessão: 21PJ063) e da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Número da concessão: 82001031).

Todos os procedimentos em animais neste estudo foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética da Escola de Estomatologia da China Ocidental, Universidade de Sichuan (WCHSIRB-D-2020-114). Camundongos C57BL / 6 machos (5 semanas de idade) foram criados em uma instalação com umidade controlada (53 ± 2%) e temperatura controlada (23 ± 2 ° C) e estavam em um ciclo claro/escuro de 12 horas. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.
1. Lesão por congelamento
<ol><li>Anestesia: Sedar os camundongos com bolas de algodão embebidas em isoflurano e injetar tiletamina-zolazepam por via intraperitoneal na dose de 50 mg / kg. A analgesia pré e pós-operatória foi fornecida por injeção intraperitoneal de meloxicam na dose de 1 mg/kg. Proteja os olhos com pomada veterinária. Uma almofada de aquecimento mantida a 38 °C foi colocada sob o campo cirúrgico durante todo o procedimento para fornecer suporte térmico ao animal. Fixe os mouses com fita adesiva depois de colocá-los de lado em uma mesa cirúrgica (Figura 1). Avalie a suficiência da anestesia pela perda do reflexo palpebral, reflexo de endireitamento e reflexo de retirada do pedal. NOTA: Ao aplicar anestesia com isofluorano, segure o mouse em uma mão e a bola de algodão embebida em isofluorano na outra. Certifique-se de manter a bola de algodão afastada do animal para evitar desconforto e irritação na pele.</li>
	<li>Depilação pré-operatória: Use um barbeador elétrico para raspar os pelos da panturrilha e do rosto do camundongo e aplique a pasta depilatória com um cotonete na pele, cobrindo o músculo masseter e o músculo tibial anterior. Após 1-2 min, lave a pasta com um lenço cirúrgico à base de etanol (Figura 2A e Figura 2G). Os sítios cirúrgicos foram desinfetados por três rodadas de esfoliação à base de iodo e etanol a 75%. NOTA: O barbeador elétrico sozinho não foi suficiente para a depilação, especialmente na área do masseter. Ao aplicar a pasta depilatória, é importante não usar pasta excessiva. Limpe a pele suavemente ao lavar a pasta para evitar queimaduras na pele.</li>
	<li>Exposição do campo cirúrgico: Cubra com campos cirúrgicos antes do procedimento cirúrgico. Para o músculo SAM, palpe primeiro ao longo da borda inferior da mandíbula. A 5 mm da borda, faça uma incisão de 7 mm ao longo da linha que conecta a comissura oral ao tragus (a linha tracejada indica a localização da incisão na Figura 2B).</li>
	<li>Para o músculo TA, palpe primeiro ao longo da panturrilha para localizar a borda anterior do osso da tíbia. Corte 2 mm posterior à borda através da pele com bisturi, começando no joelho e terminando no tornozelo (a linha tracejada indica a localização da incisão na Figura 2H). Para cada camundongo, se o MAS e o músculo TA do lado esquerdo estiverem lesionados, use o outro músculo do lado contralateral como controle. NOTA: Este corte é muito superficial para garantir que os músculos não sejam lesionados durante a incisão. A incisão na face não deve estar muito próxima do tragus. Caso contrário, a glândula parótida ficará exposta, levando a sangramento excessivo durante o processo de congelamento seguinte.</li>
	<li>Congelamento com gelo seco: Segure um pedaço de gelo seco com pinça pré-resfriada ao longo dos eixos longos dos músculos MAS e TA (Figura 2C e Figura 2I, respectivamente). Coloque o gelo seco diretamente na superfície do músculo por 5 s. Confirme se o músculo parece rígido e branco pálido imediatamente após a remoção do gelo seco (Figura 2D e Figura 2J), mas que retorna à sua cor e textura normais dentro de 22-25 s, semelhante ao músculo adjacente não lesionado (Figura 2E e Figura 2K). NOTA: A pinça que segura o gelo seco deve ser pré-resfriada para evitar a sublimação rápida do gelo seco. Um cronômetro é obrigatório para conduzir a lesão por congelamento de 5 s e contar o tempo de recuperação de 22-25 s do músculo. Qualquer músculo com tempo de recuperação inferior a 22 s ou superior a 25 s deve ser abandonado. Esta etapa requer prática.</li>
	<li>Fechamento da ferida: Após a recuperação total do músculo, feche a ferida cutânea com pelo menos três suturas 7-0 (Figura 2F e Figura 2L).</li>
	<li>Ressuscitação: Quando a sutura estiver completa, coloque os camundongos na gaiola com suporte térmico e monitore-os continuamente até que todos os reflexos de endireitamento tenham sido recuperados.</li>
</ol>2. Coleção muscular
<ol><li>Eutanasiar os camundongos com uma overdose de isoflurano, seguida de luxação cervical. Colha os músculos MAS e TA em ambos os lados para análise histológica.</li>
	<li>Dissecção do músculo SAM: Corte a pele do rosto do camundongo e remova a glândula parótida para expor a parte posterior do músculo SAM. Disseque a SAM desde sua inserção anterior até sua inserção posterior na mandíbula. A área pontilhada branca indica a parte exposta da SAM (Figura 3A). NOTA: O músculo MAS é composto por compartimentos profundos e superficiais, ambos intimamente ligados à superfície da mandíbula. Certifique-se de pressionar a tesoura na mandíbula durante a dissecção para garantir o isolamento completo do SAM. Tenha o cuidado de distinguir o zigomático-mandibular da SAM por seus limites entre o zigomático e a mandíbula.</li>
	<li>Dissecção do músculo TA: Corte a pele do tornozelo ao joelho e remova a fáscia para expor o músculo TA. Use a ponta da pinça de microdissecção para isolar o tendão do TA e deslize-o até o joelho para quebrar as fibras que se prendem à tíbia. Em seguida, corte o tendão do tornozelo (Figura 3B). NOTA: Para o músculo TA, existem alguns tendões musculares ao redor do tornozelo do mouse; seria preciso prática para discernir o tendão de TA, que é o maior e mais próximo da tíbia.</li>
	<li>Pré-resfriamento de isopentano: Prepare dois barris de isolamento; Encha o barril pequeno com isopentano e o barril grande com nitrogênio líquido. Coloque o cano pequeno dentro do cano grande 10 minutos antes da dissecção muscular (Figura 3D).</li>
	<li>Preparação do molde de incorporação: Faça um molde cilíndrico de folha de estanho para cada amostra e preencha-os com o composto de temperatura de corte ideal (OCT).</li>
	<li>Fresco congelado: Mergulhe o músculo na OCT, mantendo-o perpendicular ao composto OCT (Figura 3C). Use um porta-agulha para transferir o molde para o isopentano pré-resfriado. Aguarde 40 s para que a OCT se torne branca e sólida (Figura 3D). NOTA: Certifique-se de que a posição do molde não seja muito baixa. Caso contrário, o isopentano se misturará com a OCT e prejudicará o processo de congelamento muscular. O nível de OCT no molde deve ser comparável à altura da amostra de músculo. Evite uma quantidade excessiva de OCT para garantir um congelamento rápido e eficiente.</li>
	<li>Armazenamento de amostras: Armazene amostras de músculos frescos congelados em placas de 24 poços claramente rotuladas. Separe as amostras imediatamente ou armazene-as a -80 °C para uso a longo prazo.</li>
</ol>3. Análise histológica
<ol><li>Use um criostato para cortar seções de 10 μm de espessura da amostra de músculo em lâminas tratadas com superfície.</li>
	<li>Colocar as lâminas em acetona gelada durante 20 min e secar-as ao ar na hotte durante 20 min.</li>
	<li>Lave as lâminas por 3 x 5 min com solução salina tamponada com fosfato (PBS). NOTA: A partir desta etapa, as lâminas foram mantidas em uma câmara de umidade para evitar a secagem.</li>
	<li>Coloração Sirius Red<ol><li>Prepare a solução de trabalho Sirius Red dissolvendo 0,5 g de pó Sirius Red em 500 mL de ácido pícrico saturado.</li>
		<li>Manchar as lâminas com a solução de trabalho Sirius Red por 1 h em temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave as lâminas por 2 x 5 min com ácido acético a 0,5%.</li>
		<li>Após o processo de coloração, as amostras devem ser desidratadas primeiro em etanol a 95% por 15 s, seguidas de desidratação em etanol anidro por 1 min. A etapa final envolve a montagem da lâmina com bálsamo neutro.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração imuno-histológica<ol><li>Permeabilize as seções com 0,3% de Triton em PBS por 20 min em temperatura ambiente, seguido de uma lavagem com PBS.</li>
		<li>Para coloração Pax7, bloqueie as seções com o reagente fornecido com o kit referenciado; para coloração de laminina e Pdgfrα, bloquear com 5% de albumina de soro bovino (BSA) e 5% de soro de burro em PBS por 1 h em temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar as seções com anticorpos primários contra Pax7, laminina e Pdgfrα durante a noite a 4 ° C, seguido de lavagem com PBS por 3 x 5 min.</li>
		<li>Incubar as seções com anticorpos secundários conjugados com corante fluorescente por 1 h à temperatura ambiente, seguido de lavagem com PBS por 3 x 5 min.</li>
		<li>Incubar com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 3 min em temperatura ambiente, seguido de lavagem com PBS por 3 x 5 min.</li>
		<li>Coloque o meio de montagem na seção, coloque a lamínula por cima e use esmalte para selar a lamínula.</li>
	</ol></li>
</ol>

Estabelecendo um modelo de fibrose muscular orofacial em camundongos por meio de uma lesão por congelamento

<ol><li>Yoshioka, K., Kitajima, Y., Seko, D., Tsuchiya, Y., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+body+region+specificity+in+murine+models+of+muscle+regeneration+and+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">The body region specificity in murine models of muscle regeneration and atrophy.</a> Acta Physiologica. 231 (1), e13553(2021).</li>
<li>Worley, M. L., Patel, K. G., Kilpatrick, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleft+lip+and+palate%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Cleft lip and palate.</a> Clinics in Perinatology. 45 (4), 661-678 (2018).</li>
<li>Pai, B. C. J., Hung, Y. -T., Wang, R. S. H., Lo, L. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+patients+with+complete+unilateral+cleft+lip+and+palate%3A+20-year+follow-up+of+a+treatment+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Outcome of patients with complete unilateral cleft lip and palate: 20-year follow-up of a treatment protocol.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (2), 359e-367e (2019).</li>
<li>Parsaei, Y., Chandler, L., Smetona, J. T., Lopez, J., Steinbacher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aesthetic+repair+of+unilateral+cleft+lip+using+the+modified+inferior+triangle+and+adjunctive+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Aesthetic repair of unilateral cleft lip using the modified inferior triangle and adjunctive techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 149 (1), 70e-73e (2022).</li>
<li>Schubert, F. R., Singh, A. J., Afoyalan, O., Kioussi, C., Dietrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+roll+the+eyes+and+snap+a+bite+-+function%2C+development+and+evolution+of+craniofacial+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+In+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">To roll the eyes and snap a bite - function, development and evolution of craniofacial muscles.</a> Seminars In Cell & Developmental Biology. 91, 31-44 (2019).</li>
<li>Vyas, B., Nandkishore, N., Sambasivan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+cranial+mesoderm%3A+developmental+trajectory+and+evolutionary+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Vertebrate cranial mesoderm: developmental trajectory and evolutionary origin.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (10), 1933-1945 (2020).</li>
<li>Sambasivan, R., Kuratani, S., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eye+on+the+head%3A+the+development+and+evolution+of+craniofacial+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An eye on the head: the development and evolution of craniofacial muscles.</a> Development. 138 (12), 2401-2415 (2011).</li>
<li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Head+muscle+fibro-adipogenic+progenitors+account+for+the+tilted+regeneration+towards+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Head muscle fibro-adipogenic progenitors account for the tilted regeneration towards fibrosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 589, 131-138 (2022).</li>
<li>Pavlath, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+among+muscle+precursor+cells+in+adult+skeletal+muscles+with+differing+regenerative+capacities%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity among muscle precursor cells in adult skeletal muscles with differing regenerative capacities.</a> Developmental Dynamics. 212 (4), 495-508 (1998).</li>
<li>Camacho-Alonso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+lingual+musculature+in+rats+using+myoblasts+over+porcine+bladder+acellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Regeneration of lingual musculature in rats using myoblasts over porcine bladder acellular matrix.</a> Oral Diseases. 27 (6), 1580-1589 (2021).</li>
<li>LeBoff, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinician%27s+guide+to+prevention+and+treatment+of+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporosis+International%22%5BJournal%5D)">The clinician's guide to prevention and treatment of osteoporosis.</a> Osteoporosis International. 33 (10), 2049-2102 (2022).</li>
<li>Julien, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+contribution+of+skeletal+muscle+mesenchymal+progenitors+to+bone+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct contribution of skeletal muscle mesenchymal progenitors to bone repair.</a> Nature Communications. 12 (1), 2860(2021).</li>
<li>Mahdy, M. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol-induced+injury+as+a+new+model+of+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Glycerol-induced injury as a new model of muscle regeneration.</a> Cell and Tissue Research. 374 (2), 233-241 (2018).</li>
<li>Guardiola, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+acute+skeletal+muscle+regeneration+by+cardiotoxin+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Induction of acute skeletal muscle regeneration by cardiotoxin injection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (119), 54515(2017).</li>
<li>Larouche, J. A., Wallace, E. C., Spence, B. D., Buras, E., Aguilar, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+mapping+of+immune+and+stem+cell+dysregulation+after+volumetric+muscle+loss%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal mapping of immune and stem cell dysregulation after volumetric muscle loss.</a> JCI Insight. 8 (7), e162835(2023).</li>
<li>Anderson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+a+critical+size+threshold+for+volumetric+muscle+loss+in+the+mouse+quadriceps%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of a critical size threshold for volumetric muscle loss in the mouse quadriceps.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 25 (2), 59-70 (2019).</li>
<li>Lukjanenko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+disrupts+muscle+stem+cell+function+by+impairing+matricellular+WISP1+secretion+from+fibro-adipogenic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular WISP1 secretion from fibro-adipogenic progenitors.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446.e7 (2019).</li>
<li>Dong, J., Dong, Y., Chen, Z., Mitch, W. E., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathway+to+muscle+fibrosis+depends+on+myostatin+stimulating+the+differentiation+of+fibro%2Fadipogenic+progenitor+cells+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The pathway to muscle fibrosis depends on myostatin stimulating the differentiation of fibro/adipogenic progenitor cells in chronic kidney disease.</a> Kidney International. 91 (1), 119-128 (2017).</li>
<li>Lemos, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nilotinib+reduces+muscle+fibrosis+in+chronic+muscle+injury+by+promoting+TNF-mediated+apoptosis+of+fibro%2Fadipogenic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors.</a> Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).</li>
<li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li>
<li>Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro-adipogenic+progenitors+cross-talk+in+skeletal+muscle%3A+the+social+network%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+In+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: the social network.</a> Frontiers In Physiology. 10, 1074(2019).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Há uma variedade de modelos de lesão para estudar a regeneração muscular esquelética, incluindo o uso de estímulos físicos, químicos e cirúrgicos 10,11,12,13,14,15,16. A cardiotoxina e o cloreto de bário são os dois produtos químicos mais utilizados para iniciar a regeneração muscular<sup cl...

Os músculos orofaciais são críticos nas atividades fisiológicas diárias, como mastigação, fala, respiração e expressão facial1. Nas deformidades orofaciais congênitas, no entanto, esses músculos apresentam alterações atróficas e fibróticas, levando a comprometimento da saúde corporal e da cognição social2. A cirurgia reconstrutiva facial continua sendo o tratamento de primeira linha, mas até 30-70% dos pacientes pós-operatórios ainda sofrem de perda muscular e disfunção muscular 3,4 A falha na regeneração da musculatura orofacial tem sido atribuída a fatores intrínsecos, que não podem ser corrigidos apenas pela cirurgia.
O surgimento da musculatura orofacial é uma novidade evolutiva, acompanhando a complexa cabeça dos vertebrados e o coração compartimentado 5,6. Ao contrário de seus homólogos derivados de somitos dos membros, os músculos orofaciais se originam do arco branquial7. Esses caracteres filogenéticos e ontogenéticos podem predispô-los a comportamentos regenerativos distintos8. Foi relatado que o músculo masseter (MAS) desenvolveu fibrose grave no momento em que o músculo tibial anterior (TA) se regenerou totalmente após exposição à mesma extensão da lesão 1,9. No entanto, o mecanismo subjacente da regeneração permanece pouco compreendido.
Neste estudo, um modelo de lesão por congelamento do músculo masseter de camundongos foi estabelecido para facilitar a investigação da regeneração do músculo orofacial. Escolhemos 14 dias após a lesão como o momento para avaliar o fenótipo da fibrose, pois foi o primeiro momento em que a divergência discernível foi detectável entre dois músculos. A regeneração completa da SAM após a lesão requer pelo menos 40 semanas1. Consistentemente, este estudo revelou uma deposição notável de colágeno após lesão por congelamento de MAS em comparação com a regeneração regular do TA 14 dias após a lesão. Com a ajuda deste modelo, mais estudos mecanísticos de atrofia e fibrose muscular podem ser realizados, o que, por sua vez, ajudará no desenvolvimento de potenciais vias terapêuticas para promover a regeneração do músculo orofacial após a cirurgia.

<table><tbody><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>Shifeng Medical Apparatus and Instrument (Chengdu, Sichuan, China)</td><td>Seringa de 1 ml</td><td>/</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Chron Chemicals</td><td>Aceton</td><td>/</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio de adesão</td><td>Citotest Scientific</td><td>188105</td><td></td></tr>/<tr><td>Animal depilatório</td><td>Phygene Scientific</td><td>PH1877</td><td>/</td></tr><tr><td>BSA (albumina de soro bovino)</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>A8010</td> <td>/</td></tr> <tr><td>DAPI</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>C0065</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Burro anti-cabra Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab150129</td><td>1:200</td></tr><tr><td>soro de burro</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>SL050</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Dry Ice</td><td>Sinrro Technology (Chengdu, Sichuan, China)</td> <td>gelo seco em forma de arroz</td> <td>/</td></tr> <tr><td>IFKine Red Donkey anti-coelho</td><td>Abbkine Empresa científica</td><td>A24421</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Barris de isolamento (grandes)</td> <td>Thermos</td><td>D600</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Barris de isolamento (pequenos)</td> <td>Polar Ware</td><td>250B</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Isoflurano</td><td>RWD Life Technology Company (Shenzhen, Guangdong, China)</td> <td>R510-22</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Isopentano</td><td>MACKLIN</td><td>M813375</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td>1:1000</td></tr><tr>Tecnologia Sinrro de<td>nitrogênio líquido</td><td>(Chengdu, Sichuan, China)</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td>Kit M.O.M</td><td>Vector Laboratories</td><td>BMK-2202</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos&nbsp;</td><td>&nbsp; Dashuo Biological Technology Company(Chengdu, Sichuan, China)</td><td>5 semanas de idade</td><td>/</td></tr><tr><td>meio de montagem</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>S2100</td><td>/</td></tr><tr><td>Nertral balsam</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>G8590</td><td>/</td></tr><tr><td>Pax7</td><td>Estudos de Desenvolvimento Hybridoma Bank&nbsp;</td><td>Pax7</td><td>1:5</td></tr><tr><td>Pdgfra</td><td>R& D systems</td><td>AF1062</td><td>1:40</td></tr><tr><td>Sirus Red Staining Kit</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>G1472</td><td>/</td></tr><tr><td>Instrumentos cirúrgicos (fórceps, tesouras, porta-agulhas, bisturi e sutura)</td><td>Zhuoyue Medical Instrument (Suqian, Jiangsu, China)</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td>Tissue-tek OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>/</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Shanghai Scigrace Biotech</td><td>ABIO-Biofroxx-0006A</td><td>/ </td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Virbac</td><td>Zoletil 50</td><td>/</td></tr></tbody></table>

lesão por congelamento no músculo masseter de camundongo para estabelecer um modelo de fibrose muscular orofacial

Freezing Injury in Mouse Masseter Muscle to Establish an Orofacial Muscle Fibrosis Model

O músculo orofacial constitui um subconjunto de tecido muscular esquelético, com trajetória evolutiva e origem de desenvolvimento distintas. Ao contrário dos músculos dos membros derivados de somitos, os músculos orofaciais se originam dos arcos branquiais, com contribuições exclusivas da crista neural craniana. Um estudo recente revelou que a regeneração também é diferente no grupo muscular orofacial. No entanto, o mecanismo regulatório subjacente ainda precisa ser descoberto. Os modelos atuais de regeneração do músculo esquelético se concentram principalmente nos músculos dos membros e do tronco. Neste protocolo, o gelo seco foi usado para induzir lesão por congelamento no músculo masseter do camundongo e no músculo tibial anterior para criar um modelo de fibrose do músculo orofacial. A dinâmica temporal das células satélites musculares e dos progenitores fibroadipogênicos foi diferente entre os dois músculos, levando a uma regeneração prejudicada das miofibras e deposição excessiva de matriz extracelular. Com a ajuda desse modelo, uma investigação mais profunda sobre a regeneração muscular na área orofacial poderia ser realizada para desenvolver abordagens terapêuticas para pacientes com doenças orofaciais.

A coloração HE e Sirius Red (Figura 4 e Figura Suplementar S1) revelou regeneração muscular completa da AT neste modelo de lesão por congelamento. Em contraste, a SAM exibiu regeneração de miofibras prejudicada e deposição excessiva de matriz extracelular. A histologia do músculo MAS e TA íntegros é mostrada na Figura 4A,B, onde as miofibras estão alinhadas e a área fibrótica apareceu apenas no espaço interstici...

O objetivo deste protocolo é estabelecer um modelo de fibrose muscular orofacial. A comparação da histologia entre camundongos masseter e músculo tibial anterior após lesão por congelamento confirmou a fibrose do músculo masseter. Este modelo facilitará uma investigação mais aprofundada sobre o mecanismo subjacente à fibrose do músculo orofacial.

Lesão por congelamento no músculo masseter de camundongo para estabelecer um modelo de fibrose muscular orofacial

Orofacial muscle constitutes a subset of skeletal muscle tissue, with a distinct evolutionary trajectory and development origin. Unlike the somite-derived ...

Os estudos atuais de regeneração do músculo esquelético se concentram apenas no membro e no músculo do tronco, deixando as características e o mecanismo da regeneração do músculo orofacial amplamente inexplorados. O escopo desta pesquisa é criar um modelo de camundongo mais fácil e confiável para facilitar uma investigação mais aprofundada sobre a regeneração muscular na área orofacial. Desenvolvimentos recentes revisam que os músculos orofaciais constituem um subconjunto único de músculo esquelético com uma trajetória evolutiva distinta e origem de desenvolvimento.Eles também exibem diferentes desempenhos de regeneração em comparação com suas contrapartes de membros. Uma investigação mais profunda sobre a regeneração do músculo orofacial é necessária para descobrir o mecanismo subjacente a essas diferenças marcantes. O estudo apresenta um método rápido e reprodutível para estudar a regeneração da musculatura orofacial.O processo de lesão por meio congelamento levou 20 minutos, e o processo de colheita levou apenas 10 minutos para cada camundongo, e os camundongos podem tolerar bem a lesão sem qualquer comprometimento da locomoção. Uma vez que nosso modelo permite a comparação subsequente entre o músculo masseter fibrótico e o músculo tibial anterior totalmente regenerado a partir dos aspectos de morfologia, histologia e regulação molecular, ele nos serve como um poder para dois para nos aprofundarmos no mecanismo subjacente. Nossa pesquisa futura se concentrará nos efeitos causais entre as alterações das células-tronco musculares residentes e células de nicho múltiplo e, correspondentemente, desenvolveu intervenções para o processo de fibrose do músculo orofacial.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Vários modelos murinos de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) são amplamente utilizados em pesquisas sobre o cérebro experimental. Aqui, demonstramos o modelo de transcraniana permanente distal MCAO que produz enfarte cortical consistente de um tamanho correspondente ao dano imposto pela maioria dos acidentes vasculares cerebrais isquémicos humanos.

Curso de modelagem em Ratos: Coagulação permanente da artéria distal Cerebral Média

Apresentamos um protocolo cirúrgico detalhando como realizar uma axotomia de corte ou esmagamento no nervo facial do camundongo. A axotomia do nervo facial pode ser empregada para estudar a resposta fisiológica à lesão nervosa e testar técnicas terapêuticas.

Axotomia do nervo facial em ratos: um modelo para estudo de resposta motoneuron para Injury

Este protocolo demonstra passo-a-passo detalhes de como extrair o primeiro molar inferior no camundongo. Ele fornece um método alternativo para pesquisadores com foco na cicatrização e regeneração dos ossos maxilares.

O Estabelecimento de um Modelo de Cicatrização de Molares Mandibulares Murinos

Aqui, descrevemos um protocolo para a criação cirúrgica de uma lesão de perda muscular volumétrica (VML) no masseter de ratos, fornecendo um modelo reprodutível e acessível para o estudo de lesões musculares craniofaciais e seu tratamento usando biomateriais como o novo hidrogel.

Modelo de roedores de perda muscular volumétrica masseter para estudo de materiais de bioengenharia

Aqui, apresentamos um protocolo que combina eletroporação in vivo e desnervação do músculo levantador do auro longo do crânio (LAL). Este procedimento permite o estudo do papel potencial das proteínas derivadas do músculo na regeneração da sinapse neuromuscular.

Eletroporação In Vivo Combinada e Reinervação de Curto Prazo do Músculo Esquelético do Elevador do Crânio Longo do Auris

Este protocolo apresenta um método abrangente e eficiente para análise do reparo ósseo mandibular. Descrevemos uma técnica reprodutível para fratura mandibular não estabilizada em modelo de camundongo, permitindo a análise do processo de reparo ósseo endocondral com mínimo dano tecidual e perda óssea.

Técnica menos invasiva para fratura mandibular não estabilizada em modelos de camundongos

As lesões de perda muscular volumétrica (VML) excedem a capacidade regenerativa endógena, resultando em déficits funcionais permanentes. A pesquisa atual do VML se concentra principalmente nos músculos dos membros e troncos. Para estender os estudos mecanísticos do VML aos músculos craniofaciais, este artigo descreve um método in vivo para avaliação longitudinal da função do músculo masseter pré e pós-lesão do VML.

Avaliação funcional in vivo do músculo masseter de rato após a criação cirúrgica de uma lesão de perda muscular volumétrica (VML)

Modelos animais ortotópico de câncer de ovário replicar melhor as doenças humanas e, portanto, melhorar nosso entendimento sobre a progressão do câncer e da resposta do tumor à terapia. Um modelo de camundongo recebe uma injeção de intrabursal luciferase células que expressam tumor de ovário. O tratamento é administrado através de gavagem oral. O crescimento do tumor é monitorado...

In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Nós descrevemos um método para medir diretamente a força muscular, a força muscular, a cinética contráteis e fatigabilidade de músculos esqueléticos isolados em...

Avaliação ex vivo de Fatigabilidade Contratilidade e Alternans em músculos esqueléticos isolados

Aprenda a criar um modelo de lesão por congelamento no músculo masseter de camundongo para estudar regeneração e fibrose muscular orofacial. Este método permite comparar mecanismos distintos entre músculos faciais e de membros.

Lesão por congelamento no músculo masseter de camundongo para estabelecer um modelo de fibrose muscular orofacial

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